高原粳稻群體遺傳結(jié)構(gòu)及其農(nóng)藝性狀與SSR標記的關(guān)聯(lián)分析

世 榮，劉吉新，陳于敏，李榮波，鄭 曄，張其鋼，吳志剛，劉慰華，趙國珍

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，昆明 650205；2.昆明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，昆明 650031；3.臨滄市種子管理站，云南 臨滄 677000；4.陸良縣種子公司，云南 陸良 655600)

【研究意義】水稻是世界上重要的糧食作物，也是中國和云南省最重要的口糧作物，以大米為主食的人口超過60%。由于云南粳稻區(qū)地處低緯高原，氣候復(fù)雜，外引粳稻品種大多不能直接在生產(chǎn)上種植，須靠自育解決云南的粳稻品種問題[1]。據(jù)統(tǒng)計，1983年以來，云南省各育種單位培育出通過審定的常規(guī)粳稻品種有200余個，這些品種的大面積推廣應(yīng)用對保障國家糧食安全具有非常重要的意義[2]。但品種選育以常規(guī)方法為主，盲目性較大，育種效率偏低，育成品種的遺傳基礎(chǔ)較窄[3]。分子標記輔助選擇(marker-assisted selection，MAS)具有可預(yù)測性和高效性，可加快育種進程[4]。【前人研究進展】微衛(wèi)星標記亦稱簡單序列重復(fù)(simple sequence repeats，SSR)具有多態(tài)性高、數(shù)量豐富、重復(fù)性好、呈共顯性、分布廣泛等優(yōu)點，特別是能很好的鑒定出親緣關(guān)系較近品種的遺傳差異[5]，已廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜的構(gòu)建[6-7]和分子標記輔助選擇育種等[8-9]。水稻重要的農(nóng)藝性狀大多數(shù)是由多基因控制的數(shù)量性狀，受基因和環(huán)境共同調(diào)控，目前，研究數(shù)量性狀的主要方法是QTL 定位和全基因組關(guān)聯(lián)分析，而QTL定位受多種因素影響，構(gòu)建理想的作圖群體還需要開展大量工作。關(guān)聯(lián)分析是以長期重組后保留的等位基因或位點間的連鎖不平衡 (linkage disequilibrium，LD)為基礎(chǔ)，將目標表型性狀的多樣性與位點的多態(tài)性相結(jié)合進行分析，確定不同品種攜帶的等位基因以及對目標性狀的貢獻[10]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于水稻[11]、玉米[12]、大豆[13]、花生[14]和小麥[15]等農(nóng)作物?！颈狙芯康那腥朦c】株高、抽穗期、分蘗力、穗長、穗粒數(shù)、結(jié)實率和千粒重等農(nóng)藝性狀是水稻育種的主要選擇標準，常規(guī)育種主要依據(jù)親本的農(nóng)藝性狀進行雜交配組，較少考慮親本的遺傳差異，導(dǎo)致育成品種的遺傳基礎(chǔ)日趨狹窄。關(guān)聯(lián)分析利用的是自然變異，減少了構(gòu)建作圖群體的工作，可較準確地檢測親本的遺傳變異，只需尋找出與相關(guān)農(nóng)藝性狀關(guān)聯(lián)的SSR標記，為MAS育種奠定相關(guān)工作基礎(chǔ)。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究在對81個高原粳稻主栽品種遺傳多樣性分析[3]的基礎(chǔ)上分析群體遺傳結(jié)構(gòu)，明確81個品種間遺傳背景的差異，同時，在2種環(huán)境下種植，尋找與株高、播抽期、有效穗、穗長、穗粒數(shù)、結(jié)實率和千粒重等農(nóng)藝性狀相關(guān)聯(lián)的SSR標記，為水稻新品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗材料81份，均由云南省育種單位培育，并在高原粳稻區(qū)作為主栽品種推廣過，或是目前生產(chǎn)上的主栽品種，詳見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計和農(nóng)藝性狀測定 為了減少種植環(huán)境對農(nóng)藝性狀的影響，設(shè)置2年2個海拔條件下種植。2017和2018年，81個品種分別同時種植在海拔1900 m的云南省昆明市嵩明縣和海拔2100 m 的曲靖市馬龍縣。每個品種栽2行，每行20株，株行距為10 cm×20 cm，3次重復(fù)，采用當?shù)爻Ｒ?guī)方法進行肥水管理。適時調(diào)查抽穗期、成熟時調(diào)查株高、每個品種選取具有代表性的5個單株進行考種，考察穗長、穗數(shù)、穗總粒數(shù)、結(jié)實率、千粒重等性狀，取平均值。

表1 供試材料來源

1.2.2 DNA提取和SSR標記檢測 參照中國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR 標記法》(NY/T 1433—2014)的方法，取新鮮嫩葉，用改良的CTAB 法提取DNA并利用該標準推薦的SSR引物進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系總量為15 μL：含 10×緩沖液2.0 μL、2.5 mmol/L dNTP 1.6 μL 、正反向引物各0.4 μL 5 μmol/L 、Taq聚合酶(5 U/μL)0.1 μL 、模板DNA 30 ng及超純水9.5 μL。反應(yīng)程序為模板DNA在94 ℃下預(yù)變性5 min， 94 ℃下變性1 min，55 ℃下退火1 min(RM3331為50 ℃；RM167和RM119為67 ℃)，72 ℃下延伸 2 min，35個循環(huán)后，相同溫度下延伸 5 min，放4 ℃冰箱保存。在4%的非變性聚丙烯酰胺凝膠中進行恒壓電泳PCR產(chǎn)物，最后銀染檢驗。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 群體結(jié)構(gòu)分析采用軟件Structure 2.2,通過計算群體中各品種歸屬于某亞群的概率進行亞群劃分，即計算相應(yīng)品種的Q值(第i個品種的基因組變異來源于第K個群體的概率)。設(shè)置的亞群數(shù)K值范圍為1～10，進行5次迭代，運行時將MCMC (Markov Chain Monte Carlo)的不作數(shù)迭代LBP(Length of Burn-in Period)設(shè)為10萬次。根據(jù)所計算的Q值，群體內(nèi)單個材料歸屬為特定亞群的概率大于60%的劃分到相應(yīng)亞群中。由于供試材料存在明顯的親緣關(guān)系，因此采用Tassel 2.1 軟件混合線性模型(MLM)對SSR標記與農(nóng)藝性狀進行關(guān)聯(lián)分析，以各品種Q+K值作為協(xié)變量進行回歸分析，采用表型變異的數(shù)據(jù)對標記進行回歸分析及關(guān)聯(lián)作圖，計算出標記對各表型變異的解釋率。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試品種的農(nóng)藝性狀及其相關(guān)性分析

由表2可知，除播抽期外，所有性狀的平均值海拔較低的嵩明點大于海拔較高的馬龍點，說明試驗中調(diào)查的農(nóng)藝性狀在2個試驗點種植均具有較好的穩(wěn)定性。方差分析結(jié)果表明，所有農(nóng)藝性狀在品種間均存在極顯著差異，表明在該群體中的相關(guān)農(nóng)藝性狀遺傳變異豐富，但變異程度不同性狀差異明顯，差異最大的性狀是馬龍點的穗實粒數(shù)，變異系數(shù)為29.2%，株高、播抽期和千粒重2個試點的變異均較小，變異系數(shù)小于10%。相關(guān)分析表明(表3)，株高與播抽期呈極顯著負相關(guān)，與穗長和穗實粒數(shù)呈極顯著正相關(guān)，與其余性狀相關(guān)性不顯著；穗實粒數(shù)除與株高呈極顯著正相關(guān)外，還分別與穗長和結(jié)實率呈顯著和極顯著正相關(guān)，并與穗數(shù)呈極顯著負相關(guān)；千粒重與穗實粒數(shù)和結(jié)實率呈顯著負相關(guān)，與其余性狀的相關(guān)性不顯著。

2.2 供試材料的系譜分析

根據(jù)供試品種的雜交組合繪制系譜圖，從圖1可見，供試品種的親本主要來源于滇榆1號、西南175和轟早生。其中滇榆1號是大理市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站培育的常規(guī)粳稻品種，雜交組合為紫米/科情3號；西南175是西南農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所1955年從臺灣引進的粳稻中系選出的常規(guī)粳稻品種；轟早生是云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院1982年從日本引進的常規(guī)粳稻品種。其中，滇榆1號和西南175曾經(jīng)是云南高原粳稻區(qū)多年大面積推廣應(yīng)用的主栽品種，也是該稻區(qū)最主要的骨干親本，由這2個品種衍生的合系34號和合系41號又衍生出一系列的品種。除會粳16號外，其余品種幾乎都與以上3個骨干親本具有親緣關(guān)系。

2.3 供試材料的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

48對SSR標記在81個供試品種中具有多態(tài)性的引物有37對，檢測出的等位基因共139個，平均每對引物檢測出等位基因2～10個，平均3.76個。利用以上結(jié)果進行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)供試品種的等位變異頻率特征類型數(shù)K呈持續(xù)增大，因此參照 Evanno 等[20]利用△K來確定K值。圖2可知，K=2時，△K值最大，因此可將81個供試品種分成2個亞群，并繪制供試品種的群體結(jié)構(gòu)圖(圖3)。參照蘇一鈞等[21]的研究，當某一品種的遺傳組分(Q值)≥0.6，表明該品種的遺傳背景相對較單一，而當Q值<0.6，表明該品種的遺傳背景較復(fù)雜。分析81個供試材料的Q值,發(fā)現(xiàn)僅有銀光、靖粳優(yōu)1號和靖粳16號3個品種的Q值<0.6,說明這3個品種的遺傳組成較為復(fù)雜，沒有明確歸屬于哪個類群，形成一個混合群體，而其余的78個品種的Q值≥0.6，可以劃在某一類群中，第1亞群(黑色部分)有28個品種，其中Q值>0.8的有21個品種；第2亞群(灰色部分)有50個品種，Q值全部大于0.8。

2.4 SSR標記與農(nóng)藝性狀的關(guān)聯(lián)分析

群體結(jié)構(gòu)分析表明，81個供試品種由2個亞群和1個混合群體組成，采用回歸分析方法，將各品種相應(yīng)的Q值作為協(xié)變量，分析各農(nóng)藝性狀的表型和基因型的變異，找出與各農(nóng)藝性狀相關(guān)聯(lián)的SSR標記和效應(yīng)大小(表型變異的解釋率)。由表4可知，在P<0.05水平，2種環(huán)境下均檢測出RM1195和RM209分別與株高和千粒重相關(guān)聯(lián)，這2個標記分別位于第1和11號染色體上。RM490、RM583、RM267、RM590和RM332與結(jié)實率相關(guān)聯(lián)，這些標記對表型變異的解釋率在0.074～0.352，RM490和RM583位于1號染色體上，RM267、RM590和RM332分別位于第5、10和11號染色體上。而在P<0.001水平，只有11號染色體上RM332與結(jié)實率相關(guān)聯(lián)。

圖1 供試材料的系譜圖Fig.1 The pedigree of tested rice accessions

表2 供試材料的主要農(nóng)藝性狀表現(xiàn)

表3 供試材料的農(nóng)藝性狀相關(guān)性

圖2 每個K值對應(yīng)的ΔK值折線圖Fig.2 ΔK with the change of values

3 討 論

3.1 云南高原粳稻親緣關(guān)系和群體結(jié)構(gòu)

供試的81個品種包含了云南省主要從事常規(guī)粳稻育種單位選育的品種，代表了云南高原粳稻區(qū)生產(chǎn)上的主栽品種情況，系譜分析表明，這些品種主要來源于滇榆1號及其衍生品種合系34號和合系41號，雖然在品種選育過程中增加了一些外引品種，如中丹2號、城堡1號、越光、銀條粳以及普通野生稻[22]等，但遺傳基礎(chǔ)仍然較窄[3]。群體結(jié)構(gòu)分析表明，76個品種的遺傳背景相對比較單一，分為2個亞群，大部分品種屬于第2亞群，而且第2亞群中的所有品種Q值均大于0.8，說明這些品種的遺傳組成比較單一。這與管俊嬌等[16]利用30對SSR標記分析了163份云南粳稻育成品種的群體遺傳結(jié)構(gòu)結(jié)果基本相同。云南是世界上最大的稻種遺傳和生態(tài)多樣性中心之一[17-18]，稻種資源遺傳多樣性豐富，但大多數(shù)稻種資源表現(xiàn)植株較高、生育期較長等[19-20]，難以在育種中改良利用，品種選育依賴少數(shù)骨干親本的現(xiàn)象較突出[21]，導(dǎo)致育成的水稻品種遺傳基礎(chǔ)狹窄。高原粳稻區(qū)地理氣候復(fù)雜，生產(chǎn)上需要的品種類型多，從事常規(guī)粳稻育種的單位也多，各育種單位應(yīng)根據(jù)當?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境和育種目標，適當引進利用新種質(zhì)，擴大現(xiàn)有品種的遺傳基礎(chǔ)，選育突破性品種，從而推動高原粳稻的發(fā)展。

表4 與各農(nóng)藝性狀相關(guān)聯(lián)的分子標記和表型解釋率

圖3 供試品種的群體結(jié)構(gòu)Fig.3 Population structure of tested rice accessions

3.2 各農(nóng)藝性狀與SSR標記的關(guān)聯(lián)分析

關(guān)聯(lián)分析的原理是通過掃描不同種質(zhì)資源的全基因組，根據(jù)基因組的遺傳變異，把基因變異與表型性狀關(guān)聯(lián)起來[22-23]。本研究中，遺傳相似系數(shù)為0.62時，81個品種劃分為4個類群[3]，分別包括4、5、12和60個品種，而群體結(jié)構(gòu)分析表明，81個品種分為2個亞群和1個混合群體，分別包括28、50和3個品種，2種分析結(jié)果存在差異。管俊嬌等[16]對163份云南粳稻品種進行遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，按遺傳相似系數(shù)聚為4類，群體結(jié)構(gòu)分析則為2個亞群。用同樣的分析方法，王復(fù)標等[11]把190份水稻材料聚為2類，而群體結(jié)構(gòu)分析則為3個亞群，賴勇等[15]把113份大麥親本材料分別聚為5類和4個亞群。導(dǎo)致這種差異的主要原因是前者反映的是品種間親緣關(guān)系遠近，是根據(jù)品種間的遺傳相似系數(shù)進行聚類，而后者是基于亞群是否達到哈德溫伯格平衡的數(shù)學(xué)模型而劃分。群體結(jié)構(gòu)對關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的影響較大，亞群的混合會導(dǎo)致群體的LD強度增強，形成偽關(guān)聯(lián)。本研究采用軟件Structure 分析，校正了81個品種中存在的群體結(jié)構(gòu)，可避免人為因素影響亞群的劃分[24]，提高了關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的準確性。

本研究采用MLM模型分析，檢測到7個標記與農(nóng)藝性狀相關(guān)聯(lián)，其中，RM490、RM583、RM267、RM590、RM332都與結(jié)實率相關(guān)聯(lián)，而在P<0.001水平，只有RM332與結(jié)實率相關(guān)聯(lián)。眾多研究結(jié)果表明，水稻結(jié)實率與孕穗期耐冷性呈極顯著正相關(guān)[25-27]，本研究中的結(jié)實率是在2種海拔條件下種植獲得的，種植在海拔較高的馬龍點(2100 m)比種植在海拔較低的嵩明點 (1900 m)，2年平均結(jié)實率低9.1%，證實了水稻結(jié)實率與孕穗期耐冷性呈正相關(guān)，因此在云南高原粳稻育種中可以利用上述檢測出來的分子標記進行水稻孕穗期耐冷性選擇。但這些分子標記與前人的研究結(jié)果[28-29]是否位于相同區(qū)段，還需進一步驗證。

4 結(jié) 論

81個品種在2種不同海拔條件下種植，均檢測出RM1195與株高，RM209與千粒重相關(guān)聯(lián)，RM267、RM332、RM490、RM583和RM590與結(jié)實率相關(guān)聯(lián)，各標記對表型變異的解釋率在0.074～0.352。這些SSR標記可為分子標記輔助育種提供理論依據(jù)。