免疫組化與PCR檢測(cè)梅毒患者皮損組織蠟塊中梅毒螺旋體的敏感性評(píng)價(jià)

付 鈺，楊 羚，劉棟華

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530021；3.廣西艾滋病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530021）

近年來(lái)，隨著人們生活方式逐漸多元化、思想的開(kāi)放化以及人口流動(dòng)性增大，我國(guó)的梅毒發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。梅毒螺旋體（Treponema pallidum，TP）是一種“拒絕”體外培養(yǎng)的病原體［1］，因此，相對(duì)其他可體外培養(yǎng)、增殖的傳染病病原體來(lái)說(shuō)，關(guān)于TP的研究受到了很大限制，且由于其體積小、重量輕、不易著色，臨床對(duì)梅毒的病原學(xué)檢測(cè)存在一定的局限性。目前，暗視野顯微鏡觀察和鍍銀染色為常用的TP病原學(xué)檢測(cè)方式，而免疫組織化學(xué)法（Immunohistochemistry，IHC）和聚合酶鏈反應(yīng)法（Polymerase chain reaction，PCR）是較為特異的檢測(cè)方式。IHC是通過(guò)抗原抗體相結(jié)合的原理呈現(xiàn)出皮損組織中TP的分布情況，并加以蘇木素復(fù)染來(lái)表現(xiàn)組織細(xì)胞的形態(tài)，而PCR則是在分子水平上檢測(cè)樣品中TP的基因片段，間接性反映TP的存在，既往采用PCR檢測(cè)TP的研究大多針對(duì)早期梅毒患者的血液和皮損組織或分泌物樣本［2，3］，如今該方法已經(jīng)成為一種成熟的檢測(cè)方式。

二期梅毒患者的皮損通常缺乏特異性且呈多樣化，可出現(xiàn)紅斑、丘疹、斑丘疹、斑塊、結(jié)節(jié)、膿皰或者潰瘍等，因此從皮損的形態(tài)容易誤診為其他皮膚性疾病。另外，包括快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)（rapid plasma reagin test，RPR）、性病研究實(shí)驗(yàn) 室 試 驗(yàn)（venereal disease research laboratory test，VDRL）、苯甲胺紅不加熱血清試驗(yàn)（toluidine red unheated serum test，TRUST）在內(nèi)的梅毒血清學(xué)試驗(yàn)敏感性高而特異性低，盡管梅毒螺旋體顆粒凝聚試驗(yàn)（treponema pallidum particle agglutination test，TPPA）為TP特異性診斷，但以上檢測(cè)方式均容易在二期梅毒中出現(xiàn)前帶現(xiàn)象，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果假陰性，同時(shí)，其假陽(yáng)性也常見(jiàn)于自身免疫性疾病、麻風(fēng)患者，海洛因成癮者，少數(shù)孕婦或老人中［4］。因此，當(dāng)患者出現(xiàn)多形性皮損，高度懷疑梅毒卻出現(xiàn)診斷困難時(shí)，可取患者的皮損組織進(jìn)行IHC或PCR幫助臨床醫(yī)師進(jìn)一步確診。為了探討兩種方法檢測(cè)TP的敏感性，本次研究均選擇梅毒患者皮損組織蠟塊作為檢測(cè)樣本，分別使用IHC和PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。

1 資料與方法

1.1 樣品來(lái)源 選取廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科26名診斷為梅毒的患者的皮損病理活檢組織（包括早期梅毒患者的硬下疳、二期梅毒疹和其他類型的皮損），其中8名患者合并有人類免疫缺陷病毒（human acquired immunodeficiency virus，HIV） 感染，所有組織均進(jìn)行福爾馬林浸泡固定后用石蠟包埋，以組織蠟塊的形式進(jìn)行保存和運(yùn)輸（表1）。

表1 患者一般特征和實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.2 研究方法

1.2.1 IHC過(guò)程 ① 將患者皮損的組織蠟塊切成3um的薄片，貼附于載玻片上；② 烘烤切片0.5h后用環(huán)保脫蠟液進(jìn)行梯度脫蠟，再用遞減濃度的乙醇溶液（100%，95%，85%，75%）進(jìn)行梯度水化；③ 高溫水浴的環(huán)境下用pH 8.0的EDTA修復(fù)樣本抗原；④ 滴加正常山羊血清于切片上孵育30min進(jìn)行抗原封閉；⑤ 用紙吸干正常山羊血清，將梅毒螺旋體抗體工作液（中杉金橋，中國(guó)）均勻地滴在組織上，盡量使抗體工作液布滿整個(gè)組織，37℃孵育4h或室溫孵育過(guò)夜；⑥ 清洗一抗5min×3次，將山羊抗兔抗體原液（Abcam，英國(guó)）進(jìn)行適當(dāng)比例稀釋后滴加在切片上，于室溫或37℃孵育30min；⑦ 清洗二抗5min×3次后用紙吸干玻片上多余的水分；⑧ 滴加DAB顯色溶液（中杉金橋，中國(guó)）進(jìn)行切片顯色；⑨ 溫水終止顯色，用蘇木素染液復(fù)染組織細(xì)胞核20s后用鹽酸酒精分化、溫水反藍(lán)；⑩ 用紙吸干切片多余水分，自然風(fēng)干；滴加透明護(hù)甲油封片，光鏡下觀察切片。

1.2.2 DNA提取 ① 將每個(gè)皮損組織蠟塊切成5um的薄片，收集包裹完整組織的切片（10～15）片（視組織大小適當(dāng)增減切片數(shù)量），放入1.5ml的微型離心管中；② 離心管中加入適量二甲苯，渦輪振蕩15s，使樣品充分脫蠟后暴露出組織；③ 室溫下離心樣品（13000 rpm）3 min，棄掉上清液；④ 向沉淀中加入無(wú)水乙醇，將混合物再次充分振蕩15s后離心（13000rpm）2min；⑤ 棄掉上清液，打開(kāi)微型離心管蓋子，放置室溫直至乙醇完全揮發(fā)。⑥ 使用 QIAamp DNA FFPF TISSUE試劑盒（QIAGEN，德國(guó)）進(jìn)行組織的DNA提?。孩?將180uL ALT溶液和20uL蛋白酶K加入沉淀中充分震蕩15s后將樣品置于56℃水浴過(guò)夜直至樣品完全裂解；② 次日，將水溫升至90℃后繼續(xù)水浴1h（此步驟用于修復(fù)組織福爾馬林固定期間發(fā)生的部分核酸修飾）；③ 水浴后取出離心管，快速離心，加入200μl Al溶液和200μl無(wú)水乙醇；④ 將混合物轉(zhuǎn)至核酸吸附柱中，離心（8000rpm）1min，棄掉洗脫液（吸附柱不用更換）；⑤ 加入500μl AW1溶液至吸附柱，離心（6000rpm）min，棄掉洗脫液（吸附柱不用更換）；⑥ 加入500μl AW2溶液至吸附柱，離心（14000rpm）3min，棄掉洗脫液（吸附柱不用更換）；⑦ 加入120uL AE溶液，室溫孵育1～5min，離心（6000rpm）1min，留取洗脫液，洗脫液內(nèi)則包含組織的全部DNA。⑧ 檢測(cè)洗脫液中核酸純度與濃度（Thermofisher NanoDrop，USA）。

1.2.3 TP基因鑒定 選擇Tp47基因和poIA 基因分別對(duì)組織中的TP進(jìn)行檢測(cè)。采用巢式PCR對(duì)Tp47基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，以Tp47K-1 （5′-GTTGAGTATTGGGCCGAAA-3′）和Tp47K-2（5′-ATACCGTTCGCAATCAAAG-3′）作為其外引物，用K03A（5′-GAAGTTTGTCCCAGTTGCGGTT-3′）和K04（5′-CAGCCATCAGCCCTTTTCA-3′）作為其內(nèi)引物，最終擴(kuò)增得到大小為261bp的基因片段［6］。采用普通PCR方式對(duì)poIA基因進(jìn)行擴(kuò)增，以poIA-1（5′-TGCGCGTGTGCGAATGGTGTGGTC-3′）為 上游 引 物，poIA-2（5′-CACAGTGCTCAAAAACGCCT GCACG-3′）為下游引物，最終獲得大小為378bp的基因片段［7］。PCR反應(yīng)體系中包含25uL 2×Santaq PCR Mix（上海生工生物，中國(guó)）、X uL DNA模板（X為DNA模板體積量，測(cè)量并計(jì)算維持核酸濃度在1～10 ng/μl之間）、上下游引物各2uL，最后用dd H20補(bǔ)充至50uL。 PCR 的熱循環(huán)（SimpliAmp PCR儀，ABI，USA）過(guò)程如下：預(yù)變性94℃ 5min；變性94℃ 30s，退火55℃ 30s，延伸72℃ 40s，變性至延伸一共持續(xù)35個(gè)循環(huán)；終延伸72℃ 10min；PCR產(chǎn)物保存于4℃。使用3%瓊脂糖凝膠（索萊寶生物，中國(guó)）電泳進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化，Marker 選用50bp DNA Ladder（天根生物，中國(guó)），通過(guò)紫外線凝膠成像儀（Syngene G：BOX，英國(guó)）顯像。

2 結(jié)果

一共26例樣本均為IHC陽(yáng)性，陽(yáng)性率為100%。可見(jiàn)TP沿著表皮中、下部分及血管上皮周圍分布（圖1）。7例樣本顯示Tp47-PCR陽(yáng)性，9例樣本顯示poIA-PCR陽(yáng)性（圖2），陽(yáng)性率分別為27%和35%，同時(shí)，poIA-PCR陽(yáng)性樣本包括了Tp47-PCR陽(yáng)性樣本。

圖 1 IHC 結(jié)果圖

圖 2 TP-PCR 結(jié)果

（1a：TP沿表皮中、下部分布（IHC×200）；b：TP浸潤(rùn)血管上皮及其周圍（IHC×400））。

3 討論

梅毒螺旋體PCR （TP-PCR）檢測(cè)現(xiàn)已被推薦為診斷一期或二期梅毒的有效手段［5］，TP的感染與否可以在基因水平上得到證實(shí)，為梅毒的診斷提供病原學(xué)證據(jù)。Tp47基因編碼一種參與TP細(xì)胞壁合成的細(xì)胞質(zhì)膜蛋白（47KDa）［5，6］，是最常用的TP-PCR檢測(cè)的靶基因。本研究采用巢式PCR擴(kuò)增Tp47基因片段的優(yōu)勢(shì)在于：一方面，普通PCR檢測(cè)中目標(biāo)DNA片段數(shù)量較少時(shí)普通PCR靈敏度低、不穩(wěn)定、重復(fù)性差，而巢式PCR則可以通過(guò)二次擴(kuò)增提高其檢測(cè)敏感度［8］；另一方面，第二次擴(kuò)增的片段是第一次擴(kuò)增片段的一部分，提高了檢測(cè)的特異度。

poIA 編碼DNA聚合酶I，參與DNA的修復(fù)，盡管poIA 基因在大多數(shù)細(xì)菌的生理過(guò)程中參與其遺傳物質(zhì)的復(fù)制，但在TP的基因表達(dá)中表現(xiàn)出很強(qiáng)的特異性［9］。在 Gayet-Ageron 等人的研究中，比較了Tp47-TP-PCR 與 poIA-TP-PCR 在相同臨床標(biāo)本上的檢測(cè)［10］，發(fā)現(xiàn)兩者敏感度性幾乎完全一致，甚至可以相互替代檢測(cè)，因此，本研究選擇在檢測(cè)Tp47基因同時(shí)，同時(shí)檢測(cè)poIA基因作為對(duì)比。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，兩個(gè)靶基因的的陽(yáng)性率也極為接近。

本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IHC檢測(cè)梅毒患者皮損組織蠟塊中TP的陽(yáng)性率明顯高于PCR（表1）。在 Hoang 等人的研究中，比較了17例二期梅毒患者19例皮損組織樣本蠟塊中的IHC和銀染色結(jié)果，顯示IHC檢測(cè)敏感度為71%，優(yōu)于銀染色的41%（p=0.084）［11］；在 Buffet等人的研究中，將12例二期梅毒患者的皮損活檢組織蠟塊分別進(jìn)行IHC（91%）與基于TP47基因的PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示IHC（91%）檢測(cè)敏感度優(yōu)于PCR檢測(cè)（75%）［12］；Behrhof等人的研究中，20例二期梅毒患者皮損組織蠟塊標(biāo)本通過(guò)免疫組化、銀染色或和PCR檢測(cè)，免疫組化檢測(cè)17/35（48.6%）例陽(yáng)性，銀染色9/35（25.7%）例陽(yáng)性，PCR檢測(cè)14/36（38.9%）例陽(yáng)性［13］?？梢?jiàn)無(wú)論是相較于銀染或PCR，IHC對(duì)梅毒患者皮損組織蠟塊的檢測(cè)敏感性均較高。

在既往的報(bào)道中，Cuini Wang等人運(yùn)用PCR檢測(cè)262例不同分期梅毒患者（84例一期梅毒、97例二期梅毒和81例潛伏梅毒）的全血TP-DNA，結(jié)果顯示，初期與二期梅毒患者的DNA檢測(cè)陽(yáng)性率分別為53.6%和62.9%，遠(yuǎn)高于潛伏梅毒患者（7.4%）（p＜ 0.001）［2］；Palmer等人對(duì)梅毒患者肛門-生殖器或口腔潰瘍拭子新鮮標(biāo)本進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示在一期梅毒的檢測(cè)中，PCR的敏感度為94.7%，特異度為98.6%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為94.7%，陰性預(yù)測(cè)值為98.6%；二期梅毒的靈敏度為80%，特異性為98.6%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為88.9%，陰性預(yù)測(cè)值為97.2%［3］。由此得知，PCR在檢測(cè)非蠟塊的樣本敏感度相對(duì)蠟塊樣本高。

對(duì)于本研究中PCR檢測(cè)組織蠟塊敏感性較低的原因，我們認(rèn)為可能為以下幾點(diǎn)原因：① 福爾馬林容易在空氣中氧化成為甲酸，甲酸對(duì)于DNA有很強(qiáng)的降解作用，因此使用陳舊的福爾馬林溶液固定組織或固定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)都會(huì)使樣本中的DNA降解，從而使得擴(kuò)增效率降低；② 組織固定后，核酸蛋白廣泛地交聯(lián)，使DNA與蛋白質(zhì)形成牢固的復(fù)合物，DNA容易斷裂成為不完整的片段，導(dǎo)致DNA不容易被提取；③ 在福爾馬林固定過(guò)程中，嘌呤基、堿基與組蛋白之間形成了以多聚甲醛為介體的甲基橋，導(dǎo)致DNA的交聯(lián)，在石蠟包埋過(guò)程中隨機(jī)降解［14］；④ 盡管在從標(biāo)本中提取DNA的過(guò)程中，采用高溫水浴盡可能減少福爾馬林溶液對(duì)抗原的交聯(lián)抑制。但由于每塊組織的大小不均勻，選擇的切片數(shù)量也不相同，人為因素會(huì)導(dǎo)致裂解和修復(fù)過(guò)程不完全；⑤ 操作過(guò)程中樣本量的損失；⑥ 樣本中的病原體載量小。

本研究的結(jié)果表明，IHC對(duì)于梅毒患者皮損組織蠟塊樣本來(lái)說(shuō)，是一種特異性與敏感性都很高的病原體檢測(cè)方法，顯色后可在光鏡下清楚觀察到皮損中TP的分布。但是，IHC具有檢測(cè)樣本的局限性，對(duì)于血液、唾液、分泌物樣本，即便可風(fēng)干固定于玻片之上，仍不能避免樣本在IHC過(guò)程中反復(fù)被清洗而導(dǎo)致的損耗。另一方面，這些樣本的內(nèi)容物多樣，若涂片不均，則會(huì)導(dǎo)致視野背景雜亂，影響閱片質(zhì)量。PCR檢測(cè)可以避免上訴非組織蠟塊樣本造成的影響，因此對(duì)于無(wú)皮疹的梅毒患者的血液、唾液、分泌物樣本，PCR不失為一種敏感度和特異度相對(duì)較高的檢測(cè)輔助性檢測(cè)。

綜上所述，IHC對(duì)梅毒患者皮損組織蠟塊中TP的檢測(cè)敏感性高于PCR，對(duì)于臨床出現(xiàn)多樣化皮疹損，高度懷疑梅毒的患者卻出現(xiàn)診斷困難時(shí)，IHC可作為一種針對(duì)皮損組織蠟塊的準(zhǔn)確、敏感的特異性檢測(cè)方式，幫助臨床診斷。