基于高通量絕對定量對不同樹齡茶樹土壤細(xì)菌群落多樣性的研究

浦 滇，石 明，周雪孟，張仲富，藍(lán)增全

(1．西南林業(yè)大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，昆明 650224；3.西南林業(yè)大學(xué)濕地學(xué)院，昆明 650224；4.西南林業(yè)大學(xué)綠色發(fā)展研究院，昆明 650224)

【研究意義】茶樹是多年生木本植物，在中國作為一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，其樹齡可達(dá)百年以上。但大多茶園在植茶20年左右其經(jīng)濟(jì)效益開始下滑，其主要原因是茶樹土壤質(zhì)量下降導(dǎo)致的茶樹產(chǎn)量及品質(zhì)下降[1-2]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究表明，土壤微生物種群、數(shù)量、活性和養(yǎng)分是影響茶樹生長和茶葉品質(zhì)的關(guān)鍵因素[3]。土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的核心，參與了土壤養(yǎng)分循環(huán)、有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)換、土壤肥力形成等[4-7]。細(xì)菌是土壤中數(shù)量最多、分布最廣的微生物，占土壤微生物總數(shù)的70%～90%[8]。在土壤微生物的研究中最常用的是經(jīng)典分離培養(yǎng)法和稀釋平板法，但土壤微生物數(shù)量巨大、種類繁多，每克土壤中約含數(shù)萬個(gè)物種，而其中僅有1%的物種可以分離培養(yǎng)，傳統(tǒng)的方法遺漏了土壤中的絕大部分微生物，難以反映土壤微生物的群落豐度及其作用機(jī)制[9]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，如IIIumina MiSeq/Hiseq測序，可以很容易的獲得樣本中微生物群落的相對豐度信息[10-14]。近年來，高通量測序的方法也被廣泛用于茶園土壤微生物群落的研究中[2,15-19]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】常規(guī)的高通量測序只能檢測微生物群落的相對豐度，由于相對豐度以總樣本的比例表示，用相對豐度來反映種群的實(shí)際豐度可靠性不足[10,20]，高通量絕對定量的方法較好的解決了環(huán)境樣本中微生物絕對定量的問題，同時(shí)還可以得到環(huán)境樣本中的物種組成信息。目前，高通量絕對定量方法主要有多方法聯(lián)合和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)法。多法連用原理是將流式細(xì)胞儀、qPCR、PLFA等方法的生物量測定結(jié)果與高通量測序結(jié)果相結(jié)合后進(jìn)行計(jì)算，多法連用應(yīng)考慮多種方法獲取數(shù)據(jù)的一致性，否則會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性[21-25]。內(nèi)標(biāo)法的第一種方法是向樣品DNA中添加一定量已知拷貝數(shù)的外源已知菌株或DNA后進(jìn)行常規(guī)擴(kuò)增子測序，最后通過內(nèi)標(biāo)菌株的絕對數(shù)量及擴(kuò)增獲得的相對豐度，可以計(jì)算出樣本中的微生物絕對豐度，內(nèi)標(biāo)菌株是自然界中已知存在的，測試樣本中可能會(huì)包含，且只有單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，沒有引入標(biāo)準(zhǔn)曲線，可靠性不易驗(yàn)證[26]。第二種則是添加一定量spike-in standards人工合成序列進(jìn)行16S擴(kuò)增子文庫構(gòu)建、測序，再根據(jù)spike-in standards 的16S擴(kuò)增子reads數(shù)及其絕對拷貝數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品中OUT/ASV代表序列對應(yīng)物種16S rRNA基因絕對拷貝數(shù)，該方法添加的序列為人工合成，與自然界中微生物序列相比具有特異性，從而避免了樣本中出現(xiàn)類似的片段，使得計(jì)算、分析更加準(zhǔn)確[27]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用高通量絕對定量測序技術(shù)，對樹齡10(10yrs)、40(40yrs)、80(80yrs)和100年以上(100yrs)的茶樹土壤和相鄰沒有茶樹種植歷史的林地(0yrs)土壤進(jìn)行研究，分析隨著茶樹樹齡的變化，土壤細(xì)菌群落的多樣性和絕對豐度的變化趨勢，為改善茶樹土壤環(huán)境提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗(yàn)地位于云南省臨滄市雙江縣勐庫鎮(zhèn)冰島村(23°47′N，99°54′E)。該村屬亞熱帶季風(fēng)氣候，海拔1400～2500 m，年平均氣溫18～20 ℃，年降雨量約1800 mm，土壤類型為黃棕壤。茶樹種植以勐庫大葉種為主，屬山茶屬(Camellia)普洱茶種(Camelliasinensisvar.assamica)。據(jù)史料《雙江傣族簡史》記載以及雙江縣人民政府派員考證，該村500年以上樹齡的古茶樹尚存30余株(1980年)，根據(jù)2002年的調(diào)查，基部直徑0.3～0.6 m的古茶樹近2000棵[28]。選取有明確種植歷史樹齡為10年(10yrs)、40年(40yrs)、80年(80yrs)和100年以上(100yrs)的茶樹及周圍沒有茶樹種植歷史的林地(0yrs)表層土壤作為研究對象。茶園具有相同的農(nóng)業(yè)管理措施，2015—2020年均未施肥，每年3和8月采用機(jī)械除草，11月對茶樹進(jìn)行修剪，修剪后的枝葉、雜草留在茶園。

1.2 樣品采集與處理

2020年8月在20 m×20 m的樣方內(nèi)，按照“S”型隨機(jī)多點(diǎn)混合取樣，去除茶樹樹冠下的枯枝落葉后，用土鉆隨機(jī)采集4～6個(gè)點(diǎn)0～20 cm的表層土壤混勻后作為一個(gè)樣品，每個(gè)樣地3個(gè)重復(fù)。采集的土壤一部分放入土壤采樣瓶后立馬放入液氮罐，用于提取土壤微生物的總DNA；另一部分裝入無菌密封袋帶回實(shí)驗(yàn)室自然風(fēng)干，用于測量土壤理化性質(zhì)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 土壤理化成分測定 土壤pH采用(水土比1∶2.5)電位法；土壤有機(jī)質(zhì)(SOM)采用重鉻酸鉀氧化—外加熱法；總氮(TN)采用半微量凱氏定氮法；土壤總磷(TP)采用酸溶—鉬銻抗比色法；有效磷(AP)采用氟化銨—鹽酸浸提比色法；有效氮(AN)采用堿解—擴(kuò)散法；總鉀(TK)采用堿溶—火焰光度計(jì)法。

1.3.2 土壤微生物DNA提取 土壤細(xì)菌DNA采用Powersoil?DNA isolation kit提取，具體提取步驟參照說明書。

1.3.3 土壤細(xì)菌序列的擴(kuò)增及測序 DNA樣品委托上海天昊生物科技有限公司進(jìn)行擴(kuò)增和測序。首先用瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA完整性，NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)檢測基因組DNA質(zhì)量，選擇合格的樣品(電泳條帶清晰可見，無明顯降解；濃度≥20 ng/μL，總量≥500 ng，OD260/280=1.8～2.0)使用上游引物：Illumina adapter sequence 1+ GTGCCAGCMGCCGCGG和下游引物：Illumina adapter sequence 2+ CCGTCAATTCMTTTRAGTTT對細(xì)菌16S rRNA基因V4～V5區(qū)進(jìn)行高保真PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)，同時(shí)以標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌基因組DNA mix作為陽性對照。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，DNA質(zhì)控合格且擴(kuò)增成功的樣本才為合格。檢測合格后的樣本按照J(rèn)iang等[27]的方法對目標(biāo)區(qū)域檢測擴(kuò)增和添加特異性標(biāo)簽序列。利用Qubit對文庫進(jìn)行精確定量后，按相應(yīng)比例(摩爾比)混合樣本?；鞓雍蟮奈膸焱ㄟ^Agilent 2100 Bioanalyzer檢測測序文庫插入片段的大小，確認(rèn)在120～200 bp無非特異性擴(kuò)增，并準(zhǔn)確定量測序文庫濃度。采用Miseq平臺(tái)，2×250 bp的雙端測序策略對文庫進(jìn)行測序，后續(xù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

由于構(gòu)建文庫的需要，原始測序數(shù)據(jù)中包含了一些人工添加物，使用QIIME2軟件的cutadapt插件去除后再用 DADA2插件對數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量過濾，降噪，拼接及去嵌合體(默認(rèn)參數(shù)：p-max-ee=2.0，p-trunc-q=2，p-chimera-method=consensus，每個(gè)樣本有效序列不少于15萬條)，質(zhì)控后通過該插件直接生成擴(kuò)增序列變體[29](Amplicon sequence variant，ASV；類似于操作分類單元，Operational taxonomic units，OTU)；根據(jù)每個(gè)樣本spike-in序列制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算每個(gè)樣本中的ASV的絕對拷貝數(shù)(計(jì)算公式：單位樣本中ASV絕對拷貝數(shù) = (ASV絕對拷貝數(shù)×樣品DNA提取量) /測序模板DNA量/抽提DNA所用樣品量)；最后，按照0.8的置信度進(jìn)行物種注釋。用R軟件(v3.5.1)的ggplot2包(v3.3.0)、vegan包(v2.5.6)、pheatmap包(v1.0.12)等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和數(shù)據(jù)可視化；用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件對土壤理化性質(zhì)進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)分析

由表1可知，不同樹齡的茶樹土壤和林地土壤的理化性質(zhì)隨樹齡的變化呈不同的變化規(guī)律，且差異顯著(P<0.05)?？偟?TN)、有效氮(AN)含量隨茶樹樹齡的增加呈先減小后增加的趨勢；總磷(TP)含量隨茶樹樹齡的增加而減小，在林地(0yrs)土壤和樹齡40年(40yrs)的茶樹土壤差異不顯著；有效磷(AP)含量隨茶樹樹齡的增加有減小的趨勢，但在40(40yrs)、80(80yrs)和100以上(100yrs)的茶樹土壤和林地(0yrs)土壤中差異不顯著；總鉀(TK)含量在10年(10yrs)的茶樹土壤中最低，林地(0yrs)、40(40yrs)、80(80yrs)和100年以上(100yrs)的茶樹土壤之間差異不顯著；土壤有機(jī)質(zhì)(SOM)含量隨茶樹樹齡的增加而增加，茶樹樹齡40(40yrs)和80年(80yrs)的差異不顯著，林地(0yrs)土壤和100年以上(100yrs)的茶樹土壤中含量最高，但差異不顯著；茶樹土壤pH隨著茶樹樹齡的增加而降低，且均顯著低于林地(0yrs)土壤。

2.2 土壤細(xì)菌群落多樣性

為了得到高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)，以提高后續(xù)生物信息分析準(zhǔn)確性，使用QIIME2軟件的DADA2插件對數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量過濾，降噪，拼接及去嵌合體，5個(gè)樣本共得到921 751條序列。稀釋性曲線見圖1(左)，曲線隨著抽取序列數(shù)目的增加而趨于平緩，從表2中可以看出，所有樣本覆蓋率都在99%以上，表明這些數(shù)據(jù)可以真實(shí)有效的反應(yīng)樣本環(huán)境的細(xì)菌多樣性。Chao1和ACE指數(shù)的變化趨勢與Observed一致，表現(xiàn)為10yrs>0yrs>40yrs>80yrs>100yrs。10yrs的Observed、Chao1、ACE和Shannon指數(shù)最高，并且隨樹齡的增加而減小，表明10yrs的土壤細(xì)菌群落多樣性最高，并且隨著樹齡的增加土壤細(xì)菌群落多樣性呈下降的趨勢。圖1的稀釋曲線和Rank-abundance曲線得出的結(jié)論與此一致。

2.3 土壤細(xì)菌群落組成和絕對豐度

細(xì)菌在門水平上(圖2)，共檢測出43個(gè)門，其中相對豐度大于1%的共19個(gè)。分別為Acidobacteria(酸桿菌門，23.71%～39.70%)、Proteobacteria(變形菌門，17.20%～24.98%)、Chloroflexi(綠彎菌門，5.33%～13.67%)、Planctomycetes(浮霉菌門，4.99%～8.59%)、Actinobacteria(放線菌門，3.57%～9.91%)、Myxococcous(粘球菌門，2.57%～7.65%)、Gemmatimonadetes(芽單胞菌門，2.41%～5.04%)等菌門。從圖2可以看出，在細(xì)菌總量絕對豐度層面，隨著樹齡的增加細(xì)菌的總絕對豐度呈先增加后減小的趨勢，40yrs的土壤細(xì)菌絕對豐度最高且高于林地，40年后細(xì)菌群落總絕對豐度開始下降，80yrs的土壤細(xì)菌總絕對豐度與林地相比沒有明顯差異，表現(xiàn)為40yrs>0yrs>80yrs>10yrs>100yrs。

表1 茶樹和林地土壤理化性質(zhì)

圖1 稀釋曲線(左)和Rank-abundance曲線(右)Fig.1 Rarefaction curve(left)and Rank-abundance curve(right)

表2 不同樹齡茶樹土壤和林地土壤細(xì)菌多樣性比較

圖2 在門水平林地及不同樹齡茶樹的土壤細(xì)菌群落組成Fig.2 Soil bacterial community composition of forest land and tea trees with different ages at phylum level

圖3 林地及不同樹齡茶樹土壤細(xì)菌群落共有和獨(dú)有ASV韋恩圖Fig.3 Venn diagram of unique and shared ASVs of the soil bacterial community in forest land and tea trees with different ages

圖4 門水平上林地及不同樹齡茶樹土壤細(xì)菌的絕對豐度聚類熱圖Fig.4 Clustering heatmap of absolute abundance of soil bacterial community in forest land and tea trees with different ages at phylum level

此外，豐度最高的Acidobacteria(酸桿菌門)，植茶后的相對豐度高于林地，且隨著植茶年限的增加絕對豐度呈上升的趨勢，80和100yrs的相對豐度差異較小(80yrs，39.70%；100yrs，39.60%)，但絕對豐度隨著樹齡的增加呈先增加后減小的趨勢，40和100yrs的絕對豐度差異較小。

為進(jìn)一步揭示林地和不同樹齡茶樹的土壤細(xì)菌群落的特性與共性，5個(gè)樣品共檢測出16 269個(gè)ASV，基于ASV豐度繪制的韋恩圖(圖3)中可以看出，5個(gè)樣本共有248個(gè)ASV，10yrs的茶樹土壤細(xì)菌特有的ASV個(gè)數(shù)最高(2304個(gè))，高于林地和其他樹齡的土壤細(xì)菌，植茶后特有的ASV個(gè)數(shù)隨著植茶年限的增加而減小。

為了能夠更明顯和準(zhǔn)確的反映出5個(gè)樣本的物種組成相似性和差異性，根據(jù)檢測出的43個(gè)門水平上的細(xì)菌絕對豐度和不同樣本間的距離繪制了細(xì)菌門水平的熱圖(圖4)。隨著樹齡的增加土壤細(xì)菌群落絕對豐度發(fā)生變化，0和10yrs的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)較為相似，40和80yrs的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)更為相似，而100yrs的土壤細(xì)菌群落與其他樹齡茶樹土壤和林地土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。

圖5 林地及不同樹齡茶樹土壤細(xì)菌群落的主坐標(biāo)分析Fig.5 Principal coordinates analysis (PCoA) of soil bacterial community in forest land and tea trees with different ages

藍(lán)色越深表示負(fù)相關(guān)性越強(qiáng)，橙色越深表示正相關(guān)性越強(qiáng)。方格上的*和**分別表示0.05和0.01水平上差異顯著The darker the blue, the stronger the negative correlation, and the darker the orange, the stronger the positive correlation. The * and * *on the grid indicated significance at 0.05 and 0.01 level，respectively圖6 屬水平上土壤細(xì)菌群落與理化因子相關(guān)性熱圖Fig.6 Thermogram of correlation between soil bacterial community and physical and chemical factors at genus level

基于5個(gè)樣本的ASV代表序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)合代表序列進(jìn)化關(guān)系，計(jì)算樣本間的距離進(jìn)行了PCoA(主坐標(biāo)分析)分析，結(jié)果表明，不同樣本的土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu)組成具有一定的相似性和差異性，與上述聚類熱圖(圖4)的分析結(jié)果一致。

2.4 土壤細(xì)菌群落與土壤理化因子的關(guān)系

對屬水平上的土壤細(xì)菌與土壤理化因子間進(jìn)行Spearman相關(guān)性熱圖分析(圖6)，結(jié)果顯示，土壤pH、總氮(TN)、總鉀(TK)、有效氮(AN)、有效磷(AP)對土壤細(xì)菌群落影響較大。土壤pH與Sumerlaea、Solirubrobacter(土壤紅色桿形菌)、Haliangium等28屬的細(xì)菌呈正相關(guān)，與Methanomethyliaceae等2屬呈負(fù)相關(guān)；總鉀(TK)與Bdellovibrio(蛭弧菌屬)等9屬呈正相關(guān)，與Lactobacillus(乳桿菌屬)等6屬呈負(fù)相關(guān)；有效磷(AP)和總磷(TP)與Ferruginibacter等5屬呈正相關(guān)，與Acinetobacter(不動(dòng)細(xì)菌屬)等4屬呈負(fù)相關(guān)；水解性氮(AN)與Shimazuella等6屬呈正相關(guān)，與Bdellovibrio等7屬呈負(fù)相關(guān)；總氮(TN)與Dactylosporangium(孢囊菌屬)等2屬呈正相關(guān)，與Acidiphilium(嗜酸菌屬)等兩屬呈負(fù)相關(guān)；土壤有機(jī)質(zhì)(SOM)與Puia等2屬呈正相關(guān)，與Flavisolibacter(黃色土源菌屬)等5屬呈負(fù)相關(guān)。

3 討 論

茶樹是一種喜酸植物，在pH為4.0～6.5的土壤中能夠正常生長，最適宜pH為4.5～5.5，當(dāng)pH低于4.0時(shí)茶樹的生長會(huì)受到限制，從而影響茶葉產(chǎn)量與品質(zhì)[30]。已有大量研究表明，植茶后茶園土壤逐漸酸化，并且土壤pH隨著樹齡的增加而減小[16,31-34]。本研究表明，與林地相比，植茶后土壤pH顯著降低，并隨樹齡的增加而減小，與前人研究有相同結(jié)果。張小琴等[35]對貴州植茶年限分別為1～2、6～10、15～20、25～30年的茶園土壤研究，土壤有機(jī)質(zhì)(SOM)、總氮(TN)含量隨植茶年限的增加而增加，李貞霞等[36]對河南植茶10、20、30、40年的土壤研究表明，土壤有機(jī)質(zhì)(SOM)、有效氮(AN)含量隨植茶年限的增加而增加。通過研究顯示植茶后SOM含量隨樹齡增加而增加，總氮(TN)和有效氮(AN)含量40yrs后隨樹齡增加而增加。這可能是隨著茶樹年限的增加，茶園修剪枝和凋落物逐漸增多導(dǎo)致的土壤有機(jī)質(zhì)增加，同時(shí)也是總氮增加的間接原因[35]，此外，茶樹修剪物和凋落物以及雜草分解時(shí)會(huì)帶來蘋果酸、草酸、檸檬酸等，土壤中酸性物質(zhì)的增加，進(jìn)而降低了土壤pH[37]?？梢?，隨樹齡的變化會(huì)顯著影響土壤的理化性質(zhì)。土壤細(xì)菌群落與土壤理化因子相關(guān)性熱圖分析表明，土壤pH、總氮(TN)、總鉀(TK)、有效氮(AN)、有效磷(AP)對土壤細(xì)菌群落影響較大，這與許廣等[16]研究也有相似結(jié)果。

姚澤秀等[38]采用T-RFLP技術(shù)對不同植茶年限的土壤微生物群落研究，隨著樹齡的增加茶樹土壤細(xì)菌群落多樣性呈下降的趨勢。通過16S rRNA高通量絕對定量測序的方法對不同樹齡茶樹土壤和林地土壤細(xì)菌進(jìn)行研究，植茶后土壤細(xì)菌群落多樣性隨樹齡的增加而減小，與前人研究也有一致結(jié)果。從圖1可以看出，40yrs的茶樹土壤細(xì)菌數(shù)量絕對豐度最高且80yrs的土壤細(xì)菌數(shù)量絕對豐度和0yrs的差異較小，隨樹齡的增加土壤細(xì)菌群落數(shù)量的絕對豐度呈先增加后減小的趨勢，細(xì)菌數(shù)量總絕對豐度表現(xiàn)為40yrs>0yrs>80yrs>10yrs>100yrs。王海斌等[39]通過PLFA和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法結(jié)合研究茶樹土壤細(xì)菌發(fā)現(xiàn)，隨樹齡的增加土壤細(xì)菌數(shù)量呈先上升后下降的趨勢，許廣等[16]通過傳統(tǒng)培養(yǎng)法和高通量測序技術(shù)結(jié)合對不同植茶年限的土壤細(xì)菌群落研究發(fā)現(xiàn)，土壤細(xì)菌數(shù)量隨植茶年限的增加呈下降的趨勢，韓文炎等[40]通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對不同植茶年限和附近林地的土壤微生物16S rRNA基因研究，當(dāng)森林土壤轉(zhuǎn)變?yōu)椴鑸@土壤后，一定年限內(nèi)有利于提高土壤微生物的數(shù)量。雖然研究方法不同，但得到的結(jié)果具有一定的相似性，共同表明了植茶一定年限后土壤細(xì)菌的豐度和多樣性降低。Peter等通過對土壤中細(xì)菌的16S rRNA基因進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)[41]，Proteobacteria(變形菌門)、Acidobacteria(酸桿菌門)、Actinobacteria(放線菌門)等菌門是土壤中是主要的優(yōu)勢門。通過對林地土壤和不同樹齡茶樹土壤細(xì)菌群落的研究驗(yàn)證了這一結(jié)論。Heatmap(熱圖)和PCoA(主坐標(biāo))分析表明，植茶后除40yrs的土壤細(xì)菌群落和80yrs的差異較小外，其余樣本中土壤細(xì)菌群落距離較遠(yuǎn)，表明不同樹齡的茶樹土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在差異。土壤中細(xì)菌雖是土壤微生物中占比最高的，實(shí)際上其他種類的微生物群落也發(fā)揮著重要的作用，如茶園土壤中的一些真菌可以提高茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)[42]。

古茶樹是指樹齡大于100年的原生地、天然生長或栽培型的茶樹[43]。100yrs的茶樹即為古茶樹，100yrs的茶樹土壤細(xì)菌多樣性和絕對豐度明顯低于其它樹齡和周圍沒有茶樹種植歷史的林地，細(xì)菌群落的多樣性和絕對豐度的降低可能會(huì)導(dǎo)致古茶樹產(chǎn)量和品質(zhì)的下降。古樹茶被看作含有特異的生化成分，近年來古樹茶炒作嚴(yán)重，有的地方甚至連年拍賣，過度采摘，最終導(dǎo)致古茶樹的產(chǎn)量減少、品質(zhì)下降生存狀況惡化。茶樹作為一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，其品質(zhì)是制約經(jīng)濟(jì)效益的關(guān)鍵因子，因此，開展茶葉品質(zhì)和樹齡的關(guān)系以及微生物群落影響茶葉品質(zhì)的機(jī)理方面的研究具有重要的意義。

土壤細(xì)菌群落復(fù)雜并且數(shù)量龐大，采用16S rRNA絕對定量的方法得到了相對和絕對豐度，相對豐度反映出單個(gè)樣本中土壤中優(yōu)勢細(xì)菌群落，絕對豐度揭示了不同的樣本之間的不同細(xì)菌群落動(dòng)態(tài)變化趨勢，通過絕對定量的方法可以更加準(zhǔn)確的反映不同樣本間的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。

4 結(jié) 論

16S rRNA絕對定量高通量測序表明，10yrs的土壤細(xì)菌群落多樣性最高且高于林地，并隨著樹齡的增加而降低，茶樹土壤和林地土壤細(xì)菌多樣性表現(xiàn)為10yrs>0yrs>40yrs>80yrs>100yrs；植茶后土壤細(xì)菌總絕對豐度呈先增加后減小的趨勢，表現(xiàn)為40yrs>80yrs>10yrs>100yrs，0和80yrs土壤細(xì)菌總豐度差異較??；植茶10年的茶園土壤細(xì)菌特有ASV最多，隨著樹齡的增加特有的ASV個(gè)數(shù)逐漸減小。Acidobacteria(酸桿菌門)、Proteobacteria(變形菌門)、Chloroflexi(綠彎菌門)、Planctomycetes(浮霉菌門)、Actinobacteria(放線菌門)、Myxococcous(粘球菌門)、Gemmatimonadetes(芽單胞菌門)是林地和茶園土壤細(xì)菌主要的優(yōu)勢門，絕對豐度占了整個(gè)細(xì)菌群落的76.30%～88.90%；高通量絕對定量的方法更有助于研究不同樣本間微生物群落結(jié)構(gòu)和變化趨勢。