綿羊ZAP基因克隆與生物信息學分析

湯傲星，王 勇，董丹丹，繆秋紅，朱 杰，戚睿斌，郭宏元，劉光清

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2.安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，合肥 230000）

鋅指抗病毒蛋白（zinc finger antiviral protein,ZAP）是多種逆轉(zhuǎn)錄病毒的限制性因子。ZAP由IFN刺激的基因（interferon stimulated gene,ISG）ZC3HAV1編碼[1]。最初是從抗莫洛尼鼠白血病病毒（Murine leukemia virus,MLV）細胞中篩選cDNA文庫中，鑒定出編碼CCCH型ZAP蛋白[2]。隨后，研究發(fā)現(xiàn)ZAP可靶向其他RNA病毒，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒科（HIV-1、MoLV和XMRV）、絲狀病毒科（埃博拉病毒和馬爾堡病毒）、披膜病毒科病毒（甲病毒、辛德比斯病毒、塞姆利基森林病毒和羅斯河病毒）和嗜肝病毒科病毒[3-8]。此外研究發(fā)現(xiàn)，ZAP也可以抑制雙鏈DNA鼠γ皰疹病毒[9]，但對水泡性口炎、脊髓灰質(zhì)炎病毒、黃熱病和單純皰疹Ⅰ型病毒無效[3]。同時，ZAP也被報道限制人類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子[10]。由于ZAP直接靶向病毒mRNA，通過與具有ZAP反應元件（ZAP responsive element,ZRE）的病毒特異性序列結(jié)合，直接與病毒RNA相互作用[11]，并募集處理RNA的外泌體以降解靶向病毒RNA[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，過表達ZAP是通過募集細胞mRNA降解機制來抑制HIV-1的復制[8,13]。ZAP可以螯合eIF4G，阻止其與eIF4A的相互作用并導致病毒mRNA的翻譯抑制，這是病毒mRNA降解的先決條件[8]。在對HIV-1 mRNA進行翻譯抑制之后，ZAP通過其輔因子p72/DDX17募集poly（A）特異性核糖核酸酶（poly（A）-specific ribonuclease,PARN）或去除酶來去除poly（A）尾巴[11]。外泌體靶向病毒RNA，并通過Xrn1從暴露的5′ 末端降解RNA。同樣，ZAP還招募外泌體復合物，導致3′至5′的mRNA降解[14]。最近，發(fā)現(xiàn)一種E3泛素和ISG15連接酶TRIM25是ZAP的輔助因子，負責RIG-Ⅰ的多泛素化和活化，TRIM25協(xié)助ZAP阻止辛德比斯病毒（Sindbis virus,SINV）的復制[15]。近些年許多工作都集中在ZAP作用機制上，該機制是多方面的，涉及不同的細胞途徑。事實上，ZAP結(jié)合病毒RNA抑制病毒的作用已經(jīng)得到了認可，但ZAP如何廣泛識別外源RNA的機制尚不清楚。

在我國綿羊是重要的經(jīng)濟動物，病毒對綿羊的感染會造成重大的經(jīng)濟損失。目前關于羊源宿主限制性因子的研究報道較少。本研究旨在克隆出oZAP的CDS區(qū)序列，并進行生物信息學分析，為繼續(xù)研究該蛋白抗病毒作用提供生物信息學基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 E.coli Trans5α感受態(tài)細胞購和凝膠純化試劑盒購自南京諾唯贊生物技術有限公司；pC MYMYC載體由實驗室保存；UniQ-10柱式總RNA抽提試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 引物設計合成 根據(jù)綿羊ZAP基因（GenBank登錄號：XM_027968858）序列設計特異性引物，引物由生 工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物F：5′-CGCGTCGACCATGGCGGACCCCGGGGT GTGCAG-3′；下游引物R：5′-CCTCATGACGGCC AGCACCCTTCTGTCCATCAGGTT-3′。

1.3 RNA提取 采用RT-PCR方法提取綿羊肺細胞的總RNA（具體操作參照生工生物工程（上海）公司RNA抽提試劑盒操作說明書。

1.4 PCR反應與基因克隆 以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模版，用Ex Taq DNA聚合酶進行PCR擴增oZAP基因，PCR反應體系為：模板DNA2.0 μL,Ex Taq Mix 25 μL,上、下游引物（10 mmol/L）各2 μL，加ddH2O至50 μL。PCR擴增條件為：95℃預變性3 min;95℃變性1 min，58℃退火30 s，72℃延伸3 min，共34個循環(huán)；72℃延伸10 min。同時設立陰性對照，不加模板。取PCR擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并膠回收目的片段。擴增產(chǎn)物純化后同源重組至pCMY-MYC載體，轉(zhuǎn)化至Trans5α感受態(tài)細胞，經(jīng)過抗性篩選后進行序列測定。

1.5 生物信息學分析 利用ExPASy的ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）在線軟件對oZAP蛋白的理化性質(zhì)分析；利用ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）預測oZAP基因編碼蛋白的疏水性；分別利用NetPhos 3.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）和NetNGlyc 1.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）預測oZAP蛋白磷酸化位點和糖基化位點；分別利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）和SWISS-MODEL（https://www.swissmodel.expasy.org）預測蛋白結(jié)構(gòu)；利用EMBL-EBL（https://www.embl.org）預測oZAP蛋白的功能結(jié)構(gòu)域。

2 結(jié)果 與討論

2.1 oZAP基因的獲得 從羊脾臟中提取的RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄為cDNA進行PCR擴增（圖1）。對重組質(zhì)粒進行菌液測序，得到了為2697 bp ZAP基因序列，測序結(jié)果與目的序列一致，同源性達到100%。

圖1 oZAP基因的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of oZAP gene

2.2 oZAP生物信息學分析 生物信息學分析oZAP蛋白的理化性質(zhì)分析，預測該蛋白的分子質(zhì)量為100.76957 kDa，分子式為C4404H6856N1276O1345S49。理論等電點為8.57，898個氨基酸中，酸性氨基酸（天冬氨酸和谷氨酸）97個，堿性氨基酸（精氨酸和賴氨酸）110個；其中絲氨酸（Ser） 含量最高（11.0%），色氨酸（Trp）含量最低（1.3%）。該蛋白在體外理論半衰期為 30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為53.61，為不穩(wěn)定蛋白；總 脂肪酸為64.05，親水總平均值為-0.605，屬于親水性蛋白。

分別利用SignalP 5.0 Server和TMHMM Server v.2.0預測 oZAP蛋白的信號肽和跨膜區(qū)，結(jié)果見圖2。 oZAP蛋白C、Y、S平均值分別為0.193、0.171、0.311及0.194，表明該蛋白不存在跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)。oZAP蛋白不存在信號肽序列，推測該蛋白可以較高量和可溶性表達，為獲得可溶性的oZAP蛋白奠基了理論基礎。

圖2 oZAP蛋白信號肽和跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預測Fig.2 Prediction of oZAP protein signal peptide and the transmembrane structure

運用 NetPhos 3.1 Server和NetNGlyc 1.0軟件分別 預測oZAP蛋白磷酸化位點和糖基化位點，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，當潛在磷酸化位點的閾值為0.5時， oZAP蛋白存在114個潛在的磷酸化位點，其中包括77個絲氨酸位點、6個蘇氨酸位點和12個酪氨酸位點。oZAP蛋白含 有5個糖基化位點，NGSA、NHSD、NDSV、NISF、NPSV分別為0.7017、0.5367、0.5439、0.6350、0.6106。蛋白質(zhì)在翻譯后會經(jīng)過適當?shù)男揎椥纬沙墒斓鞍踪|(zhì)，其中磷酸化和糖基化是自然界中重要的翻譯后修飾。經(jīng)過生物信息學分析，oZAP蛋白的5個糖基化位點可能對其功能具有重要作用。

圖3 oZAP蛋白磷酸（A）和糖基化位點（B）預測Fig.3 Prediction of phosphate sites（A）and glycosylation sites（B）of oZAP protein

對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的分析和預測有助于了解氨基酸序列和三維構(gòu)象之間的聯(lián)系。利用SOPMA預測oZAP蛋白的二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)oZAP蛋白α-螺旋區(qū)域有240個氨基酸，占氨基酸的2 6.64%；參與延伸的氨基酸有131個，占氨基酸總數(shù)的14.54%；β-轉(zhuǎn)角區(qū)有53個氨基酸，占氨基酸的5.88%；參 與形成無規(guī)則卷曲的氨基酸有477個，占氨基酸總數(shù)的52.94%（圖4）。無規(guī)則卷曲是蛋白質(zhì)肽鏈中構(gòu)成配體/受體結(jié)合的活性部位，易受側(cè)鏈相互影響而改變空間構(gòu)象。oZAP蛋白二級結(jié)構(gòu)中大量的無規(guī)則卷曲可能影響蛋白質(zhì)肽鏈的活性，從而影響蛋白質(zhì)的功能。

圖4 oZ AP蛋白二級結(jié)構(gòu)預測Fig.4 Prediction of oZAP protein secondary structure

利用SWISS-MODEL和Phyrew 2.0對ZAP進行同源建模，表明羊源ZAP與鼠源ZAP蛋白模型的相似度為78.22%（圖5），并且也具有相似的四個CCCH型結(jié)構(gòu)域。利用EMB L-EBL預測oZAP蛋白的 功能域發(fā)現(xiàn)，該蛋白存在發(fā)揮抗病毒作用的CCC H型鋅指結(jié)構(gòu)，與ADP核糖基化蛋白結(jié)合的WWE區(qū)域，發(fā)揮催化作用的多聚ADP核糖（poly（ADP-ribose）polymerase,PARP）區(qū)域（圖6）。這與大部分發(fā)揮抗病毒作用的ZAP蛋白結(jié)構(gòu)基本一致，暗示oZAP具有抗病毒作用。CCCH鋅指結(jié)構(gòu)形成兩個特異的RNA相互作用的裂隙，并與外源RNA識別和結(jié)合相互作用[15]。在流感病毒上，研究發(fā)現(xiàn)ZAP的PAR P區(qū)域可以直接靶向流感病毒的PB2和PA蛋白，然后通過泛素化-蛋白酶體途徑降解[16]。也有研究報道ZAP的CCCH型鋅指結(jié)構(gòu)可以與PRRSV的NSP9互作，并且通過PARP區(qū)域泛素化降解NSP7、NSP9和NSP12來抑制PRRSV的復制[17]。

圖5 oZAP蛋白三維結(jié)構(gòu)模型Fig.5 oZAP protein three-dimensional structure model

圖6 oZAP蛋白功能結(jié)構(gòu)域預測Fig.6 Functional domain prediction of oZAP protein

綜上所述，本試驗成功克隆出oZAP基因的CDS序列，并利用生物信息學方法對該蛋白的功能域和結(jié)構(gòu)域進行了分析與預測，為進一步研究oZAP蛋白的抗病毒作用提供了一定的參考。