煤矸石對褶紋冠蚌斧足和外套膜重金屬含量及組織結(jié)構(gòu)的影響

周 瑤，劉麗丹，孫慶業(yè)

(安徽大學資源與環(huán)境工程學院，合肥 230601)

【研究意義】近年來，隨著經(jīng)濟快速發(fā)展和人類活動的加劇，微量元素(包括重金屬)通過雨水淋溶、自然風化等途徑進入環(huán)境介質(zhì)，導致微量元素污染日益嚴重[1]。重金屬無法被環(huán)境中的微生物降解，卻可以通過食物鏈在其他生物體內(nèi)富集，形成生物放大效應[2]。進入環(huán)境中的微量元素不僅導致其在生物體內(nèi)積累，還會對生物體組織結(jié)構(gòu)造成破壞[3]；同時，微量元素通過食物鏈進入人體，對人體健康造成嚴重危害[4]。煤矸石是采煤和洗煤過程中產(chǎn)生的固體廢物[5]，露天堆放不僅占用土地資源，在雨水的沖刷和浸泡下，煤矸石中被風化的微量元素還會進入周邊土壤環(huán)境造成污染[6]，進而隨地表徑流進入水體，并通過離子交換、吸附、絡(luò)合、絮凝、共沉淀等作用，最終絕大部分進入河床表層沉積物中[7]，從而對底棲生物造成巨大威脅。【前人研究進展】目前，國內(nèi)外已有很多關(guān)于蚌體內(nèi)重金屬積累的報道。Lukashev[8]發(fā)現(xiàn)，與未受污染河流相比，生活于受生活廢水污染河流中的鴨嘴無齒蚌(Anodontaanatina)各組織中Cu和Zn的含量均較高；孫磊等[9]在以野生背角無齒蚌為對象進行太湖重金屬淡水貝類研究時發(fā)現(xiàn)背角無齒蚌可用于檢測淡水中持久性污染物的生物積累；翁煥新等[10]研究表明，重金屬在牡蠣(Crassostreavirginica)中的生物積累是牡蠣自身的新陳代謝以及環(huán)境等諸多因素綜合影響的結(jié)果?！颈狙芯壳腥朦c】褶紋冠蚌(Cristariaplicata)為軟體動物門(Mollusca)雙殼綱蚌科的軟體動物，廣泛分布于我國多個省區(qū)，在安徽省兩淮采煤沉陷區(qū)水體中亦有分布。由于褶紋冠蚌具有高濾水速率以及較強的重金屬富集能力，因此常被用來進行重金屬污染生物監(jiān)測研究[11]。沉積物是水體中重金屬等污染物的重要匯聚地[12]，褶紋冠蚌營底棲生活，作為水生生態(tài)系統(tǒng)食物鏈的初級消費者，不僅是初級生產(chǎn)者的濾食者，也是高級消費者的食物來源，是重金屬污染的首要受害者[13]。重金屬在蚌體內(nèi)會與巰基蛋白結(jié)合，改變蛋白質(zhì)構(gòu)象，對蚌的組織結(jié)構(gòu)有較大的危害[14-15]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以褶紋冠蚌為研究對象，通過模擬自然環(huán)境進行水池養(yǎng)殖實驗，探討煤矸石對褶紋冠蚌斧足和外套膜中微量元素含量及組織結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗設(shè)計

養(yǎng)殖試驗在安徽大學(磬苑校區(qū))的養(yǎng)殖池(每個養(yǎng)殖池的容積為9×103L)內(nèi)進行。模擬采煤沉陷區(qū)環(huán)境，各養(yǎng)殖池內(nèi)平鋪20 cm的風干土壤，浸泡，待土壤軟化后，靜置1周，放水至1 m深，投放銅銹環(huán)棱螺、圓頂珠蚌等水生動物，馬來眼子菜(Potamogetonmalaianus)、苦草(Vallisineriaspiralis) 等水生植物，構(gòu)造簡單的水生系統(tǒng)。待池內(nèi)生物穩(wěn)定后(約30 d)，將風干后的煤矸石(采自謝橋煤礦)按照重量梯度0 kg(A池)、60 kg(B池)、140 kg(C池)稱重并裝入網(wǎng)兜，于2019年9月分別投入3個養(yǎng)殖池中，并分別投入25只大小相似的褶紋冠蚌。投入煤矸石梯度的設(shè)定是基于前期對謝橋煤礦采煤沉陷區(qū)的實地調(diào)查，以沉陷區(qū)塌陷面積、塌陷深度以及岸邊棄置煤矸石量為根據(jù)。所投放的褶紋冠蚌采自安徽省巢湖同一區(qū)域，投放之前先在室內(nèi)用清潔的自來水暫養(yǎng)1周。

1.2 樣品采集及預處理

養(yǎng)殖池內(nèi)的沉積物樣本于2019年9月(褶紋冠蚌投放之前)和2020年9月(采集褶紋冠蚌樣品時)分別采集1次，各養(yǎng)殖池均采集3個平行。現(xiàn)場用塑料鍬挖取200 g沉積物裝于潔凈的聚乙烯封口袋內(nèi)，并立即放入存有冰袋的約4 ℃保溫箱內(nèi)保存。帶回實驗室后，樣品先經(jīng)真空冷凍干燥，然后用瑪瑙研缽研磨，過尼龍篩，用于化學性質(zhì)的分析。

每個養(yǎng)殖池各采集10～15只褶紋冠蚌樣本裝入桶內(nèi)，帶回實驗室后用自來水清洗除去蚌殼表面泥土。清洗后的褶紋冠蚌用塑料刀具剖開蚌殼，分別獲取外套膜和斧足。將取得的外套膜和斧足一部分保存于裝有4%中性緩沖多聚甲醛固定液中固定，用于切片制作；剩余部分裝于潔凈的聚乙烯封口袋內(nèi)，經(jīng)真空冷凍干燥、瑪瑙研缽磨碎后，用于微量元素測定。

1.3 沉積物常規(guī)指標測定

氨氮的測定方法采用苯酚—次氯酸鈉分光光度法；pH檢測使用pH計(pHS-3C)[m(土)∶m(水)=1 ∶5][16]；總氮采用高氯酸—硫酸消化法處理后，使用凱氏定氮儀測定[17]；總磷采用鉬銻抗分光光度法(Standard Measurement and Test，SMT)測定[18]；有機質(zhì)采用燒失量法測定[19]；為了保證分析結(jié)果的準確性，每個樣品做3個平行樣，并且保證平行分析誤差<5%，最終取平行樣的平均值進行分析。

1.4 微量元素含量分析

1.4.1 養(yǎng)殖池沉積物微量元素檢測 養(yǎng)殖池沉積物中Cu、Zn、As、Pb、Cd含量采用HCl-HNO3-HF-HClO4消解[20]，電感耦合等離子體質(zhì)譜儀[17](ICAPQ，Thermo Fisher，美國)測定，以國家土壤和標準物質(zhì)(GSS-9 和 GSS-26)進行質(zhì)量控制，各元素加標回收率在 91%～105%，為提高精確度和減小隨機誤差，所有樣品分析均重復3次(取其平均值)。

1.4.2 斧足和外套膜微量元素檢測 置樣品于聚四氟乙烯消解罐中，加入6 mL濃硝酸和2 mL 30%過氧化氫，加蓋靜置1 h后置于120 ℃電熱板上進行消解，消解后的樣品用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICAPQ，Thermo Fisher，美國)測定，插入扇貝生物成分分析標準物質(zhì)[GBW10024(GSB-15)]進行質(zhì)量控制，各元素加標回收率在90%～110%，為了提高結(jié)果的精確度和隨機誤差，所測生物樣品均設(shè)置3組平行，取其平均值進行分析。

1.5 斧足和外套膜組織切片制作

取固定后的斧足和外套膜生物組織進行洗滌、脫水、透明、浸蠟、包埋操作，采用石蠟切片技術(shù)進行切片，于光學顯微鏡下觀察、拍照。

1.6 數(shù)據(jù)處理

運用Excel 2016對數(shù)據(jù)進行初步整理以及計算，方差分析用 SPSS 21.0 軟件進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 養(yǎng)殖池沉積物的理化性質(zhì)

從表1可知，2020年9月，試驗池內(nèi)沉積物中總氮、總磷和有機質(zhì)含量均有所增加，試驗組沉積物pH值略有升高。

從表2可以看出，投加煤矸石并未對養(yǎng)殖池中沉積物的Cu、Cd含量產(chǎn)生影響，但隨著煤矸石投加量的增加，沉積物中Zn、As和Pb含量逐漸增加，土壤中微量元素的含量表現(xiàn)為Zn>As>Pb>Cu>Cd。

2.2 褶紋冠蚌不同組織重金屬含量

貝類對重金屬具有較強的富集能力。斧足是斧足綱生物進行運動的組織，斧足受損可直接導致貝類死亡；外套膜也稱鰓腔，通常排泄孔、生殖孔和肛門都開口于外套腔，有便于水流進出，輔助攝食、呼吸、生殖、運動等功能，在褶紋冠蚌的生命中占有重要地位。從表3可以看出，斧足和外套膜中5種微量元素含量均表現(xiàn)為C>B>A，表明斧足和外套膜中5種微量元素含量隨著養(yǎng)殖池中投加的煤矸石數(shù)量的增加而增加，其中煤矸石投加量為140 kg(C池)時，斧足和外套膜中5種微量元素含量與對照組(A池)均有顯著差異。煤矸石投加量為60 kg(B池)時，斧足中Zn、Pb和Cd含量與對照組(A池)存在差異；外套膜中的Cd含量也顯著高于A池。說明，煤矸石的加入可導致褶紋冠蚌外套膜和斧足中微量元素含量增加。

本研究中，無論是斧足還是外套膜，5種微量元素的含量均表現(xiàn)為Zn>As>Cu>Pb>Cd，斧足和外套膜中Zn、As和Cd含量變化和沉積物一致。表明褶紋冠蚌組織中不同元素含量的差異主要受外界環(huán)境影響。

表1 養(yǎng)殖池沉積物理化指標質(zhì)量濃度

表2 養(yǎng)殖池沉積物重金屬含量

表3 褶紋冠蚌不同組織中微量元素含量

圖1 褶紋冠蚌斧足組織切片F(xiàn)ig.1 Tissue section of axe-foot of Cristaria plicata

MF:肌纖維;IE:內(nèi)表皮;OE:外表皮;BR:空白區(qū)域;BV:血管;Ec:上皮細胞;Va:空泡;CM:環(huán)形肌肉層;Cb:細胞核MF：Myofiber;IE:Endocuticle；BR:Blank area；BV:Blood vessel；Ec:Epithelial cell；Va：Vacuole；CM：Annular muscle layer；Cb:Cell nucleus圖2 褶紋冠蚌外套膜組織切片F(xiàn)ig.2 Section of mantle tissue of Cristaria plicata

本研究中，外套膜中5種微量元素含量均高于斧足。說明褶紋冠蚌的不同組織對進入體內(nèi)的重金屬的積累量明顯不同。

2.3 褶紋冠蚌不同組織結(jié)構(gòu)變化

2020年9月，B池和C池中部分蚌體內(nèi)有粘液排出，兩瓣殼微微張開，捏動雙殼時有略微松動；解剖過程中觀察到，部分蚌體內(nèi)的內(nèi)臟團顏色呈淺褐色，斧足略微腫脹，鰓由健康的淡黃色變?yōu)榘迭S色。說明煤矸石的投加已經(jīng)對褶紋冠蚌生命活動產(chǎn)生了影響，這可能與煤矸石中某些污染物質(zhì)釋放到試驗水體有關(guān)。

對照組斧足的表皮細胞呈柱狀，頂端有許多排列整齊的纖毛，形成了略有規(guī)則的褶皺(圖1)。B組表皮下組織層變薄，肌束間間距變大，與對照組相比沒有顯著變化。與對照組相比，C組斧足表皮形成了較不規(guī)則的褶皺，表皮下細胞核染色變淺，可能是細胞減少導致；肌束松散不規(guī)則，空泡現(xiàn)象明顯，并且表皮下肌纖維斷裂明顯，排列混亂。由此可見，煤矸石投加量越大，褶紋冠蚌斧足病理損傷程度越大。

對照組褶紋冠蚌表皮有規(guī)則的褶皺(圖2)，表皮下方細胞核染色深，細胞聯(lián)系緊密且排列規(guī)則，肌纖維細長，肌肉層在邊緣膜兩側(cè)厚度不一，組織間有許多空泡。B組褶紋冠蚌上皮褶皺趨于平直，肌纖維排列不規(guī)則，少量結(jié)締組織斷裂形成空白區(qū)域；C組褶紋冠蚌肌纖維斷裂明顯且排列混亂，肌纖維較短，組織間空泡變少，內(nèi)表皮細胞核排列不規(guī)則，有的破裂脫落。

B、C池中的褶紋冠蚌組織間損傷程度均表現(xiàn)為外套膜大于斧足，結(jié)合前述2.2中得到的結(jié)論：外套膜中5種微量元素含量均高于斧足，表明組織中Cu、Zn、As、Pb、Cd的積累可能是導致斧足和外套膜出現(xiàn)組織病變的因素之一。

3 討 論

3.1 沉積物理化性質(zhì)和重金屬變化

采集褶紋冠蚌樣品時，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖池的沉積物中有少量蚌、螺和植物的殘骸，水生生物死亡殘骸的累積會導致沉積物中的有機質(zhì)、總氮、總磷含量升高[21]；另外投加到養(yǎng)殖池中的煤矸石也含有有機質(zhì)及含氮和磷的化合物，煤矸石中這些物質(zhì)的釋放也會導致沉積物中有機質(zhì)、總氮和總磷增加。在煤矸石長期堆積的過程中，經(jīng)過長期的氧化、降雨的洗刷以及微生物對各種礦物的分解和溶解作用，使難溶于水的礦物質(zhì)變成較易被土質(zhì)吸收的有機質(zhì)、氮、磷等營養(yǎng)元素，增加了其在土壤中的含量[22-23]。培養(yǎng)時間到達1年時，試驗組沉積物pH略有升高，這可能與煤矸石偏堿性有關(guān)[24]。

自然環(huán)境中，沉積物中微量元素含量變化與多種因素有關(guān)。暴露于空氣中的煤矸石在自然風化過程中逐漸向周邊環(huán)境釋放微量元素，所釋放的微量元素數(shù)量和速率首先受煤矸石自身微量元素含量、微量元素在煤矸石中的賦存形態(tài)的影響，釋放微量元素的多少也直接影響微量元素進入沉積物中的數(shù)量。微量元素在煤矸石中的賦存形態(tài)決定其從煤矸石中淋溶析出的難易，相同條件下，以有機態(tài)存在的微量元素在淋溶時較難析出，而以無機態(tài)存在特別是以吸附態(tài)存在的微量元素在煤矸石淋溶時，易從煤矸石中析出[25]。煤矸石中微量元素含量越高，其釋放到周邊環(huán)境中的潛在數(shù)量也就越多；含有微量賦存礦物越容易風化，則釋放速率越快。大部分微量元素在浸泡前期的浸出濃度受煤矸石風化程度的影響，Zn元素在整個浸泡過程的浸出濃度均受到煤矸石風化程度的影響，而部分元素無此規(guī)律[26]。另外，煤矸石在自然風化過程中還受到外界環(huán)境(如pH、溫度、濕度等)的影響，研究發(fā)現(xiàn)煤矸石中重金屬As、Pb在弱酸性浸泡液中更易被融出釋放；多數(shù)微量元素在浸泡前期和中期的浸出濃度均與煤矸石粒徑大小有關(guān)[26]。煤矸石中往往含有較多的Zn、As、Pb等重金屬元素[27]，這也決定了釋放到環(huán)境中各微量元素含量的差異。孫亞喬等[28]發(fā)現(xiàn)堆放場土壤重金屬Zn、As、Pb的均值皆超過遠離堆放場土壤背景值和中國土壤背景值，煤矸石堆置場周邊土壤中As污染最嚴重[27]，Zn含量也顯著超過周邊及中國土壤背景值[28]，這些現(xiàn)象說明了煤矸石量的多少往往也決定了周邊環(huán)境中微量元素數(shù)量的多少。遭受重金屬污染的土壤中，目前主要圍繞土壤重金屬賦存形態(tài)[29]、土壤污染評價和重金屬的釋放遷移等展開，針對煤矸石釋放重金屬化學行為鮮有報道，本研究中Cu、Cd在沉積物中的含量沒有顯著變化可能與pH、電導率、溫度等諸多因素的聯(lián)合作用有關(guān)。

3.2 褶紋冠蚌不同組織重金屬含量變化

水生生物尤其是貝類對重金屬具有較強的富集能力[30]。陳修報等[31]在研究3種不同污染生境背景中背角無齒蚌的重金屬積累特征時，發(fā)現(xiàn)重金屬污染較為嚴重的生境背景中的背角無齒蚌體內(nèi)重金屬含量也相應較高；貝類生活的環(huán)境因子影響貝類對重金屬的吸收，表現(xiàn)為貝類體內(nèi)的Zn、Cu含量與海水中這2種微量元素濃度呈正相關(guān)，與鹽度呈負相關(guān)，而與水溫、pH、溶解氧沒有相關(guān)性[32]；相關(guān)研究表明，貝類體內(nèi)重金屬含量呈現(xiàn)一定季節(jié)分布特征[33-34]。

重金屬進入蚌體內(nèi)后，不同組織對它們的積累具有較為明顯的選擇性[31]。本研究中，外套膜中5種微量元素含量均高于斧足，吳曼曼等[13]在研究巢湖4種蚌類不同組織中5種微量元素含量及其空間變化中得到相似結(jié)論。不同組織中微量元素含量差異可能是由于不同組織對微量元素的吸收機制不同造成的，趙衛(wèi)紅等[35]在研究灘涂貝類不同組織器官對重金屬的富集能力時發(fā)現(xiàn)，部分重金屬在貝類內(nèi)臟囊和食道腺中的含量遠高于其他組織器官，另外發(fā)現(xiàn)Pb在足中的含量是食道腺中的3.8倍，由此推斷不同重金屬進入貝類不同組織的主要方式不同，可能主要是進食或滲透作用；許澄源等[36]發(fā)現(xiàn)貽貝各部位As含量順序分別為內(nèi)臟團>生殖腺，鰓>體液，表明貽貝對As的累積途徑可能主要通過食物進入體內(nèi)，鰓和生殖腺的體表吸附是次要的。

3.3 褶紋冠蚌不同組織結(jié)構(gòu)變化

本研究中，投加煤矸石的養(yǎng)殖池B池和C池褶紋冠蚌的斧足組織形態(tài)結(jié)構(gòu)均出現(xiàn)了與正常情況不同程度的差別，主要表現(xiàn)為肌纖維斷裂、肌束松散不規(guī)則。而在正常情況下，斧足縱切面主要由肌肉組織構(gòu)成，表面覆蓋1層由柱狀細胞組成的表皮，并形成許多褶皺，表皮下面有1層較薄的環(huán)肌，中央都是由縱橫交錯的肌束組成，形成三維的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，由結(jié)締組織相互連接，具有豐富的血管[37]，說明煤矸石的投加對斧足組織產(chǎn)生了影響。涂葉綠等[38]研究了銅、鎘聯(lián)合脅迫處理對鯽魚肌肉的影響，發(fā)現(xiàn)肌肉組織中的肌纖維斷裂、聚集、崩潰、溶解，同時肌纖維間隙增大，且重金屬濃度越高，病理損傷越大。邵健忠等[39]在研究三角帆蚌瘟病的組織病理時，發(fā)現(xiàn)病蚌也有蚌殼微微張開，斧足腫大變黃等體征，與本研究在采集褶紋冠蚌樣本時觀察到的現(xiàn)象極為相似。由此猜測，重金屬威脅可能會導致褶紋冠蚌病變，進而導致組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化，有待進一步研究。

外套膜的內(nèi)表皮直接與水接觸，外套膜在貝類的攝食、排出進入外套腔的異物及防御等方面都有非常重要的作用，破壞外套膜會降低貝類防御功能[40]。本研究中，投加煤矸石的養(yǎng)殖池B池和C池褶紋冠蚌的外套膜組織形態(tài)結(jié)構(gòu)均出現(xiàn)了與正常情況不同程度的差別，主要表現(xiàn)為肌纖維斷裂、結(jié)締組織之間形成空白區(qū)域。而健康蚌的外套膜由內(nèi)外上皮層、結(jié)締組織、肌纖維及一定數(shù)量的粘液分泌細胞組成，上皮細胞排列整齊，結(jié)締組織均勻分布[41]，細胞聯(lián)系緊密，組織中間是疏松的連接組織，中間有多個空泡。蚌在受到不同外界刺激條件下，其內(nèi)臟團、鰓、外套膜等是主要受損組織[42]。鎘極易通過鈣道穿過細胞膜進入組織細胞[43]，導致人和動物組織器官形態(tài)變化和結(jié)構(gòu)損傷[44-45]。本研究中，隨著煤矸石/水比率的增加，褶紋冠蚌外套膜組織中的各微量元素含量隨之增加，外套膜組織損傷程度也隨之加深，說明煤矸石/水比率是影響褶紋冠蚌外套膜組織形態(tài)結(jié)構(gòu)受損程度的因素。

褶紋冠蚌組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的原因很多。煤矸石中除重金屬元素污染物之外，還有多環(huán)芳烴等持久性有機污染物，也可能導致水生動物組織器官病變，此外，有害元素在組織中的積累還可能引起蚌體對環(huán)境中的病原微生物的抵抗力下降，導致其感染相關(guān)病毒或病原菌，從而造成組織器官形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。Hawkins等[46]報道低濃度的多環(huán)芳烴能夠引發(fā)青鳉魚肝臟腫瘤；混有PAHs的海洋沉積物可以導致傷寒沙門氏菌株突變[47]。陳志勝等[48]發(fā)現(xiàn)雜色鮑(Haliotisdiversicolor)患潰瘍病后斧足出現(xiàn)了上皮細胞腫脹并逐漸脫落，肌纖維萎縮變細，染色變淺，排列雜亂無章，嚴重時肌纖維斷裂形成空洞等癥狀。任素蓮等[49]發(fā)現(xiàn)海灣扇貝(Argopectensirridians) 感染球形病毒后其外套膜也有類似變化。本研究中，微量元素之外的其他因素導致的褶紋冠蚌組織學變化仍待進一步探討。

4 結(jié) 論

(1)外套膜對微量元素的富集能力大于斧足；褶紋冠蚌斧足和外套膜中Cu、Zn、As、Pb的質(zhì)量分數(shù)隨煤矸石/水比率的增加而顯著增加(P<0.05)；不同重金屬元素在褶紋冠蚌的斧足和外套膜組織中的質(zhì)量分數(shù)從大到小的順序均為Zn、As、Cu、Pb、Cd。

(2)煤矸石釋放微量元素對褶紋冠蚌的斧足和外套膜組織均產(chǎn)生了不同程度的影響，同種污染條件下，外套膜受損程度大于斧足；斧足組織中，表皮褶皺變得無規(guī)則，表皮下細胞核染色變淺，肌纖維斷裂明顯，肌束間間距增大。外套膜組織中，上皮褶皺趨于平直，內(nèi)表皮細胞核排列規(guī)則且染色變淺，肌纖維排列混亂且有斷裂現(xiàn)象，組織間空泡減少。隨煤矸石/水比率增大，2種組織的病變程度加深。