馬腺疫鏈球菌fneB基因LAMP檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

買占海，沙婭·奴爾蘭,2，王德超，張敖云圖雅，侯 宇，況 玲

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.伊犁州動(dòng)物疾病預(yù)防與控制中心，伊寧 835800）

馬腺疫通常由馬鏈球菌（Streptococcus equi,S.equi）馬亞種感染，可引起馬屬動(dòng)物的急性接觸性傳染病，典型病例的臨診特征為體溫升高，上呼吸道咽黏膜呈卡他性或化膿性炎癥，頜下淋巴結(jié)呈急性化膿性炎癥，屬于三類動(dòng)物疫病[1]。S.equi為鏈球菌屬C群成員。菌體呈橢圓形或球形，革蘭氏染色陽性，無運(yùn)動(dòng)性，能夠形成莢膜。S.equi的毒力因子包括透明質(zhì)酸、鏈球菌溶血素S、IgG結(jié)合蛋白、致熱外毒素、肽聚糖、抗 吞噬的類M蛋白和粘附因子纖粘蛋白結(jié)合蛋白[2]。細(xì)菌粘附素靶向纖粘蛋白（fibronectin,FN），是脊椎動(dòng)物細(xì)胞外基質(zhì)和血液中發(fā)現(xiàn)的主要糖蛋白[3]，其結(jié)合蛋白有3種：FNEB、FNE和SFS[4]，其中FNE和SFS為分泌型蛋白[5]，F(xiàn)NEB為細(xì)胞表面錨定型蛋白[6]，通過克隆序列分析發(fā)現(xiàn)FNEB是一個(gè)編碼475殘基Fn結(jié)合蛋白FNEB的基因，其具有革蘭氏陽性細(xì)胞表面蛋白（N-末端信號(hào)序列，殘基1-35）的典型特征和高度保守性，徐全圓等[2]已應(yīng)用FNEB基因分離出馬鏈球菌馬亞種。

馬腺疫疾病的臨床快速診斷至關(guān)重要，能夠準(zhǔn)確診斷患病馬匹并及時(shí)隔離，做好平時(shí)預(yù)防工作有助于防止馬腺疫傳播，可提高幼駒成活率減少經(jīng)濟(jì)損失。目前馬腺疫的鑒定仍然依靠傳統(tǒng)的臨床手段，馬腺疫病原菌馬鏈球菌馬亞種依舊用繁瑣耗時(shí)的培養(yǎng)方法來分離鑒定，這也是導(dǎo)致馬腺疫進(jìn)一步傳播的誘因[7]。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification assay,LAMP）是一種快速和高度特異性的基因擴(kuò)增方法，該方法比PCR方法更快，使用儀器簡(jiǎn)單，更容易操作[8]。建立具有特異性高、敏感性好、便捷快速特點(diǎn)的fneB-LAMP檢測(cè)方法，可為基層檢測(cè)馬腺疫疾病提供有效的診療手段。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 采集新疆昭蘇縣3個(gè)馬場(chǎng)發(fā)現(xiàn)疑似患馬腺疫的馬匹樣本，共采集樣品40份，其中A馬場(chǎng)采集14匹馬的鼻拭子，編號(hào)A1-A14；B馬場(chǎng)采集10匹馬的鼻拭子，編號(hào)B1-B10；C馬場(chǎng)采集14匹馬的鼻拭子14份，以及2匹下頜淋巴結(jié)破潰的膿汁2份，共16份樣品，編號(hào)C1-C16。

1.2 菌株來源 馬鏈球菌馬亞種N20和N25為新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室保藏菌；蠟狀芽孢桿菌和鏈球菌分離鑒定于本實(shí)驗(yàn)的馬腺疫臨床樣本；金黃色葡萄球菌（9-14）、無乳鏈球菌（151102）、金黃色葡萄球菌（E3）和大腸埃希菌由新疆畜牧科學(xué)院提供。

表1 試驗(yàn)用菌株Table 1 Strains used in this study

1.3 主要試劑及儀器 LAMP反應(yīng)試劑：Bst DNA聚合酶（8000 U/mL）、MgSO4（100 mmol/L）、10×ThermoPol反應(yīng)緩沖液均購自紐英倫生物技術(shù)（北京）有限公司；dNTP Mixture（10 mmol/L）、甜菜堿購自天根生化科技（北京）有限公司；SYBR Green Ⅰ核酸染料購自北京索萊寶科技有限公司。PCR反應(yīng)試劑：2× Taq PCR Green Mix、ddH2O、DNA marker購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司公司。常規(guī)試劑：快速革蘭氏染色液、鏈球菌細(xì)菌生化編碼鑒定管A203、pMD-19T、感受態(tài)細(xì)胞DH5α購自天根生化科技（北京）有限公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega公司。

1.4 LAMP方法建立

1.4.1 細(xì)菌DNA模板的制備 取1 mL菌液懸于1.5 mL離心管中，1110.79 ×g，離心1 min，棄上清液；用ddH2O洗滌菌體沉淀兩次，用100 μLddH2O溶解沉淀；將菌懸液于沸水浴中煮沸10 min，12 000 ×g離心1 min，取上清液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 引物設(shè)計(jì)與合成 用馬鏈球菌馬亞種4047全基因組中的fneB基因序列為靶序列，將靶序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì)分析，確定其保守序列。應(yīng)用在線軟件設(shè)計(jì)LAMP引物，引物送生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表2。

表2 LAMP擴(kuò)增引物序列Table 2 Primer sequences of LAMP reaction

1.4.3 LAMP反應(yīng)初步體系 25 μL的初步反應(yīng)體系為：10× Bst DNA Polymerase Buffer 2.5 μL，50 mmol/L MgSO44 μL，10 mmol/L dNTPs 3.75 μL，5 mol/L甜菜堿4 μL，8 U/μL Bst DNA polymerase 1 μL，5 μmol/L F3/B3 1 μL，20 μmol/L FIP/BIP 1.5 μL，20 μmol/L LF/LB 1 μL，DNA模板2 μL，加0.75 μL ddH2O至25 μL。

1.4.4 LAMP反應(yīng)初步操作程序 取1 μL熒光染料SYBR Green Ⅰ置LAMP管中，水浴鍋溫度調(diào)至63℃反應(yīng)60 min，放入80℃水浴鍋中10 min終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后稍作離心，肉眼觀察有無白色焦磷酸鎂沉淀；將管蓋的熒光染料甩入管中，在紫外燈下呈熒光綠色為陽性，呈橘黃色為陰性；再通過凝膠成像儀觀察結(jié)果是否呈特征性梯形條帶。

1.4.5 LAMP反應(yīng)靈敏性檢測(cè) 通過微量紫外分光光度儀OD260測(cè)定提取的S.equi菌株單菌落DNA模板濃度，通過阿伏加德羅常數(shù)（NA：6.02×1023/moL）得到拷貝數(shù)（copies）=（[阿伏伽德羅常數(shù)×質(zhì)粒濃度（g/mL）]/質(zhì)粒相對(duì)分子質(zhì)量（g/moL）），用ddH2O將已知拷貝數(shù)的DNA模板用10倍法稀釋，取稀釋度在1.0×107～1.0×101copies/μL作為模板，PCR反應(yīng)體系為25 μL：Taq聚合酶預(yù)混染料（2× Taq PCR Green Mix）12.5 μL，上、下游引物各1 μL，細(xì)菌DNA模板2 μL，ddH2O加至25 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性，5 min；95℃變性30 s，49℃退火30 s，72℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min，目的片段大小1428 bp。用25 μL初步反應(yīng)體系的混合液，取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳觀察，通過凝膠成像儀分析敏感性。

1.4.6 LAMP反應(yīng)特異性檢測(cè) 取大腸埃希菌、無乳鏈球菌、金黃色葡萄球、蠟狀芽孢桿菌、克雷伯桿菌的DNA模板做對(duì)照，同時(shí)以ddH2O為陰性模板，一株S.equi菌株作為陽性模板對(duì)照，檢測(cè)方法的特異性，通過電泳及凝膠成像分析儀檢測(cè)該方法的特異性。

2 結(jié)果

2.1 初步LAMP可視化檢測(cè)結(jié)果 兩株S.equi菌株N20和N25，用表2中的LAMP引物建立初步25 μL體系fneB-LAMP，在紫外燈照射或肉眼觀察下，結(jié)果陽性呈熒光綠色，陰性呈橘黃色（圖1）；兩株S.equi菌株凝膠成像擴(kuò)增出特征性梯形目的條帶（圖2）。

圖1 LAMP可視化檢測(cè)結(jié)果Fig.1 LAMP visual detection

圖2 S.equi菌株LAMP擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 LAMP amplification of S.equi

2.2 fneB-LAMP敏感性測(cè)試 通過微量紫外分光光度儀OD260測(cè)定提取的S.equi菌株單菌落DNA模板濃度為80 ng/μL，采用LAMP進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，結(jié)果如圖3所示，基因組濃度稀釋倍數(shù)為10-4的模板仍可以擴(kuò)增得到階梯式的目標(biāo)條帶，可檢測(cè)的靈敏度達(dá)8×10-6μg/μL，而采用常規(guī)PCR檢測(cè)時(shí)僅檢測(cè)出10-2和10-1的模板，比LAMP低了兩個(gè)數(shù)量級(jí)。

圖3 fneB-LAMP的敏感度實(shí)驗(yàn)Fig.3 The sensitivity of fneB-LAMP

2.3 fneB-LAMP特異性試驗(yàn) 對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄菌、無乳鏈球菌、從馬腺疫臨床樣本中分離出的一株蠟狀芽孢桿菌單菌落和一株鏈球菌5株菌，以及S.equi菌株N20和N25基因組DNA進(jìn)行特異性試驗(yàn)。結(jié)果如圖4所示，僅有S.equi菌株N20和N25基因組DNA出現(xiàn)陽性擴(kuò)增條帶，其余5株均未出現(xiàn)特征型梯形擴(kuò)增條帶，表明該引物具有良好的特異性。

圖4 fneB-LAMP的特異性結(jié)果Fig.4 The specific results of fneB-LAMP

2.4 fneB-LAMP檢測(cè)分離株結(jié)果 利用本實(shí)驗(yàn)建立的fneB-LAMP，檢測(cè)出7株分離菌株，A13、C6、C2、C9、C14、A8、C16，通過PCR檢測(cè)驗(yàn)證7株菌均為陽性，出現(xiàn)了特異性梯形條帶，陰性對(duì)照未出現(xiàn)任何條帶（圖5），表明該方法能夠成功檢測(cè)出馬腺疫S.equi。

圖5 fneB-LAMP樣品檢出結(jié)果Fig.5 Sample detection results of fneB-LAMP

3 討論

馬腺疫是一種世界范圍內(nèi)常見的傳染性很強(qiáng)的馬的上呼吸道疾病，傳染源是病畜和病愈后的帶菌動(dòng)物。接種疫苗、結(jié)合早期診斷和及時(shí)隔離治療可以預(yù)防馬腺疫。根據(jù)臨診表現(xiàn)結(jié)合流行病學(xué)可做出初步診斷，雖然典型腺疫的馬匹臨診癥狀明顯，但一過型腺疫和康復(fù)的馬匹是重要傳染源往往會(huì)被忽視，惡性型腺疫也可能會(huì)誤判，并且早期診斷及確診增多需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢查。馬鏈球菌馬亞種（Streptococcus equi subspecies equi）是馬腺疫的主要病原體，細(xì)菌學(xué)檢查是最可靠的方法。核酸檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用日趨廣泛，已有的熱循環(huán)檢測(cè)技術(shù)操作繁瑣儀器昂貴，較難滿足市場(chǎng)需求。現(xiàn)已有多種恒溫檢測(cè)技術(shù)，其中環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）是一種簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)的檢測(cè)方法，擴(kuò)增條件僅為恒溫儀器，具有在基層應(yīng)用的前景[9]。

該fneB-LAMP方法相對(duì)于其他核酸檢測(cè)技術(shù)，選擇樣本核酸提取方法中，LAMP反應(yīng)的耐受性很好，比普通PCR高很多，由于LAMP反應(yīng)中的Bst DNA聚合酶具有很好的耐受性，樣本中的異物對(duì)反應(yīng)的影響比較小，因此LAMP擴(kuò)增時(shí)卻不一定需要純化核酸樣本，具有模板選擇粗提的優(yōu)點(diǎn)。常用的擴(kuò)增儀器有恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)儀和金屬浴鍋，恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)儀可實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增過程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，有數(shù)學(xué)模型進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖形繪制，可自動(dòng)判讀結(jié)果，本研究使用的恒溫儀器是恒溫水浴鍋，經(jīng)試驗(yàn)結(jié)果表明，水浴鍋可用于恒溫?cái)U(kuò)增目標(biāo)DNA，有特異性、靈敏度比普通PCR高等優(yōu)點(diǎn)，符合基層使用LAMP技術(shù)的設(shè)想，具有繼續(xù)開發(fā)的前景。

本文的主要目的是探索LAMP方法用于馬腺疫病原菌檢測(cè)的可能性，S.equi是LAMP方法測(cè)定的主要病原體，其中已有針對(duì)seM基因的seM-LAMP檢測(cè)方法[10]，本研究與該方法相比，優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)，檢出率更高，通過敏感性檢測(cè)，fneB-LAMP與常規(guī)PCR方法相比靈敏度高達(dá)2倍。報(bào)道的馬鏈球菌胞外蛋白（fibronectin-binding protein,FNEB），含有保守的FN結(jié)合重復(fù)序列和細(xì)胞壁錨定基序，fneB基因作為S.equi的毒力因子之一，可用于擴(kuò)增目的基因片段用LAMP方法檢測(cè)馬腺疫。該fneB-LAMP方法相對(duì)于其他核酸檢測(cè)技術(shù)，具有模板選擇粗提、特異性高、靈敏度比普通PCR高等優(yōu)點(diǎn)。

馬鏈球菌的檢測(cè)會(huì)受多種因素的影響，包括樣本收集部位（鼻側(cè)通道、鼻咽與喉囊）、培養(yǎng)方式與檢測(cè)方法、PCR靶基因的選擇、DNA擴(kuò)增方法[11-14]。本實(shí)驗(yàn)從伊犁地區(qū)3個(gè)馬場(chǎng)采集的40份臨床馬腺疫樣本，馬匹為1歲以內(nèi)幼駒，臨床表現(xiàn)鼻粘膜卡他性炎癥，流出黏液性或黃白色膿性分泌物，頜下淋巴結(jié)腫大可達(dá)雞卵或拳頭大小，充滿下頜間隙。選用鼻腔深處鼻拭子，以及2匹淋巴結(jié)破潰馬匹膿汁采樣。

每年春秋季天氣變化較大時(shí)幼駒患馬腺疫的概率非常大，幾乎每匹幼駒都有馬腺疫史，依據(jù)自身免疫力及細(xì)菌毒力而表現(xiàn)不同程度癥狀[15]。馬腺疫病原的實(shí)驗(yàn)室診斷通常是對(duì)鼻拭子、膿汁及鼻洗液等樣品對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定，利用PCR方法特異性檢測(cè)到seM基因，也可用血清學(xué)方法鑒定馬鏈球菌馬亞種[16]。