精子形態(tài)對(duì)年輕女性新鮮單囊胚移植助孕結(jié)局的影響

吳燕虹 龔超超 習(xí)海濤 趙軍招

近年來，不孕不育癥已成為全球性的問題。不孕不育癥發(fā)病率約為10%～15%，發(fā)病原因中男性因素占40%[1]。常規(guī)精液分析的重要指標(biāo)精子形態(tài)正常率能否預(yù)測(cè)男性生育能力和體外受精胚胎移植結(jié)局一直備受爭(zhēng)議[2]。有研究表明，精子畸形率高不僅會(huì)降低受精率，還會(huì)延長(zhǎng)自然受孕時(shí)間，甚至增加自然流產(chǎn)的概率[3-4]。但也有研究發(fā)現(xiàn)即使精子形態(tài)正常率為0也有成功受精和受孕的可能，精子形態(tài)異常對(duì)輔助生殖技術(shù)的助孕結(jié)局無(wú)明顯影響[5-6]。目前關(guān)于精子形態(tài)對(duì)單囊胚移植的影響相關(guān)報(bào)道較少。鑒于單囊胚移植是今后輔助生殖技術(shù)革新的方向，本研究通過探討精子形態(tài)對(duì)年輕女性患者行新鮮單囊胚移植后助孕結(jié)局的影響，以期為提高單囊胚移植的安全性提供臨床依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 回顧性分析2019年1至12月在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行新鮮單囊胚移植的年輕女性患者690例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）女方年齡≤35歲；（2）促排卵方案為卵泡期超長(zhǎng)方案；（3）女方基礎(chǔ)激素水平正常；（4）女方不孕原因?yàn)檩斅压芤蛩鼗蚨嗄衣殉簿C合征，超聲提示雙卵巢、子宮正常；（5）男女雙方身體健康，無(wú)酗酒、吸毒等不良嗜好；（6）取卵和移植周期均為第1次。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）不適合新鮮周期移植者，如子宮腺肌癥、子宮肌瘤壓迫內(nèi)膜、宮腔粘連、子宮內(nèi)膜息肉等；（2）男性少弱精子癥；（3）男性精子DNA 碎片率高（DNA-fragmetation-index，DFI≥25%）。根據(jù)《WHO人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》（第5版）精子形態(tài)正常率參考值下限為 4%[7]，將患者根據(jù)男方精子形態(tài)正常率分為正常組、精子輕中度畸形組和精子重度畸形組3組。正常組：精子形態(tài)正常率≥4%，共157例；精子輕中度畸形組：2%≤精子形態(tài)正常率＜4%，共256例；精子重度畸形組：精子形態(tài)正常率＜2%，共277例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過，所有患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 降調(diào)節(jié) 于月經(jīng)周期1～5 d注射3.75 mg長(zhǎng)效醋酸亮丙瑞林微球（商品名：貝依，規(guī)格：3.75 mg/支，麗珠醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司）降調(diào)節(jié)，32～38 d后測(cè)定血卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）、促黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、雌二醇（estradiol，E2），同時(shí)B超監(jiān)測(cè)內(nèi)膜、卵泡的數(shù)量及大小。當(dāng)垂體達(dá)到脫敏狀態(tài)（FSH＜5 mIU/ml、LH＜5 mIU/ml、E2＜50 pg/ml，B超監(jiān)測(cè)無(wú)直徑＞10 mm卵泡、子宮內(nèi)膜厚度＜5 mm），則使用促性腺激素（gonadotropin，Gn）啟動(dòng)促排卵。如降調(diào)節(jié)后B超檢查提示子宮內(nèi)膜厚度≥5 mm，查尿妊娠試驗(yàn)，排除妊娠后再用Gn促排卵。

1.2.2 促排卵 根據(jù)患者年齡、體重、竇卵泡數(shù)、基礎(chǔ)FSH選擇Gn促排卵，Gn刺激第5～6天開始監(jiān)測(cè)，根據(jù)B超監(jiān)測(cè)及血清性激素水平調(diào)整Gn種類和劑量。當(dāng)有2～3個(gè)卵泡直徑≥18 mm時(shí)，于21:00至22:00肌肉注射注射用絨促性素（規(guī)格：5 000 IU/支，麗珠醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司）4 000～10 000 IU或皮下注射重組人絨毛膜促性腺激素注射液（商品名：艾澤，規(guī)格：250 μg/支，瑞士默克雪蘭諾公司）125～250 μg 扳機(jī)。

1.2.3 取卵、精液檢查、移植及黃體支持 扳機(jī)后36～38 h，在陰道超聲引導(dǎo)下經(jīng)陰道取卵。取卵當(dāng)日，男方以手淫法收集精液。獲取的卵母細(xì)胞常規(guī)行體外受精（in vitro fertilization，IVF）操作及胚胎培養(yǎng)，若常規(guī)受精失敗，則行補(bǔ)救性卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)（rescue intracytoplasmic sperm injection，R-ICSI）。采用Gardner囊胚分級(jí)法進(jìn)行分級(jí)[8]：以數(shù)字1～6對(duì)囊胚的擴(kuò)張度和孵化狀態(tài)進(jìn)行評(píng)分，以字母A、B、C對(duì)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（inner cell mass，ICM）和滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞（trophectoderm，TE）進(jìn)行評(píng)分。優(yōu)質(zhì)囊胚的標(biāo)準(zhǔn)定義為3期及3期以上、ICM及TE均為B級(jí)及以上者，可利用胚胎定義為3期以上、ICM和TE評(píng)分不同時(shí)為C者。取卵后第5天選取1枚優(yōu)質(zhì)囊胚進(jìn)行移植，如本周期內(nèi)無(wú)優(yōu)質(zhì)囊胚者，則選取1枚可利用囊胚進(jìn)行移植。移植后黃體支持方案為：自取卵日起，地屈孕酮片（商品名：達(dá)芙通，規(guī)格：10 mg/片，荷蘭Abbott Healthcare Products B.V.）20 mg/次，2 次/d 口服；黃體酮軟膠囊（商品名：安琪坦，規(guī)格：0.1 g/片，法國(guó)法杏制藥廠），0.2 g/次，2次/d口服或陰道給藥。

1.2.4 妊娠結(jié)局判定標(biāo)準(zhǔn) 胚胎移植后2周，測(cè)血清人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）水平以確定是否妊娠。胚胎移植后4周，陰道超聲檢查發(fā)現(xiàn)有孕囊者為臨床妊娠；血hCG≥15 mIU/ml或尿妊娠試驗(yàn)陽(yáng)性，但陰道超聲檢查未見孕囊者為生化妊娠；發(fā)生在妊娠12周前的流產(chǎn)為早期流產(chǎn)，而發(fā)生在12周或之后的流產(chǎn)為晚期流產(chǎn)。妊娠滿28周至不足37周間分娩者為早產(chǎn)。出生體重＜2 500 g的嬰兒為低出生體重兒，出生體重≥4 000 g的嬰兒為巨大兒。

1.3 觀察指標(biāo) 助孕結(jié)局包括實(shí)驗(yàn)室結(jié)局、妊娠結(jié)局和新生兒結(jié)局。其中實(shí)驗(yàn)室結(jié)局包括獲卵數(shù)、成熟數(shù)、受精數(shù)、囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚移植比和囊胚冷凍數(shù)等指標(biāo)，妊娠結(jié)局包括hCG陽(yáng)性率、臨床妊娠率、生化妊娠率、早期和晚期流產(chǎn)率、異位妊娠率、多胎妊娠率、早產(chǎn)率、活產(chǎn)率等指標(biāo)。新生兒結(jié)局包括新生兒出生體重、巨大兒和低出生體重兒占比、新生兒死亡率、新生兒畸形率和新生兒性別等指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，3組間比較采用單因素方差分析；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，3組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法。采用多因素logistic回歸分析影響活產(chǎn)的因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組患者基本情況比較 3組患者女方年齡、不孕年限、BMI、雙側(cè)竇卵泡計(jì)數(shù)（antral follicl ecount，AFC）、不孕類型、不孕原因、基礎(chǔ)激素水平、降調(diào)節(jié)后激素水平、hCG日激素水平及子宮內(nèi)膜厚度、Gn用量和天數(shù)，男方年齡、不育類型、精液量、精子密度及精子活率等一般情況比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），3組患者精子形態(tài)正常率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表 1。

表1 3組患者基本情況比較

2.2 3組患者實(shí)驗(yàn)室結(jié)局比較 3組患者獲卵數(shù)、受精方式、成熟數(shù)、受精數(shù)、囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚移植比和囊胚冷凍數(shù)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表2。

表2 3組患者實(shí)驗(yàn)室結(jié)局比較

2.3 3組患者妊娠結(jié)局和新生兒結(jié)局比較 3組患者h(yuǎn)CG陽(yáng)性率、臨床妊娠率、生化妊娠率、早期和晚期流產(chǎn)率、異位妊娠率、多胎妊娠率、早產(chǎn)率、活產(chǎn)率、新生兒出生體重、巨大兒和低出生體重兒占比、新生兒死亡率、新生兒畸形率和新生兒性別比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表3。

表3 3組患者妊娠結(jié)局和新生兒結(jié)局比較

2.4 影響活產(chǎn)結(jié)局的多因素分析 以是否活產(chǎn)作為因變量，以精子形態(tài)是否正常、女方不孕類型、男方不孕類型、多囊卵巢綜合征等18個(gè)變量為自變量（賦值情況見表4）進(jìn)行多因素logistic回歸分析，結(jié)果顯示精子形態(tài)異常不是影響活產(chǎn)結(jié)局的因素（P＞0.05），見表5。

表4 自變量賦值

表5 影響活產(chǎn)結(jié)局的多因素分析

3 討論

現(xiàn)階段影響輔助生殖技術(shù)結(jié)局的因素包括男女方年齡、不孕年數(shù)、BMI、母體陰道和子宮內(nèi)膜微生物組以及著床前后血清孕酮水平[9-10]。本研究入選患者的女方年齡不超過35歲、基礎(chǔ)激素水平功能正常、均使用卵泡期超長(zhǎng)方案促排卵、首次取卵及移植，可有效避免高齡、卵巢功能減退、反復(fù)種植失敗以及促排卵方案不同可能對(duì)研究結(jié)果造成的不利影響。在排除上述因素后，著重探討精子形態(tài)異常對(duì)新鮮單囊胚移植助孕結(jié)局的影響。

目前，精子形態(tài)預(yù)測(cè)輔助生殖技術(shù)妊娠結(jié)局方面的應(yīng)用價(jià)值在業(yè)界尚未達(dá)成共識(shí)[11]。多位學(xué)者發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)的畸形精子癥對(duì)IVF輔助生育妊娠結(jié)局無(wú)顯著影響[12-14]。相反，Dubey等[15]發(fā)現(xiàn)正常精子形態(tài)組的正常胚胎率、種植率、臨床妊娠率均高于畸形精子組。本研究中，精子形態(tài)對(duì)新鮮單囊胚移植后臨床妊娠率、活產(chǎn)率等妊娠結(jié)局和新生兒結(jié)局均無(wú)明顯影響。究其原因，可能在于精子形態(tài)分類、染色制片技術(shù)缺乏共識(shí)，精子形態(tài)正常率的閾值也有可能隨著時(shí)間的推移而改變，精子畸形對(duì)妊娠結(jié)局的影響似乎比最初想象的作用要小[13]。另外，本研究采用的精子處理方法是密度梯度離心后再上游法，有研究認(rèn)為該方法不僅可以減少異倍體的精子和欠成熟的精子比例，富集運(yùn)動(dòng)能力高的精子群體，還有益于獲得冷凍復(fù)蘇后頂體完整性高的精子，對(duì)改善畸形精子百分比具有一定的優(yōu)越性，從而降低了精子形態(tài)畸形可能產(chǎn)生的影響[16-17]。

畸形精子的頂體功能異常可直接導(dǎo)致IVF受精失敗或影響受精率[14，18-19]。R-ICSI作為常規(guī)IVF受精失敗時(shí)的一種安全有效的補(bǔ)救方法，從提出發(fā)展到如今，已被廣泛應(yīng)用。Li等[20]探討了精子形態(tài)對(duì)R-ICSI周期臨床結(jié)局和實(shí)驗(yàn)室結(jié)局并無(wú)影響。本研究中，3組分別有5、9、18例患者行R-ICSI操作，單純精子形態(tài)異常并未影響受精率，且與囊胚形成率、優(yōu)胚率以及囊胚冷凍數(shù)無(wú)相關(guān)性。這也意味著精子形態(tài)對(duì)IVF受精結(jié)果的影響尚無(wú)定論，孤立的精子形態(tài)異常不應(yīng)作為行ICSI操作的預(yù)測(cè)因素，倘若IVF過程中發(fā)生受精失敗，及時(shí)行補(bǔ)救ICSI治療也可獲得滿意的實(shí)驗(yàn)室結(jié)局。

流產(chǎn)同樣為輔助生殖技術(shù)治療的一個(gè)重要風(fēng)險(xiǎn)事件。既往針對(duì)流產(chǎn)的研究主要集中在女性方面[21]，對(duì)有男性因素導(dǎo)致的流產(chǎn)重視程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。隨著近來研究的進(jìn)一步深入，發(fā)現(xiàn)卵子質(zhì)量對(duì)成功活產(chǎn)的貢獻(xiàn)為70%～80%，子宮條件所占的權(quán)重為10%～15%，剩余的10%～15%為精子的貢獻(xiàn)，當(dāng)精子異常時(shí)，男方因素對(duì)于可否獲得活產(chǎn)后代的影響顯著增大[22]。Gil-Villa等[23]的研究顯示，與正常可育男性相比，反復(fù)流產(chǎn)患者的男性伴侶有較低的精子正常形態(tài)率。本研究中，異常的精子形態(tài)不增加生化妊娠、早期流產(chǎn)以及晚期流產(chǎn)等風(fēng)險(xiǎn)的發(fā)生，與多位學(xué)者的研究[14，24]一致。目前針對(duì)精子因素所致流產(chǎn)的研究仍處于探索階段，胚胎學(xué)家們更認(rèn)可精子DNA損傷（高DFI值）對(duì)胚胎發(fā)育的影響[25]，臨床上應(yīng)結(jié)合多項(xiàng)檢查結(jié)果綜合評(píng)估精子質(zhì)量。

本研究有3個(gè)主要局限性，希望能在未來的研究中加以解決。首先，WHO發(fā)布的《WHO精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》（第5版）并沒有包括關(guān)于中國(guó)人群的任何數(shù)據(jù)和資料，因此，目前正常精子形態(tài)的設(shè)定是否適合中國(guó)人群是很值得探討的問題。其次，僅僅統(tǒng)計(jì)到新鮮單囊胚移植周期妊娠結(jié)局，沒有進(jìn)行累計(jì)妊娠率統(tǒng)計(jì)，且未能追蹤新生兒出生后的智力體格發(fā)育等情況。最后，系單中心的回顧性研究，日后還需要進(jìn)行大樣本量的、嚴(yán)格控制外變量的、多中心的、前瞻性的隨機(jī)對(duì)照研究精子形態(tài)對(duì)單囊胚新鮮移植的影響。

綜上所述，在年輕女性行新鮮單囊胚移植周期中，精子形態(tài)異常既不影響IVF的實(shí)驗(yàn)室結(jié)局，也不影響妊娠結(jié)局和新生兒結(jié)局，為精子形態(tài)異?；颊哌x擇新鮮單囊胚移植助孕的安全性提供一定的參考價(jià)值，減少了畸形精子癥患者行輔助生殖技術(shù)助孕的后顧之憂。