腎移植術后早期BK 病毒感染的外周血淋巴細胞免疫特征分析

陳婷婷，朱冬，楊橙，王宣傳，戎瑞明，朱同玉，李曉宇，王繼納

（1.復旦大學附屬中山醫(yī)院藥劑科，上海 200032；2.復旦大學附屬中山醫(yī)院泌尿外科，上海 200032；3.上海市器官移植重點實驗室，上海 200032）

BK 病毒（BK virus， BKV）是一種環(huán)狀雙鏈DNA 病毒，正常人群普遍易感，機體免疫力正常時并不表現(xiàn)出感染癥狀，而在免疫力低下的人群中，BKV 容易激活并大量復制，破壞腎小管上皮細胞并進入尿液甚至血液中［1］。BKV 感染是腎移植術后常見的病毒感染之一，BKV感染所致的BKV腎病 （BKV nephropathy， BKVN）已成為導致移植腎功能丟失的重要原因之一［2］。腎移植術后導致BKV 激活的原因有很多，主要與供者、受者以及腎移植手術本身、留置輸尿管支架管、術后免疫抑制狀態(tài)等因素相關［3］。其中，腎移植患者的過度免疫抑制狀態(tài)是BKV 激活、復制及進展至BKVN 最主要的危險因素之一［4］。針對腎移植患者BKV 的感染，目前尚缺乏確切有效的臨床治療手段。因此，識別腎移植患者BKV 激活的危險因素和預警指標，盡早進行免疫狀態(tài)的干預和調整，對于防治腎移植術后BKV 的感染和對移植腎功能的損害至關重要。

淋巴細胞是機體執(zhí)行免疫防御的主要細胞，外周血淋巴細胞的特征在很大程度上反映了機體的免疫功能狀態(tài)。在腎移植患者中，圍術期的免疫誘導治療可以通過阻斷淋巴細胞的激活、信號轉導和復制，導致患者外周血中淋巴細胞減少，并需要一定的時間來進行隨后的免疫細胞重建［5］。研究表明，外周血中淋巴細胞的減少與腎移植術后病毒感染具有相關性，腎移植手術1 年后外周血淋巴細胞減少的患者更容易發(fā)生BKV 感染［5］，但少有研究探索腎移植術后早期淋巴細胞重建與BKV 激活的關系。有研究指出，淋巴細胞曲線下面積（area under the lymphocyte curve，L_AUC）是反映淋巴細胞重建的一個指標，并在異基因造血干細胞移植（allogenic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）患者的研究中證實與術后病毒激活有關，可以作為造血干細胞移植后病毒感染的預測因素之一［6-8］。

因此，我們通過本項臨床回顧性研究，來探究腎移植術后早期外周血淋巴細胞重建與BKV 激活的相關性，為臨床上BKV 感染的預警及防治提供臨床參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料：回顧性收集2020 年1 月至2021 年10 月在復旦大學附屬中山醫(yī)院（以下簡稱“中山醫(yī)院”）接受同種異體腎移植手術的164 例患者的臨床資料。

納入標準：首次接受腎移植；行同種異體腎移植術前已簽署知情同意書；術后6 個月內定期進行血液和尿液中BKV-DNA 載量檢測。

排除標準：年齡≤18 歲；術后6 個月內發(fā)生急性排斥反應；術后6 個月內發(fā)生嚴重感染（導致住院或住院時間延長）；術后6 個月內失訪、死亡；術后6 個月內隨訪資料不完整，無相關實驗室檢查。

1.2 BKV-DNA 載量檢測和外周血淋巴細胞監(jiān)測：納入本研究的患者均在術后6 個月內完成相應時間點的BKV-DNA 載量檢測，在6 個月內采集晨尿和外周血標本，采用實時熒光定量PCR 檢測。BKV尿癥和BKV 血癥的標準為實時熒光定量PCR 檢測尿液中BKV-DNA 載量≥1×107copies/ml，血液標本中BKV-DNA 載量≥1×104copies/ml。以腎移植術后6 個月內發(fā)生BKV 尿癥和/或BKV 血癥的患者為BKV 激活組，術后6 個月內沒有發(fā)生BKV 尿癥或BKV 血癥的患者為BKV 陰性組。

患者術后早期常規(guī)進行臨床血常規(guī)檢測，繼而進行外周血淋巴細胞的監(jiān)測。監(jiān)測方案如下：術后1 周內，每天監(jiān)測1 次；術后1 周至出院時，每周一、周三、周五檢測1 次；出院后隨訪至術后30 d，每周監(jiān)測1 次。

本研究所納入的所有病例均通過中山醫(yī)院電子病歷系統(tǒng)回顧性收集患者的人口學特征和實驗室檢測數(shù)據(jù)，包括患者的性別、年齡、腎移植前透析方式，以及圍術期免疫誘導方案、術后免疫抑制劑維持方案、術后中性粒細胞計數(shù)、直接膽紅素、BKV檢測時間、BKV-DNA 載量、腎移植術后的外周血淋巴細胞計數(shù)。本研究經中山醫(yī)院倫理委員會批準（B2021-730R），所有納入本研究的患者均簽署知情同意書。

1.3 圍術期免疫誘導及術后免疫抑制方案：納入本研究患者的免疫誘導方案為巴利昔單抗（20 mg，D0、D4）或抗胸腺細胞免疫球蛋白（antithymocyte globulin， ATG）（總量2 ～3 mg/kg）。

納入本研究患者的維持性免疫抑制方案為他克莫司或環(huán)孢素A + 嗎替麥考酚酯或麥考酚鈉 + 糖皮質激素三聯(lián)免疫抑制劑維持方案，并根據(jù)藥物的血藥濃度及時調整藥物的劑量。

1.4 外周血淋巴細胞重建指標——L_AUC：L_AUC定義為淋巴細胞計數(shù)-時間曲線下的一系列淋巴細胞計數(shù)之和［8］。本研究以L_AUC 作為淋巴細胞重建指數(shù)的標志，采用梯形法計算。對納入研究的患者，分析了術后30 d 的淋巴細胞曲線下面積。同時，還比較了兩組患者腎移植術前淋巴細胞計數(shù)的差異，及對兩組患者進行術后淋巴細胞動力學研究，比較兩組患者淋巴細胞計數(shù)的變化趨勢。外周血淋巴細胞計數(shù)的測定由本院檢驗科采用阻抗法進行（日本sysmex 公司）。

1.5 統(tǒng)計學分析：采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均值±標準差（±s）表示，非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)）〔M（QL，QU）〕表示。正態(tài)分布計量資料采用t 檢驗或方差分析，非正態(tài)分布資料的組間比較應用非參數(shù)秩和檢驗。計數(shù)資料以頻數(shù)和百分比表示，采用χ2檢驗進行統(tǒng)計學分析。應用多因素Logistic 回歸法對混雜因素進行校正，篩選BKV 激活的危險因素。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 基本資料：根據(jù)納入和排除標準對研究對象進行篩選，最終共納入131 例腎移植患者，其中BKV 激活組40 例，均為BKV 尿癥，其中有3 例患者血液中檢測出BKV，但BKV-DNA 載量均＜1×104copies/ml，BKV 陰性組91 例。兩組研究對象在性別上的差異具有統(tǒng)計學意義（表1）。

表1 研究對象的基本資料

2.2 淋巴細胞重建與術后早期BKV 激活的關系：比較了兩組患者腎移植術前外周血淋巴細胞計數(shù)的差異（圖1A），發(fā)現(xiàn)沒有統(tǒng)計學意義（P=0.112），將其以淋巴細胞計數(shù)1 000 /μl 為界限分為淋巴細胞減低組和淋巴細胞正常組，進一步比較BKV激活組和BKV 陰性組術前淋巴細胞水平的差異（圖1B），依然沒有統(tǒng)計學意義（P=0.236）。

圖1 BKV 陰性組和BKV 激活組術前淋巴細胞水平比較

兩組患者的外周血淋巴細胞動力學研究如圖2 所示，腎移植術后1 個月內，BKV 激活組的患者外周血淋巴細胞計數(shù)明顯低于BKV 陰性組，通過t 檢驗分析顯示，僅術后第1 天兩組的差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.003），而第7 天、第14 天、第21 天和第30 天，兩組間的差異并不具有統(tǒng)計學意義。

圖2 BKV 激活組和BKV 陰性組患者淋巴細胞動力學研究結果

進一步比較兩組患者的術后30 d 的L_AUC（圖3A），發(fā)現(xiàn)兩組間差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.03）。以中位數(shù)為界，將L_AUC ＜3 9750/μl 視為 術 后 低L_AUC，L_AUC ≥3 9750/μl 視 為術后高L_AUC，進一步比較術后淋巴細胞重建與BKV激活的相關性（圖3B），發(fā)現(xiàn)兩組間差異依然具有統(tǒng)計學意義（P=0.027）。

圖3 BKV 陰性組和BKV 激活組術后30 dL_AUC 的差異性比較

2.3 同一DCD 供者的配對患者BKV 激活狀況：131 例患者中，48 例患者分別接受了來自同一DCD 供者的2 個不同的供腎，將其配對分為兩組（供腎1 組和供腎2 組）。對這兩組患者進行BKV激活情況的亞組分析，探討來自同一DCD 供者的配對患者的BKV 激活是否存在差異（表2）。

表2 來自同一DCD 供者的配對受體BKV 激活狀況

在24 對接受同一供者的供腎患者中，7 對（29.2%）患者術后存在BKV 激活情況不一致，兩組患者術后BKV 激活狀況的一致性較差（Kappa檢驗，Kappa 值為0.373，P=0.058）。

2.4 影響術后早期BKV 激活的危險因素：對在單因素分析中P ＜0.25 的因素以及臨床上可能導致患者腎移植術后BKV 感染的因素（如供腎類型、免疫誘導類型等）進行多因素Logistics 回歸分析（圖4）：結果顯示，在對混雜因素進行校正后，腎移植術后L_AUC30是術后半年內BKV 激活的獨立影響因素，低L_AUC30的患者術后BKV 激活的風險較高L_AUC30的患者增加了2.5 倍。模型的Omnibus 檢驗P=0.045，模型總體有意義，模型擬合優(yōu)度檢驗Hosmer-Lemeshow 檢驗P=0.878，模型擬合優(yōu)度高。

圖4 腎移植術后早期影響B(tài)KV 激活的多因素回歸分析結果

3 討 論

本研究探討了常規(guī)監(jiān)測外周血淋巴細胞計數(shù)對腎移植患者術后早期BKV 感染的潛在病因學作用，以術后半年內BKV 激活作為研究終點，探討腎移植患者淋巴細胞與BKV 激活的相關性。研究結果顯示，腎移植術后早期，BKV 激活的患者比BKV陰性的患者的淋巴細胞計數(shù)更低，在術后6 個月內，術后30 d 的淋巴細胞AUC ＜39 750/μl 的患者與同一時間點AUC ＞39 750/μl 的類似患者相比，有更大的BKV 激活風險。這一觀察結果提示術后L_AUC 可能是腎移植患者BKV 激活的危險因素。同時，我們的結果也提示，術前淋巴細胞計數(shù)減少與術后BKV 激活沒有明顯相關性。

本研究結果與我們關于外周血淋巴細胞重建和BKV 激活風險相關的假設是一致的。腎移植圍術期使用單克隆抗體或多克隆抗體進行免疫誘導治療，可導致患者外周血淋巴細胞減少，抑制淋巴細胞增殖，而且需要較長的時間來進行淋巴細胞重建。免疫誘導方案的不同，也會導致淋巴細胞重建所需的時間不同。研究表明，使用ATG作為免疫誘導的患者，術后淋巴細胞重建更為緩慢，甚至可長達2 年之久［9］。在我們的研究對象中，在分析ATG 誘導和巴利昔單抗誘導患者術后的淋巴細胞計數(shù)水平和術后淋巴細胞AUC 后，也觀察到使用ATG 誘導的患者，術后30 d 的L_AUC（26 911.11±7 365.4/μl）明顯低于使用巴利昔單抗誘導的患者（44 702.05±20 451.2/μl）。但是進行單因素分析和多因素回歸分析后，均未發(fā)現(xiàn)ATG誘導與術后BKV 激活有關，這可能是由于本研究僅納入了9 例使用ATG 誘導治療的患者，可能還需要更大的樣本量。在對使用非ATG 誘導的患者進行亞組分析后，仍然發(fā)現(xiàn)術后30 d 的L_AUC 對BKV 激活有顯著的影響。這個結果提示，腎移植患者術后30 d 低L_AUC 是獨立于ATG 的BKV 激活的危險因素。

近年來，淋巴細胞與移植患者術后病毒感染的相關性研究已有報道。Dujardin 等［5］的一項對腎移植1 年后淋巴細胞減少與移植腎結局的研究發(fā)現(xiàn)，腎移植1 年后淋巴細胞持續(xù)減低的患者相較于淋巴細胞正常的患者，在特定的隨訪時間點，BKV感染的風險增加。Masutani 等［10］的研究表明，腎移植術后淋巴細胞計數(shù)下降可能是發(fā)生BKV 病毒血癥的一個預測因素，Velioglu 等［11］的研究也觀察到，發(fā)生BKV 腎病的腎移植患者可出現(xiàn)外周血淋巴細胞計數(shù)下降。以上研究均探討了淋巴細胞計數(shù)與BKV 感染的相關性，但研究對象均為術后半年以上的患者。然而，BKV 感染大多發(fā)生在腎移植術后1 年內，尤以術后3 個月內最為多見［12］。因此，研究腎移植術后早期，尤其是半年內患者的淋巴細胞計數(shù)與BKV 感染的相關性，對于預警和防治BKV 感染可能更具有臨床價值。

相比于某個單一時間點的淋巴細胞計數(shù)，連續(xù)監(jiān)測外周血淋巴細胞計數(shù)可能更有助于預測腎移植術后的機會性感染［13］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，術后BKV 激活組的患者術前的淋巴細胞計數(shù)水平低于BKV 陰性組，但是差異沒有統(tǒng)計學意義。而且，在對腎移植患者進行術后淋巴細胞動力學研究后也發(fā)現(xiàn)，術后第7、14、21、30 天患者的外周血淋巴細胞計數(shù)均未顯示出與BKV 激活的相關性，而只是術后第1 天的淋巴細胞計數(shù)與術后BKV 激活相關。進一步的分析發(fā)現(xiàn)，術后30 d 的L_AUC 與BKV 激活顯著相關。這提示我們，與單一時間點的淋巴細胞計數(shù)相比，動態(tài)的淋巴細胞變化趨勢對于BKV 激活的影響可能更大。

供腎因素是影響腎移植術后BKV 激活的因素之一。王軍祥等［14］對99 例活體供腎移植患者和436 例DCD 供腎移植患者進行回顧性研究，發(fā)現(xiàn)DCD 供腎移植的患者術后尿液中BKV-DNA 載量＞1×107copies/ml 的2 年累積發(fā)生率明顯高于活體供腎移植患者。然而在本研究中，未發(fā)現(xiàn)DCD 供腎與術后BKV 激活相關，這可能與本研究的樣本量較小有關。但本研究通過對來自同一DCD 供者的不同供腎的受者術后BKV 激活狀況進行分析后，發(fā)現(xiàn)同一供體的不同受體之間BKV 激活狀況一致性較差。這可能可以進一步解釋受體自身的免疫狀態(tài)與BKV 激活相關，關注受體的免疫功能狀況對于BKV 的防治意義更大。

腎移植患者的性別也是影響B(tài)KV 激活的危險因素之一［15］。在本研究中，除了外周血淋巴細胞重建的指標以外，男性也被確定為BKV 激活的危險因素，男性患者相比于女性更容易發(fā)生BKV 激活，這也與既往的其他研究結論相符。

本研究仍存在一定的局限性，包括本研究為單中心的回顧性研究，樣本量較少，而且沒有進行淋巴細胞亞群分析、動態(tài)監(jiān)測淋巴細胞亞群與BKV感染的情況。我們還需更大型的多中心、多時間點的臨床研究來探索淋巴細胞亞群重建與腎移植術后BKV 感染的關系，以進一步明確可預測、反映BKV 激活的淋巴細胞亞群。

綜上所述，腎移植術后早期外周血淋巴細胞重建與腎移植術后BKV 激活具有相關性，術后30 d 低L_AUC 的患者更容易發(fā)生BKV 激活，淋巴細胞AUC可以用來識別腎移植術后BKV 激活的高風險患者。