基于多孔框架及貴金屬納米材料高靈敏生物傳感器的設(shè)計與應(yīng)用研究

云南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院

成果完成人：楊云慧，胡 蓉，劉婷知，張 茜

完成單位：云南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院

1 研究的背景和意義

基于抗體或核酸適配體作為識別元件的生物傳感器，可將樣品中目標(biāo)物與識別元件之間發(fā)生特異性識別反應(yīng)產(chǎn)生的生物信號轉(zhuǎn)換成與濃度相關(guān)的電信號或光信號，具有特異性強、所需儀器簡單、操作方便和分析快速等優(yōu)良特點，目前已廣泛應(yīng)用于臨床診斷、環(huán)境分析等多個領(lǐng)域，可對疾病標(biāo)記物、有毒有害物質(zhì)以及生物分子進行分析檢測。盡管此類與疾病標(biāo)記物及毒品毒素相關(guān)的生物傳感器可以實現(xiàn)特異性檢測，但目前仍存在信號放大方式單一的問題，靈敏度仍然有待提高。

2 研究內(nèi)容及發(fā)現(xiàn)點

項目針對應(yīng)用于實際復(fù)雜體系檢測的生物傳感器面臨的制備煩瑣，酶標(biāo)記物易失活、靈敏度及選擇性低等問題，通過設(shè)計合成比表面積大、電子傳導(dǎo)率高的貴金屬納米材料及多孔有機骨架材料，構(gòu)建生物傳感器并用于疾病標(biāo)記物及毒品毒素的檢測。項目實施獲得4項國家自然科學(xué)基金項目的資助且歷時10年。共發(fā)表研究論文 69 篇，其中 SCI論文 34 篇，論文總影響因子 106.119，SCI 總他引580 次，其中SCI一區(qū)論文4篇，包括在Analytical Chemistry、Biosensors and Bioelectronics等IF＞5.0的期刊上發(fā)表論文，獲授權(quán)國家發(fā)明專利3件。

1）針對目前電化學(xué)傳感中常用的酶標(biāo)記物容易變性失活的問題，開發(fā)新的電化學(xué)探針。將金屬有機骨架材料和共價有機材料（COFs）及其與金屬納米顆粒的復(fù)合材料引入到免疫及適體傳感器中的制備中，研制了一系列傳感器用于疾病標(biāo)記物的檢測。

其中最具代表性的工作是利用多孔金屬有機骨架（MOFs）自身中心金屬離子作為電化學(xué)信號探針，構(gòu)建了電化學(xué)傳感器實現(xiàn)對疾病標(biāo)記物C-反應(yīng)蛋白（CRP）的檢測。MOFs不同于傳統(tǒng)的信號探針，不需要預(yù)處理和酸處理，解決了傳統(tǒng)酶促反應(yīng)所使用酶易失活帶來的靈敏度低及信號穩(wěn)定性差的問題，并且容易負載貴金屬從而固定抗體，大大簡化了檢測步驟并縮短了檢測時間。檢測原理圖見圖1（a）。研究成果發(fā)表后引起國內(nèi)外同行關(guān)注，被 SCI 期刊他引 91次，被Coordination Chemistry Review（424卷213520頁，420卷213222頁），Analytical Chemistry（92卷，2972-2978頁）等高水平雜志的綜述文章詳細闡述和引用。

圖1 以金屬有機框架材料為信號標(biāo)簽構(gòu)建的免疫傳感器的原理圖

2）針對復(fù)雜體系干擾較大的問題，該項目以核酸 DNA 為工具，構(gòu)建了系列生物傳感器，實現(xiàn)了復(fù)雜體系中特定目標(biāo)物(組氨酸、核酸酶及葡萄糖)的高靈敏度、高選擇性、成本低廉、簡單便捷的分析檢測。

3）針對環(huán)境樣品需要即時現(xiàn)場檢測的問題，設(shè)計、合成了一系列籠狀、棒狀、網(wǎng)狀等納米結(jié)構(gòu)，基于這些納米結(jié)構(gòu)獨特的光、電特性，開發(fā)了一系列適用于即時檢測的光、電化學(xué)傳感器及免疫層析片條，并將其應(yīng)用于毒素、Cu2+及生物分子的高靈敏檢測發(fā)現(xiàn)了將貴金屬納米管的陣列、銀摻雜的介孔硅納米顆粒作為電極材料或者標(biāo)記型的電活性物質(zhì)，它們表現(xiàn)出性能優(yōu)越的電催化活性，可實現(xiàn)對生物分子、毒素的檢測應(yīng)用。針對云南高原湖泊富營養(yǎng)化產(chǎn)生微囊藻毒素需要現(xiàn)場檢測的問題，合成一系列中空結(jié)構(gòu)的籠狀納米材料，如金納米籠、Pd-Au納米籠，并用于制備免疫層析片條及傳感器，解決了水樣中微囊藻毒素的即時快速檢測的問題。研究表明：試紙條作為一種便捷、穩(wěn)定、可實時監(jiān)測的傳感平臺在滇池等富營養(yǎng)化水體樣品中微囊藻毒素的檢測等方面扮演著重要的角色。

4）針對禁毒工作需求，通過開發(fā)新的可待因核酸適體以及基于可卡因核酸適體在可卡因存在條件下的構(gòu)象轉(zhuǎn)換，構(gòu)建了一系列用于毒品可待因、嗎啡和可卡因的高靈敏檢測。

其中最具代表性的工作采用SELEX技術(shù)首次篩選出可待因的核酸適體HL7-14，該核酸適體與可待因的結(jié)合能力強，特異性高，將其用于構(gòu)建可卡因的電化學(xué)核酸適體傳感器表現(xiàn)出了較強的特異性和靈敏度（線性范圍：10 pM～100 nM；檢測限：3 pM）。研究成果發(fā)表后引起國內(nèi)外同行關(guān)注，被 SCI期刊他引 35 次。受到Trends in Analytical Chemistry（第124卷115778）上的學(xué)術(shù)論文積極評述（圖2）。

圖2 基于課題組篩選的可待因適體所研制的傳感器示意圖

3 促進科學(xué)發(fā)展的重要意義

1）基于多孔有機骨架及核酸 DNA 技術(shù)所建立的 C-反應(yīng)蛋白、腫瘤標(biāo)記物、單核苷酸多態(tài)性（SNP）等疾病標(biāo)記物以及核酸酶、生物小分子（組氨酸、葡萄糖等）的傳感分析方法，解決了普通分析方法在分析生物樣品存在的靈敏度不高，選擇性不好的問題，有效解決了傳統(tǒng)酶促反應(yīng)所使用酶易失活帶來的靈敏度低及信號穩(wěn)定性差的問題，并且容易負載貴金屬從而固定抗體，大大簡化了檢測步驟并縮短了檢測時間。有望用于臨床分析，為心血管疾病、腫瘤及遺傳病的相關(guān)疾病的早期診斷及疾病發(fā)病機理研究提供有價值的理論依據(jù)和技術(shù)支持。該方法已用于真實血清樣品中 C 反應(yīng)蛋白的測定。

2）基于核酸適體的特異性構(gòu)建的毒品（可卡因、可待因、嗎啡）電化學(xué)適體傳感器，可對生物樣品中的毒品含量進行快速檢測，研究有利于禁毒戒毒工作和社會秩序的穩(wěn)定。

3）基于中空結(jié)構(gòu)的籠狀納米材料構(gòu)建的微囊藻毒素傳感器及免疫層析片條可用于滇池等富營養(yǎng)化水體中微囊藻毒素的現(xiàn)場檢測，對環(huán)境保護具有重要意義。

4 代表性論文

① Ting-Zhi Liu, Rong Hu*, Xi Zhang, Kun-Lei Zhang, Yi Liu, Xiao-Bing Zhang, Ru-Yan Bai, De-lei Li, Yun-Hui Yang*, Metal-organic frameworks nanomaterials as novel signal probes for electron transfer mediated ultrasensitive electrochemical immunoassay. Analytical Chemistry,(IF=6.32)

② Zhang Xi, Kuan Neng Chi, De-Lei Li,Yan Deng, YuChan Ma, Rong Hu * and YunhuiYang*,2D-Porphrinic Covalent Organic Framework-Based Aptasensor with Enhanced Photoelectrochemical Response for the Detection of C-Reactive Protein. Biosensors and Bioelectronics 2019,129, 64-71（IF=10.257）

③ Rong Hu, Xi Zhang, Qiang Xu, Dan-Qing Lu, Yun-Hui Yang, Quan-Qing Xu, Qiong Ruan, Liu-Ting Mo, Xiao-Bing Zhang. A universal aptameric biosensor: Multiplexed detection of small analytes via aggregated perylene-based broad-spectrum quencher. Biosensors and Bioelectronics 2017, 92 , 40-46.（IF=8.173）

④ Liangliang Huang, Xiaojuan Yang, Cui Qi, Xiaofang Niu, Chunling Zhao, Xiaohui Zhao, Dihua Shangguan, Yunhui Yang*, A label-free electrochemical biosensor based on a DNA aptamer against codeine.Analytica Chimica Acta，2013, 787（1）： 203-210（IF= 4.517）

⑤ Rong Hu, Ya-Ru Liu, Rong-Mei Kong, Michael J Donovan, Xiao-Bing Zhang, Weihong Tan, Guo-Li Shen, and Ru-Qin Yu, Double-strand DNA-templated formation of copper nanoparticles as fluorescent probe for label free nuclease enzyme detection, Biosensors and Bioelectronics,2013, 42, 31-35.（IF=6.451）

⑥ Kunlei Zhang, Kun Dai, RuyanBai,Yuchan Ma,Yan Deng, Delei Li,Xi Zhang, Rong Hu*, Yunhui Yang*, A competitive microcystin-LR immunosensor based on Au NPs@metal-organic framework (MIL-101),Chinese Chemical letters，2019, 30(3): 664-667(IF= 4.632)

⑦ Manlan Tao， Xiaofei Li , Zaisheng Wu, Meng Wang, Mei Hua, Yunhui Yang*, The preparation of label-free electrochemical immunosensor based on the Pt-Au alloy nanotube array for detection of human chorionic gonadotrophin. Clinica Chimica Acta, 2011, 412 (7-8): 550-555 （IF=2.535）

⑧ Yunhui Yang, Mehmet Ozsoz, Guodong Liu*,Gold nanocage-based lateral flow immunoassay for immunoglobulin G, Microchimica Acta,2017, 184(7): 2023-2029(IF=5.707)