頂復(fù)門原蟲棒狀體蛋白疫苗候選分子的研究進展

孫蕓蕓，廖申權(quán)，李躍龍，呂敏娜，吳彩艷，李 娟，林栩慧，胡俊菁，肖文婉，孫銘飛，張健騑，曹 正，袁偉康，戚南山，顧有方

（1.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學與技術(shù)廣東省實驗室肇慶分中心、茂名分中心，廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學觀測實驗站，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部禽流感等家禽重大疾病防控重點實驗室，廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所，廣州 510640；2.安徽科技學院動物科技學院，鳳陽 233100；3.廣東省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，廣州 510013）

頂復(fù)門原蟲是一種專一性的胞內(nèi)寄生性原蟲，包括巴貝斯蟲（Babesia spp.）、剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）、艾美耳球蟲（Eimeria spp.）、隱孢子蟲（Cryptosporidium spp.）及瘧原蟲（Plasmodium spp.）等，是人和動物的重要病原，可引起人類和動物的多種疾病，不僅危害人類的生命健康，而且給畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[1-2]。目前對原蟲病的主要控制措施仍依賴于化學藥物療法，然而抗寄生蟲藥物既不能預(yù)防人和動物感染疾病，也不能清除感染宿主內(nèi)的蟲體，因此，篩選疫苗候選分子、研制新型有效疫苗迫在眉睫。近年來諸多研究發(fā)現(xiàn)，頂端復(fù)合器在頂復(fù)門原蟲入侵宿主細胞過程中發(fā)揮重要作用，其中棒狀體是頂復(fù)合器的重要構(gòu)件，在蟲體入侵宿主細胞時棒狀體能夠分泌相關(guān)蛋白分子，促進納蟲空泡（parsitophorous vacuole,PV）的形成[3]。在已鑒定的主要原蟲抗原中，棒狀體蛋白被認為是一種最具潛力的候選疫苗[4]，對入侵過程以及宿主細胞的存活都至關(guān)重要。本文以棒狀體蛋白研究為基礎(chǔ)，綜述了近年來棒狀體蛋白在頂復(fù)門原蟲疫苗中的研究進展。

1 棒狀體蛋白

棒狀體是所有頂復(fù)門原蟲共有的一種獨特分泌型細胞器，其外形似棒狀，由兩個不同的部分：前導(dǎo)管（頸部）和后球莖（基部）組成[5]，由電子致密的嗜鋨酸物質(zhì)（osmiophilic）構(gòu)成[6]。近年來研究人員利用蛋白質(zhì)組學和基因組學方法對弓形蟲和其他頂復(fù)門原蟲棒狀體的含量進行了識別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)包含38個棒狀體蛋白[7]，其中20個蛋白定位于棒狀體細胞器：包括9個棒狀體頸部蛋白（rhoptry neck proteins,RONs）和11個棒狀體基部蛋白（rhoptry proteins,ROPs）。

目前對棒狀體蛋白功能的研究中發(fā)現(xiàn)，在頂復(fù)門原蟲入侵宿主細胞的過程中，棒狀體蛋白起著關(guān)鍵作用：如一些棒狀體頸部蛋白（如RON2、RON4、RON5和RON8等）可與微線分泌的頂膜抗原（apical membrane antigen,AMA）相互作用，在蟲體頂端和宿主細胞膜接觸部位形成“運動結(jié)合體（moving junction,MJ）”，隨后包圍著蟲體緩慢進入宿主細胞，并向后滑動形成納蟲空泡并完成入侵過程。此外，在對弓形蟲棒狀體蛋白的研究中，Molina等[8]發(fā)現(xiàn)，一些ROP蛋白（如ROP5、ROP16和ROP18等）被稱為ROP激酶，作為絲氨酸-蘇氨酸激酶發(fā)揮作用，在寄生蟲的毒力和致病性以及宿主細胞調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，棒狀體蛋白有望成為抗弓形蟲等頂復(fù)門原蟲病的疫苗候選分子，加強對其生物學特性及作用機制的研究將為寄生蟲病的防控提供新的思路。

2 棒狀體基部蛋白及其在頂復(fù)門原蟲疫苗中的研究

2.1 棒狀體基部蛋白概述 棒狀體基部蛋白又稱為棒狀體蛋白激酶，其為適應(yīng)不同蟲體的不同發(fā)育方式而呈現(xiàn)出異質(zhì)性和保守性差等特點[9]。該類蛋白種類繁多，一般分為ROP1和ROP2蛋白家族，其中ROP1作為穿透增強因子（penetration enhancing factor,PEF）在1966年首次被發(fā)現(xiàn)，在蟲體入侵過程中起到聯(lián)系宿主胞膜的作用，是頂復(fù)門原蟲毒力關(guān)鍵因子[10-11]；ROP2蛋白家族，包括ROP2、ROP3、ROP4、ROP8以及ROP18等5種蛋白，該家族擁有絲氨酸-蘇氨酸的激酶活性結(jié)構(gòu)域，在蟲體侵入宿主細胞的過程中分泌ROPs，有助于PV的形成，且分泌后能迅速與納蟲空泡膜（parasitophorous vacuole membrane,PVM）結(jié)合并參與PVM功能的調(diào)節(jié)[12-13]。

2.2 棒狀體基部蛋白在弓形蟲疫苗中的研究 頂復(fù)門原蟲生活史非常復(fù)雜，存在多個抗原表位。目前研究較多的是基于TgROPs的疫苗在不同小鼠模型中的應(yīng)用。其中DNA疫苗是一種利用質(zhì)粒載體來轉(zhuǎn)移和表達靶基因的新方法[14]。大量研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DNA疫苗可以激發(fā)和誘發(fā)特定的細胞和體液免疫反應(yīng)[15]。多數(shù)學者通過構(gòu)建ROP1、ROP2、ROP4、ROP13、ROP17和ROP18等DNA疫苗對幼鼠進行免疫，結(jié)果顯示幼鼠CD4+T和CD8+細胞比例可明顯升高[16]。這些DNA疫苗已成為頂復(fù)門原蟲疫苗研究的重要疫苗候選分子。

2.2.1 TgROP1 在弓形蟲核酸疫苗研制中，基因佐劑已成為增強DNA疫苗保護效能的有效工具。IL-12是控制、限制急性和慢性弓形蟲病的關(guān)鍵促炎細胞因子[17]。Quan等[18]將IL-12+pGRA7-ROP1聯(lián)合應(yīng)用于BALB/c小鼠可延長其生存時間，其中在接種致死劑量后28 d內(nèi)，50%小鼠存活，此外，腦組織囊腫的數(shù)量明顯減少。Parthasarathy等[19]通過對核酸及重組蛋白疫苗進行了對比，將重組的pVAX1-ROP1和純化的rROP1分別注射到不同的小鼠體中，經(jīng)免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)，ROP1是一種免疫原性抗原，可誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，并在免疫小鼠血清中檢測到目的蛋白條帶。不僅如此，接種ROP1抗原后，小鼠對強毒株速殖子的感染具有部分保護作用。這些結(jié)果表明，ROP1抗原是開發(fā)弓形蟲病疫苗的潛在候選抗原。

2.2.2 TgROP2 Leyva等[20]在真核表達載體pcDNA3中克隆ROP2基因，得到pcDNA3-ROP2重組質(zhì)粒，并將該質(zhì)粒免疫BLAB/c、C57BL/6和CBA/J小鼠，觀察誘發(fā)的小鼠免疫反應(yīng)。通過酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）和免疫印跡（Western blot,WB）分析顯示，pcDNA3-ROP2重組質(zhì)粒誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生了細胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答。其中與空白對照組相比，BALB/c小鼠的死亡時間明顯延遲。同時還發(fā)現(xiàn)該重組質(zhì)粒免疫的小鼠對剛地弓形蟲RH強毒株攻擊沒有抵抗，而用減毒活疫苗溫度敏感株ts-4免疫的小鼠產(chǎn)生保護作用。Vanesa等[21]研究結(jié)果表明，混合免疫rROP2+CpG-ODN可引起強烈的體液反應(yīng)和Th1-biased免疫反應(yīng)，免疫rROP2+CpG-ODN和rROP2+rGRA4+CpG-ODN的C3H/HeN（H-2k）小鼠在口服20個Me49（Ⅱ型）組織囊腫后， 其腦囊腫負擔分別減輕63%和66%。以上研究結(jié)果表明，ROP2可以作為預(yù)防弓形蟲感染的疫苗候選分子。

2.2.3 TgROP4 與ROP2一樣，在弓形蟲入侵宿主細胞過程中，ROP4參與PV功能的調(diào)節(jié)，在宿主細胞的黏附、入侵和細胞內(nèi)的復(fù)制等方面有著密切的關(guān)系[22]。Dziadek等[23]利用rROP2和rROP4蛋白疫苗免疫C3H/HeJ小鼠，觀察其對小鼠免疫效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種抗原均產(chǎn)生了對IgG1特異性抗體的體液反應(yīng)和混合型Th1/Th2細胞免疫反應(yīng)，表明其有較好的免疫原性。不僅如此，接種rROP2和rROP4疫苗的弓形蟲弱毒株DX株包囊小鼠具有部分保護作用，腦寄生蟲負荷顯著降低。目前對ROP4疫苗的研究相對較少，但發(fā)現(xiàn)ROP4具有調(diào)節(jié)宿主細胞蛋白質(zhì)磷酸化的功能，能產(chǎn)生良好的免疫保護作用。

2.2.4 TgROP5 ROP5是弓形蟲的主要毒力因子，參與細胞內(nèi)增殖。該蛋白可顯著降低PVM中免疫相關(guān)GT-Pases的積累，從而維持PVM的完整性。為評價重組rROP5的保護作用機制，Zheng等[24]以rROP5蛋白對BALB/c小鼠進行三次免疫，首次以100 μg rROP5混勻弗氏完全佐劑進行免疫，二免和三免分別為100 μg rROP5混勻弗氏不完全佐劑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，rROP5可以誘導(dǎo)顯著的細胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)（Th1/Th2）。此外，用rROP5免疫的小鼠對剛地弓形蟲RH株的致命挑戰(zhàn)表現(xiàn)出較長的生存時間?？梢?，rROP5可有效保護小鼠抵抗弓形蟲的入侵。

2.2.5 TgROP13 Wang等[25]通過構(gòu)建pVAX-ROP13和以IL-18為基因佐劑的pVAX-ROP13DNA疫苗，評價TgROP13的免疫原性和免疫保護作用機制。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pVAX-ROP13和pIL-18共免疫使小鼠存活率顯著提高。單獨使用pVAX-ROP13和抗強毒RH株（Ⅰ型）存活時間分別為32.3±2.7 d、24.9±2.3 d（P＜0.05）。用PRU蟲株（Ⅱ型）攻毒后，pVAXROP13和pVAX-ROP13+pVAX-IL-18免疫小鼠腦囊腫負荷降低率分別為39.82%和66.03%。這表明以IL-18為基因佐劑的ROP13 DNA疫苗可以引發(fā)對寄生蟲的強烈體液和細胞反應(yīng)，被認為是一種潛在的有效候選疫苗。

2.2.6 TgROP17 許多研究結(jié)果表明，特異性分泌免疫球蛋白A（secretory immunoglobulin A,SIgA）在粘膜表面起著關(guān)鍵作用，是防御弓形蟲等多種粘膜組織感染的第一道防線[26]。Wang等[27]將RH株弓形蟲ROP17在細菌中與谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶（Glutathione-S-transferase,GST）融合表達，采用rTgROP17對BALB/c小鼠進行滴鼻免疫，研究其對慢性和急性弓形蟲感染的免疫應(yīng)答和保護作用。結(jié)果表明，經(jīng)過rTgROP17免疫的小鼠產(chǎn)生了高水平的特異性抗rTgROP17 IgGs，增加系統(tǒng)性免疫反應(yīng)有關(guān)Th1（IFN-c、IL-2）和Th2（IL-4）的含量，且增強rTgROP17免疫小鼠淋巴細胞增殖（刺激指數(shù)SI）。在這些小鼠的鼻腔和腸道沖洗液中也觀察到鼻粘膜免疫反應(yīng)增強，TgROP17促使特異性分泌型IgA（SIgA）分泌增加。與對照組相比，接種疫苗的小鼠肝臟和大腦寄生蟲負擔較低，分別為59.17%和49.08%，對慢性RH感染表現(xiàn)出明顯的保護作用。接種疫苗的小鼠對致命的RH毒株感染也表現(xiàn)出明顯的保護作用，其存活率增加了50%。

2.2.7 TgROP18 ROP18作為弓形蟲的主要毒力因子，參與控制寄生蟲的細胞內(nèi)增殖[28]。Yuan等[29]研究結(jié)果表明該蛋白是一種具有前景的候選疫苗，用質(zhì)粒構(gòu)建的pVAX-ROP18在昆明小鼠肌肉內(nèi)免疫可引起特異性體液反應(yīng)，促進淋巴細胞增殖，并增加了CD4+和CD8+T細胞的活化。與對照組相比，接種1×103株RH株速殖子后，pVAX-ROP18的存活時間（27.9±15.1 d，P＜0.05）明顯延長。Rashid等[30]采用rTgROP18對BALB/c小鼠進行滴鼻免疫，結(jié)果顯示，有抗ROP18 IgG1抗體產(chǎn)生并發(fā)生混合的系統(tǒng)性Th1/Th2型細胞免疫應(yīng)答，其特征在于產(chǎn)生了IFN-γ、IL-2、IL-10和IL-5，但是鼻粘膜免疫反應(yīng)較弱。因此，鼻內(nèi)免疫rROP18可以強烈地激發(fā)全身免疫應(yīng)答和粘膜免疫應(yīng)答，對攻蟲小鼠起到免疫保護作用。

2.2.8 TgROP19 隨著生物信息學被廣泛應(yīng)用，表位預(yù)測成為免疫原性設(shè)計和逆轉(zhuǎn)疫苗學中不可或缺的工具[31]。對ROP候選疫苗進行數(shù)據(jù)庫檢索，利用生物信息學分析潛在的B細胞表位和T細胞表位，從而引入新的弓形蟲候選疫苗。Zhou等[32]通過對ROP19和SAG1的抗原特性進行分析比較，發(fā)現(xiàn)ROP19在抗原指數(shù)和表面概率上均優(yōu)于SAG1，與SAG1相比，ROP19具有良好的線性B細胞表位。此外，還預(yù)測了與ROP19的MHCⅡ類分子結(jié)合的多肽的50%抑制濃度（IC50）值，并估算了ROP19的較低的IC50值，表明ROP19具有活的T細胞表位，將來可能成為防控弓形蟲病的潛在DNA疫苗候選分子。

2.3 棒狀體蛋白在其他頂復(fù)門原蟲疫苗中的研究 在隱孢子蟲棒狀體蛋白的研究中，Huang等[33]通過蛋白質(zhì)組技術(shù)分離獲得22種潛在的棒狀體蛋白，并鑒定出與剛地弓形蟲和犬新孢子蟲棒狀體蛋白同源的蛋白，以及一些結(jié)構(gòu)域類似于剛地弓形蟲棒狀體蛋白的蛋白，同時證實了這22種候選的棒狀體蛋白可作為研究寄生蟲入侵途徑和致病機制的靶點，在抵抗隱孢子蟲病的感染中發(fā)揮重要作用。

在綿羊巴貝斯蟲的研究中，Niu等[34]通過構(gòu)建RAP-1a重組抗原，經(jīng)ELISA和Western blot結(jié)果顯示，該抗原與被其他病原體感染的動物血清間沒有交叉反應(yīng)，對RAP-1a的高水平抗體滴度一直持續(xù)到感染后10周，可見羊巴貝斯蟲RAP-1a的重組抗原在寄生蟲入侵過程中發(fā)揮重要的作用，是抵抗巴貝斯蟲病感染的重要候 選疫苗和診斷抗原。Collins等[35]通過亞馬遜松鼠猴對惡性瘧原蟲棒狀體蛋白RAP1和RAP2進行疫苗試驗，比較寄生蟲源（PfRAP 1和2）和重組蛋白（rRAP1和2）誘導(dǎo)保護性免疫反應(yīng)的效果。結(jié)果表明，含有瘧原蟲棒狀體相關(guān)蛋白RAP1和RAP2的疫苗對亞馬遜松鼠猴的療效有著明顯效果，并證實了ROP1和ROP2是惡性瘧原蟲的潛在候選疫苗。這些研究結(jié)果將為下一步抗瘧疾疫苗的研制提供數(shù)據(jù)，打下理論基礎(chǔ)。

3 棒狀體頸部蛋白及其在頂復(fù)門原蟲疫苗中的研究

3.1 棒狀體頸部蛋白 研究人員在1980年首次發(fā)現(xiàn)并鑒定了瘧原蟲棒狀體頸部蛋白，該蛋白由此被廣泛關(guān)注[36]。目前，對棒狀體頸部蛋白的研究仍然較少，普遍認為其是一類比棒狀體基部蛋白更保守的蛋白[37]。在對艾美耳球蟲棒狀體細胞器的研究中，研究人員利用蛋白質(zhì)組技術(shù)分離獲得一組新的棒狀體蛋白，由于這些蛋白位于棒狀體的頸部被命名為棒狀體頸部蛋白，主要包括RON1-8等8種棒狀體頸部蛋白，這些蛋白通常被注釋為藥物治療或免疫預(yù)防的靶標分子[38]。在頂復(fù)門原蟲棒狀體頸部蛋白的功能研究中發(fā)現(xiàn)，RON2被認為在蟲體入侵宿主細胞過程中起著最關(guān)鍵的作用：當蟲體子孢子或速殖子黏附至宿主細胞時，蟲體會迅速分泌RON2，插入宿主細胞膜表面，與宿主細胞相應(yīng)受體作用，同時與RON4、RON5和RON8蛋白，以及微線分泌的頂膜抗原AMA1發(fā)生特異性結(jié)合，在宿主表面形成環(huán)狀的MJ，蟲體通過“MJ”在數(shù)秒或數(shù)十秒內(nèi)入侵至宿主細胞內(nèi)發(fā)育繁殖[39]。因此，棒狀體頸部蛋白在細胞中可驅(qū)動寄生蟲的移動連接，在結(jié)構(gòu)功能上將蟲體與宿主細胞串聯(lián)起來，對于蟲體入侵至關(guān)重要。

3.2 棒狀體頸部蛋白在頂復(fù)門原蟲疫苗中的研究 近年來，人們對頂復(fù)門原蟲入侵宿主細胞機制有了大量的研究，發(fā)現(xiàn)RONs是關(guān)鍵毒力因子，對蟲體入侵宿主細胞起著關(guān)鍵作用，可作為潛在的疫苗候選分子。

3.2.1 RON2 RON2蛋白是一類重要的入侵相關(guān)蛋白，Delgadillo等[40]研究表明，在頂復(fù)門不同屬種的原蟲基因組數(shù)據(jù)庫中均存在RON2的同源編碼基因，蛋白結(jié)構(gòu)保守，由1段信號肽、3段跨膜結(jié)構(gòu)及4段功能結(jié)構(gòu)域組成。戚南山等[41]利用生物信息學技術(shù)對E.tenella中存在TgRON2的同源蛋白棒狀體頸部蛋白2（E.tenella rhoptry neck protein 2,EtRON2）的基因序列進行分析，結(jié)果顯示EtRON2與其他原蟲棒狀體蛋白的氨基酸序列具有一定的相似性，與TgRON2的進化關(guān)系最為接近，說明EtRON2在入侵宿主細胞過程中起著關(guān)鍵作用。王曄等[42]構(gòu)建EtRON2基因的重組真核表達質(zhì)粒pCAGGs-EtRON2鑒定EtRON2基因的表達情況。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IFA顯示轉(zhuǎn)染的293T細胞中檢測到特異性紅色熒光，Western blot結(jié)果分析具有良好的抗原性。在間日瘧原蟲的研究中，Arevalo-Pinzon等[43]首次鑒定了PvRON2，PvRON2是由單個6615 bp外顯子編碼的2204個殘基長蛋白，該外顯子包含對氨基末端的疏水信號序列、對羧基末端的跨膜結(jié)構(gòu)域和兩個螺旋卷曲的α-螺旋基序，與其他幾種瘧疾候選疫苗的特征類似。在弓形蟲的研究中發(fā)現(xiàn)，蟲體接觸宿主細胞后會分泌RON2蛋白，其氨基端兩段結(jié)構(gòu)域與RON4、5、8形成復(fù)合物插入宿主細胞膜內(nèi)，與宿主受體互作[44]，羧基端兩段結(jié)構(gòu)域暴露在宿主細胞膜外，與微線分泌的頂膜抗原AMA結(jié)合，從而形成由RON2、4、5、8及AMA共同組成的蛋白復(fù)合物“運動結(jié)合體”，介導(dǎo)蟲體對宿主細胞的入侵[45]。綜上所述，RON2參與了蟲體對宿主細胞的入侵，為最具潛力的棒狀體頸部蛋白候選疫苗分子。

3.2.2 RON4 Alexander等[46]在瘧原蟲的研究中發(fā)現(xiàn)TgRON4的瘧原蟲同源物可與頂膜抗原1（plasmodium falciparum apical membrane antigen 1,PfAMA1）免疫共沉淀，最后鑒定為PfRON4。其功能是在蟲體入侵宿主細胞過程中與PfAMA1發(fā)生特異性結(jié)合，并形成復(fù)合體在移動連接體處遷移，該發(fā)現(xiàn)表明PfRON4蛋白對于蟲體入侵宿主細胞過程中起著重要的作用。Rashid等[47]通過對小鼠接種RON4的DNA疫苗和RON4重組蛋白，進行動物免疫保護性實驗，觀察其抗弓形蟲感染的保護效果，結(jié)果顯示兩者均產(chǎn)生了IgG1特異性抗體以及混合型的Th1/Th2的細胞免疫應(yīng)答，同時，IFN-γ、IL-2、IL-5和IL-10等細胞因子均顯著增加，但是小鼠抵抗慢性弓形蟲病的能力較弱。

3.2.3 RON5 在弓形蟲和瘧原蟲的研究中都表明RON5是MJ的成員蛋白之一[48]，在宿主細胞和蟲體之間起著連接作用，是寄生蟲入侵必需的關(guān)鍵蛋白。Zhao等[49]構(gòu)建了RON5蛋白真核表達的重組質(zhì)粒pVAX5-RON5p，并免疫BALB/c小鼠，觀察其對弓形蟲急慢性感染的保護作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)pVAX5-RON5p免疫可引起小鼠體液免疫應(yīng)答和細胞免疫應(yīng)答，并且免疫組小鼠急性弓形蟲感染后生存時間比對照組略有延長。對于慢性弓形蟲感染，pVAX5-RON5p免疫小鼠的腦組織囊腫數(shù)比空白對照組減少25.8%。可見，RON5 DNA疫苗可以針對急性和慢性弓形蟲感染誘導(dǎo)部分免疫保護性。

3.2.4 RON8 Besteiro等[50]利用生物化學方法，確定RON8是MJ復(fù)合物的一個新成員，與TgAMA-1和RON2、4、5共同形成MJ，所有的MJ蛋白在被轉(zhuǎn)運到各自的細胞器的過程中都經(jīng)歷了蛋白水解的成熟過程，并且在體外以不成熟的形式結(jié)合。通過質(zhì)譜技術(shù)（mass spectrum,MS）分析發(fā)現(xiàn)RON8有2979個氨基酸，理論分子量為329 kDa。此外，在弓形蟲、新孢子蟲和艾美耳球蟲中都可以發(fā)現(xiàn)RON8，但在瘧原蟲中暫未發(fā)現(xiàn)其同源序列[51]。Straub等[52]通過缺失弓形蟲RON8蛋白編碼基因，首次對MJ/RON蛋白進行功能分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺失RON8的蟲體在對宿主細胞的附著和入侵方面都受到嚴重損害，這表明RON8能夠使寄生蟲在宿主細胞上建立牢固的結(jié)合，并進行入侵。另外，缺陷Δron8蟲體在入侵宿主細胞時，MJ復(fù)合物會出現(xiàn)紊亂的現(xiàn)象。因此，推測RON8在弓形蟲入侵宿主細胞以及MJ復(fù)合物形成的過程中發(fā)揮著重要作用。

3.2.5 RON9和RON10 目前有研究表明，剛地弓形蟲的兩個新棒狀體頸部蛋白：RON9和RON10，它們之間可形成一個高分子量復(fù)合物。與其他RON蛋白相比，這種復(fù)合物在入侵宿主細胞期間沒有在MJ中檢測到，可見，RON9和RON10與MJ復(fù)合物的形成無關(guān)。學者通過敲除RON9實驗，發(fā)現(xiàn)RON10在棒狀體內(nèi)發(fā)生錯位定位；若敲除RON10，則會影響RON9蛋白分泌到棒狀體，這表明RON9/RON10復(fù)合物的形成是相互作用的結(jié)果[53]。此外，還發(fā)現(xiàn)RON9/RON10復(fù)合物的缺失對棒狀體的形態(tài)、蟲體對宿主細胞的入侵和生長以及蟲體自身毒力都無顯著影響。但在球蟲和隱孢子蟲中，該復(fù)合物的缺失與蟲體在腸上皮細胞內(nèi)的發(fā)育有一定的關(guān)系。

4 展望

目前，頂復(fù)門原蟲侵入宿主細胞的詳細機制尚不明晰。隨著分子生物學、生物信息學和蛋白質(zhì)組學技術(shù)的快速發(fā)展，在分子水平上對棒狀體蛋白入侵過程的作用機制和功能的研究將逐漸深入。下一步可重點研究在蟲體入侵宿主細胞過程中，棒狀體蛋白的分泌及其與宿主細胞受體相互作用等的詳細機制及信號通路等。相信隨著棒狀體蛋白特性和功能的深入研究，頂復(fù)門原蟲入侵、致病機制將逐漸明了，這也為防控該類原蟲病疫苗及藥物的研發(fā)提供有效的信息，為更好防控原蟲病提供新的思路。