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    自閉癥模型小鼠神經(jīng)遞質(zhì)水平病理性改變的機(jī)制研究

    2022-03-15 05:37:04趙佳佳趙蓓高未李杰蔡俏應(yīng)小明
    浙江醫(yī)學(xué) 2022年4期
    關(guān)鍵詞:神經(jīng)遞質(zhì)子代自閉癥

    趙佳佳 趙蓓 高未 李杰 蔡俏 應(yīng)小明

    自閉癥又稱孤獨(dú)癥,是廣泛性發(fā)育障礙的代表性疾病,核心癥狀主要包括情緒表達(dá)困難、社交互動(dòng)障礙,語言和非語言的溝通障礙、限制行為與重復(fù)刻板動(dòng)作以及明顯的興趣狹窄[1-2]。除上述三大核心癥狀外,自閉癥患者還可能伴發(fā)其他臨床癥狀,如智力障礙、癲癇、睡眠障礙、感知系統(tǒng)異常、頭圍異常、胃腸道不適、免疫及代謝異常等[3-4]。由于自閉癥具有高度臨床異質(zhì)性和病因異質(zhì)性,其真正的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全清楚[5-6]。相關(guān)研究表明,自閉癥的發(fā)生可能受到基因和環(huán)境因素的共同影響[7]。本文通過構(gòu)建自閉癥小鼠模型,對(duì)其神經(jīng)遞質(zhì)[包括γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、多巴胺等]水平病理性改變的機(jī)制作一探討。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 12只雌性、6只雄性C57BL/6小鼠,6周齡,無特定病原體,購自上海斯萊克,SCXK(滬)2017-0005,合格證號(hào):20170005047072。試驗(yàn)前小鼠在動(dòng)物房環(huán)境中適應(yīng)1周。飼養(yǎng)環(huán)境:溫度20~25℃,相對(duì)濕度40%~70%。本實(shí)驗(yàn)委托杭州赫貝科技有限公司機(jī)構(gòu)完成,實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)該公司動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審查通過。

    1.2 主要試劑和儀器 高爾基染色試劑盒(批號(hào):PK401)購自美國FD Neuro Technologies Inc公司,丙戊酸鈉(sodium valproate,VPA;批號(hào):K1823102)購自四川科瑞德制藥股份有限公司,聚偏二氟乙烯膜(批號(hào):IPVH00010)購自美國 Millipore公司,GABA(批號(hào):14012)試劑盒購自美國 R&D公司,5-HT(批號(hào):17101)試劑盒購自美國R&D公司,多巴胺(批號(hào):14082)試劑盒購自美國R&D公司,Arc一抗(批號(hào):H00023237-B01)購自艾美捷科技有限公司,EGR2一抗(批號(hào):ab63943)購自上海恒斐生物科技有限公司,S-100a9一抗(批號(hào):H00006280-M01A)購自艾美捷科技有限公司。水迷宮系統(tǒng)購自北京智鼠多寶科技有限責(zé)任公司,CM186UV型冷凍切片機(jī)購自德國Leica公司,BX43型電子顯微鏡購自日本Olympus公司,AB SCIEX 5500 QTRAP質(zhì)譜儀購自美國AB SCIEX公司,1290 Infinity LC超高效液相色譜儀購自美國Agilent公司,5430R低溫高速離心機(jī)購自德國Eppendorf公司,Mini-Proten Tetra System電泳系統(tǒng)、ChemiDoc XRS+System凝膠成像儀、定量PCR儀及配套的分析軟件均購自美國Bio-RAD公司。

    1.3 自閉癥小鼠(子代)模型的建立 將健康成年雌鼠12只和雄鼠6只合籠,受孕后將雌鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組(母代)和對(duì)照組(母代),記為受孕0 d。模型組(母代)于受孕10、12 d腹腔注射VPA注射液(使用0.9%氯化鈉注射液配置,濃度為250 mg/ml)1.2 ml/kg,對(duì)照組給予等體積0.9%氯化鈉注射液。新生鼠出生當(dāng)天記為出生0 d,模型組(子代)于出生4 d后進(jìn)行母子分離實(shí)驗(yàn)。將新生小鼠移至遠(yuǎn)離親本的新房間,分離24 h后將新生小鼠送回,與親本同籠。建模8周后,取模型組(子代)、對(duì)照組(子代)各12只用于以下實(shí)驗(yàn)。

    1.4 小鼠(子代)行為學(xué)觀察 采用理毛實(shí)驗(yàn)、水迷宮實(shí)驗(yàn)和曠場實(shí)驗(yàn)。對(duì)照組、模型組小鼠(子代)各取3只進(jìn)行行為學(xué)觀察。(1)理毛實(shí)驗(yàn):觀察并記錄小鼠5 min內(nèi)的理毛次數(shù)。(2)水迷宮實(shí)驗(yàn):將小鼠置于水迷宮中央?yún)^(qū),記錄小鼠搜尋站臺(tái)的時(shí)間,即潛伏時(shí)間。(3)曠場實(shí)驗(yàn):將小鼠置于50 cm×50 cm×50 cm的曠場裝置中,測量小鼠5 min內(nèi)的運(yùn)動(dòng)距離,記錄某一肢體進(jìn)入曠場中央格子的次數(shù)(即穿越格子次數(shù))、后肢站立次數(shù)。

    1.5 小鼠(子代)海馬錐體神經(jīng)元結(jié)構(gòu)觀察 采用高爾基染色法。對(duì)照組、模型組小鼠(子代)各取3只,斷頭處死,取腦組織并用紙巾輕輕擦拭,采用聚乙二醇包埋,置于-20℃冷凍切片,切片厚度100 μm,采用黏附載玻片貼片,避光,于30 min內(nèi)進(jìn)行高爾基染色。避光,蒸餾水洗2次,4 min/次;用吸水紙輕輕吸去多余水分,將工作液滴于組織上,室溫下放置12 min,蒸餾水洗2次,4 min/次;不同乙醇梯度脫水,二甲苯透明,中性樹膠封固。在電子顯微鏡下觀察,膠質(zhì)細(xì)胞的胞體呈棕黑色或黑色為神經(jīng)元染色結(jié)果,使用Image系統(tǒng)計(jì)算錐體神經(jīng)元數(shù)量。

    1.6 小鼠(子代)腦皮層神經(jīng)遞質(zhì)水平檢測 采用高效液相色譜法。對(duì)照組、模型組小鼠(子代)各取3只,斷頭處死,取出腦皮層樣本并分別稱取60 mg進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。加入 800 μl甲醇乙腈溶液(1∶1,v/v),渦旋 60 s;低溫超聲30 min,共2次,-20℃放置1 h;14 000 r/min、4℃離心20 min,取上清液;冷凍干燥,-80℃保存樣本。采用高效液相色譜法測定GABA、5-HT和多巴胺水平。

    1.7 兩組小鼠(子代)腦組織Arc、EGR2和S-100a9蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blot法。對(duì)照組、模型組小鼠(子代)各取3只,斷頭處死,取0.1 mg腦組織,加入 500 μl裂解液,充分勻漿;4 ℃、11 000 r/min離心20 min,將上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5 ml離心管中,置于-80℃保存;采用BCA法測定蛋白濃度。配置十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠,上樣,電泳(先80 V 30 min,再120 V 60~70 min);將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜,5%脫脂牛奶封閉1 h;過夜孵育一抗;TBST洗一抗;室溫孵育二抗1 h;TBST洗二抗6~7次,6 min/次;曝光顯色。蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示,組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 兩組小鼠(子代)理毛實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 模型組小鼠(子代)理毛次數(shù)為(25.67±6.51)次,明顯多于對(duì)照組小鼠(子代)的(7.31±3.24)次,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    2.2 兩組小鼠(子代)水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 兩組小鼠(子代)第1天潛伏時(shí)間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);而第 2、3、4、5天模型組小鼠(子代)潛伏時(shí)間均明顯長于對(duì)照組小鼠(子代),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均 P<0.05),見表 1。

    表1 兩組小鼠(子代)潛伏時(shí)間比較(s)

    2.3 兩組小鼠(子代)曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 模型組小鼠(子代)總運(yùn)動(dòng)距離明顯短于對(duì)照組小鼠(子代),且穿越格子次數(shù)、后肢站立次數(shù)均明顯少于對(duì)照組小鼠(子代),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見表2。

    表2 兩組小鼠(子代)曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

    2.4 兩組小鼠(子代)海馬錐體神經(jīng)元結(jié)構(gòu)比較 模型組小鼠(子代)較對(duì)照組小鼠(子代)的海馬錐體神經(jīng)元胞體萎縮,錐體神經(jīng)元數(shù)量明顯減少[(0.06±0.04)個(gè)/μm 比(0.32±0.11)個(gè)/μm],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖 1。

    圖1 兩組小鼠(子代)海馬錐體神經(jīng)元高爾基染色所見(電子顯微鏡下,×1 000)

    2.5 兩組小鼠(子代)腦皮層神經(jīng)遞質(zhì)水平比較 模型組小鼠(子代)腦皮層GABA、5-HT水平均高于對(duì)照組小鼠(子代),而多巴胺水平明顯低于對(duì)照組小鼠(子代),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見表3。

    表3 兩組小鼠(子代)神經(jīng)遞質(zhì)水平比較(nmol/g)

    2.6 兩組小鼠(子代)腦組織 Arc、EGR2、S-100a9蛋白表達(dá)水平比較 模型組小鼠(子代)腦組織Arc、EGR2蛋白表達(dá)水平均高于對(duì)照組小鼠(子代),而S-100a9蛋白表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組小鼠(子代),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見圖2和表4。

    表4 兩組小鼠(子代)腦組織Arc、EGR2和S-100a9蛋白表達(dá)水平比較

    圖2 兩組小鼠(子代)腦組織Arc、EGR2和S-100a9蛋白表達(dá)的電泳圖

    3 討論

    自閉癥是一種神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙疾病,起病于嬰幼兒期,一般在3歲前發(fā)病,嚴(yán)重影響兒童的健康,甚至對(duì)其成年后的學(xué)習(xí)、工作和生活均有深遠(yuǎn)影響[8]。近年來,自閉癥患病率呈不斷上升趨勢(shì)[9]。新生兒出生后早期有一段特定時(shí)間窗,其大腦能非常敏銳地感知外界環(huán)境刺激并獲取外部信息,這段時(shí)期為腦發(fā)育的關(guān)鍵期[10]。研究表明,在新生兒腦發(fā)育關(guān)鍵期的經(jīng)歷可以塑造大腦神經(jīng)環(huán)路,對(duì)其成年后的認(rèn)知、情感及行為均有影響[11]。生命早期應(yīng)激被認(rèn)為是多種精神疾病的重要風(fēng)險(xiǎn)因素。針對(duì)哺乳動(dòng)物母嬰關(guān)系在早期生長發(fā)育、學(xué)習(xí)認(rèn)知和社交行為中的重要作用,早期母愛剝奪被認(rèn)為是早期應(yīng)激事件之一。根據(jù)靈長類動(dòng)物以及人類的研究結(jié)果,早期母愛剝奪會(huì)影響個(gè)體的神經(jīng)發(fā)育和行為表現(xiàn),且這些影響可能持續(xù)一生[12]。新生幼鼠的早期生長主要依賴于母鼠所提供的溫暖、營養(yǎng)與庇護(hù),母嬰聯(lián)系在出生后2周內(nèi)尤為重要。以嚙齒類動(dòng)物(大鼠、小鼠)母子分離實(shí)驗(yàn)?zāi)M人類生命早期母子分離的特征,已成為研究早期經(jīng)歷影響個(gè)體發(fā)育的主要模型[13]。既往實(shí)驗(yàn)表明,早期母子分離可導(dǎo)致大鼠、小鼠行為學(xué)發(fā)生改變,這些改變呈現(xiàn)出自閉癥類似行為,如經(jīng)歷早期母子分離的小鼠自發(fā)活動(dòng)減少,社交行為受損,同時(shí)焦慮、抑郁類似行為明顯增加[14-15]。

    本實(shí)驗(yàn)建立了自閉癥小鼠模型,結(jié)果表明與對(duì)照組小鼠(子代)比較,模型組小鼠(子代)理毛次數(shù)明顯增多,第2、3、4、5天潛伏時(shí)間明顯延長,總運(yùn)動(dòng)距離明顯縮短,穿越格子次數(shù)及后肢站立次數(shù)均明顯減少。這提示模型組小鼠(子代)存在社交障礙、探索能力異常等。此外,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模型組小鼠(子代)錐體神經(jīng)元數(shù)量少于對(duì)照組小鼠(子代),提示模型組小鼠(子代)的海馬錐體神經(jīng)元胞體萎縮。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,突觸傳遞最重要的方式是基于神經(jīng)遞質(zhì)的神經(jīng)化學(xué)傳遞。近年來研究發(fā)現(xiàn),神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制中的作用備受關(guān)注[16],GABA、5-HT和多巴胺是重要神經(jīng)遞質(zhì)指標(biāo)。有研究發(fā)現(xiàn),神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者發(fā)作期血液中GABA、5-HT水平均明顯升高,而多巴胺水平明顯降低[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組小鼠(子代)腦皮層GABA、5-HT水平明顯升高,而多巴胺水平明顯降低,提示自閉癥模型小鼠存在神經(jīng)遞質(zhì)水平改變。進(jìn)一步檢測腦組織Arc、EGR2、S-100a9蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),模型組小鼠(子代)Arc、EGR2蛋白表達(dá)水平明顯升高,而S-100a9蛋白表達(dá)水平明顯降低。這提示自閉癥模型小鼠存在行為學(xué)異常和神經(jīng)遞質(zhì)水平改變,可能與Arc、EGR2蛋白表達(dá)上調(diào)、S-100a9蛋白表達(dá)下調(diào)的機(jī)制有關(guān),但有待后續(xù)研究作進(jìn)一步證實(shí)。

    綜上所述,自閉癥模型小鼠存在行為學(xué)異常和神經(jīng)遞質(zhì)水平改變,可能與Arc、EGR2蛋白表達(dá)上調(diào)、S-100a9蛋白表達(dá)下調(diào)的機(jī)制有關(guān)。但本研究也存在一定的局限性,今后仍需開展多中心、多樣本的研究,以提供更可靠的參考依據(jù)。

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