下調(diào)髓系白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞中乳腺癌缺失因子1表達(dá)對(duì)其DNA損傷反應(yīng)的作用初探

董 林 田曉雪 梁愛斌

白血病是一種常見的血液系統(tǒng)腫瘤,目前,化學(xué)治療(簡稱化療)是治療白血病的主要方法。白血病細(xì)胞對(duì)抗癌藥物的耐藥是白血病化療失敗和疾病復(fù)發(fā)的主要原因。在白血病的常規(guī)治療中，大多數(shù)化療藥物(如蒽環(huán)類抗生素等)主要通過損傷白血病細(xì)胞DNA達(dá)到治療目的[1]，白血病細(xì)胞應(yīng)對(duì)DNA損傷的高效修復(fù)能力是造成其耐藥的主要因素[2]。因此，研究白血病細(xì)胞DNA損傷修復(fù)機(jī)制對(duì)于白血病的有效治療具有重要意義[3]。

DNA損傷應(yīng)答(DNA damage response，DDR)是真核生物識(shí)別細(xì)胞DNA損傷，并根據(jù)損傷的嚴(yán)重程度進(jìn)行DNA損傷修復(fù)，最終促進(jìn)細(xì)胞衰老或凋亡的復(fù)雜過程。當(dāng)細(xì)胞遭受內(nèi)源性或外源性因素刺激后，會(huì)造成一定程度的DNA損傷。單鏈或雙鏈DNA損傷被特定的感知復(fù)合物所識(shí)別，進(jìn)而招募下游激活蛋白，如：共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張RAD3相關(guān)蛋白(ATR)或共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變蛋白(ATM)，誘導(dǎo)其定位到損傷位置，隨后組蛋白H2A變體(H2AX)發(fā)生磷酸化，下游一系列DDR信號(hào)通路被激活。在正常情況下，機(jī)體可通過直接修復(fù)(direct repair，DR)、堿基切除修復(fù)(base excision repair，BER)等5種修復(fù)方式修復(fù)損傷的DNA鏈；然而嚴(yán)重的DNA損傷可造成細(xì)胞毒性，細(xì)胞無法通過以上方式修復(fù)DNA，將出現(xiàn)周期停滯、老化或凋亡[4]。

乳腺癌缺失因子1(deleted in breast cancer 1, DBC1)又稱為細(xì)胞周期和凋亡調(diào)節(jié)蛋白2(cell cycle and apoptosis regulator protein 2，CCAR2)，是小GTP酶類Rho家族的非典型成員[5]。研究[6]結(jié)果表明，DBC1在細(xì)胞生長過程中與多種物質(zhì)相互作用，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的衰老、代謝、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)等多種生理活動(dòng)。同時(shí)，DBC1可以結(jié)合并調(diào)節(jié)多種DNA損傷反應(yīng)因子，如沉默信息調(diào)節(jié)因子同源類似物1(silent mating type information regulation 2 homolog 1，SIRT1)[7]，組蛋白去乙?；?(histone deacetylase 3, HDAC3)[8]等，這提示DBC1間接參與到細(xì)胞的DDR中。研究[9]報(bào)道，在紫外線照射、γ-射線照射或依托泊苷(etoposide，vp16)處理后，DBC1可通過ATM/ATR-DBC1-SIRT1-p53這一信號(hào)途徑參與細(xì)胞DDR。另有研究[10]發(fā)現(xiàn)，DBC1可通過同源重組(homologous recombination, HR)修復(fù)途徑參與DNA修復(fù)機(jī)制的激活，而下調(diào)DBC1可導(dǎo)致細(xì)胞周期的停滯。因此，DBC1在細(xì)胞DDR中發(fā)揮重要作用。

既往關(guān)于DBC1的研究主要集中在實(shí)體瘤，如肝癌[11]等，其表達(dá)與臨床分期、預(yù)后相關(guān)。但DBC1在血液腫瘤，特別是其在白血病DDR中的作用還不明確。因此,設(shè)計(jì)以下實(shí)驗(yàn)擬探究DBC1在白血病細(xì)胞DNA損傷修復(fù)中的作用，以期發(fā)現(xiàn)抗白血病細(xì)胞耐藥的新方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系THP1、髓系白血病細(xì)胞系K562、Kasumi和KG1、急性早幼粒細(xì)胞系NB4、T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系Jurkat、B淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系Nalm6、Burkitt淋巴瘤細(xì)胞系Namalwa 共8種白血病及淋巴瘤細(xì)胞系均為同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院血液學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。RPMI-1640培養(yǎng)基、IMDM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)均購自美國Gibco公司； RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量(qRT)-PCR試劑盒均購自日本TaKaRa公司；蛋白質(zhì)裂解液、上樣緩沖液、蛋白質(zhì)標(biāo)志物均購自上海雅酶生物科技有限公司；質(zhì)粒大量提取試劑盒購自德國Qiagen公司；快速質(zhì)粒小量提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；凋亡檢測試劑盒購自美國eBioscience公司；細(xì)胞周期檢測試劑盒、凋亡試劑盒購自美國BD公司；DBC1抗體、c-MYC抗體、乳腺癌易感基因1(BRAC1)蛋白質(zhì)抗體、DNA依賴性蛋白激酶催化亞基(catalytic subunit of the DNA-dependent protein kinase, DNA-PKcs)抗體、β-actin抗體均購自美國Abcam公司；γ-H2AX抗體、抗鼠二抗、抗兔二抗均購自美國Cell Signaling Technology公司；熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；單細(xì)胞凝膠電泳分析試劑盒和單細(xì)胞凝膠電泳儀均購自美國Trevigen公司；熒光定量PCR儀(LightCycler 96)購自美國羅氏公司；流式細(xì)胞儀(cyto FLEX LX)購自美國BD公司。

1.2 細(xì)胞系的常規(guī)培養(yǎng) K562細(xì)胞系采用IMDM培養(yǎng)基，添加10% FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)為0.05的 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。THP1、Kasumi、KG1、NB4、Jurkat、Nalm6和Namalwa細(xì)胞系均采用RPMI-1640培養(yǎng)基，添加10% FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d更換1次培養(yǎng)基，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 DBC1在白血病及淋巴瘤細(xì)胞系中表達(dá)的檢測

1.3.1 qRT-PCR檢測DBC1 mRNA表達(dá) 檢測8個(gè)細(xì)胞系中DBC1 mRNA的表達(dá)。應(yīng)用日本TaKaRa公司的RNA提取試劑盒抽取細(xì)胞RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，隨后應(yīng)用LightCycler 96進(jìn)行qRT-PCR檢測。采用兩步法行DNA擴(kuò)增，95 ℃ 5 s變性，60 ℃ 34 s退火延伸，循環(huán)40次。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。所用引物序列：DBC1正向引物5’-ATG TCC CAG TTT AAG CGC CAG-3’，反向引物5’-CCC AAA GTA GTC ATG CAA GCT G-3’。GAPDH正向引物5’-AAC ATC ATC CCT GCC TCT ACT-3’，反向引物5’-CCG ACG CCT GCT TCA C-3’。

1.3.2 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測DBC1蛋白質(zhì)的表達(dá) 檢測8個(gè)細(xì)胞系中DBC1蛋白質(zhì)的表達(dá)。在待測細(xì)胞中加入蛋白質(zhì)裂解液，提取細(xì)胞蛋白質(zhì)，采用BCA法測定細(xì)胞蛋白質(zhì)濃度。加入上樣緩沖液制備蛋白質(zhì)樣品，配置電泳濃縮膠和分離膠。上樣后90 V、2 h電泳，220 mA、2 h轉(zhuǎn)膜，經(jīng)5% 牛血清白蛋白(BSA)封閉、對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)一抗孵育、二抗孵育后使用Amersham Imager 600顯影，Image J 15.3進(jìn)行蛋白質(zhì)條帶灰度分析。

1.4 慢病毒構(gòu)建及K562細(xì)胞轉(zhuǎn)染 采用RNA干擾(RNAi)技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定的DBC1基因沉默細(xì)胞系。DBC1核心干擾序列參照文獻(xiàn)[12]，短發(fā)夾RNA(shRNA)具體序列見表1。合成好的序列經(jīng)退火融合成雙鏈，連接至PLVX-shRNA 慢病毒質(zhì)粒載體(日本TaKaRa公司)。經(jīng)純化、測序鑒定后獲得目的質(zhì)粒。將PLVX-shRNA慢病毒質(zhì)粒與2種輔助質(zhì)粒 VSVG、delta 89按10∶5∶7的比例混合后滴于融合度約為60%的293T細(xì)胞懸液中，48 h及72 h后收取病毒液，獲得陰性對(duì)照(SCR)病毒和DBC1干擾(DBC1-sh1和DBC1-sh2)病毒。根據(jù)感染復(fù)數(shù)計(jì)算所需病毒量，在處于對(duì)數(shù)生長期的K562細(xì)胞中分別加入適量SCR病毒(SCR組)、DBC1-sh1病毒(DBC1-sh1組)、DBC1-sh2病毒(DBC1-sh2組)。采用2 000 r/min，離心半徑7.6 cm，離心2 h，轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞。蛋白質(zhì)印跡法檢測3組細(xì)胞DBC1表達(dá),驗(yàn)證下調(diào)效率。

表1 shRNA序列

1.5 藥物處理造成細(xì)胞DNA損傷 收集對(duì)數(shù)生長期SCR組、DBC1-sh1組和DBC1-sh2組細(xì)胞，PBS洗滌2次后，用細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/mL。按1 mL/L劑量在細(xì)胞懸液中加入濃度為20 mmol/L的vp16?；靹蚝?，將細(xì)胞懸液加至6孔板或24孔板中，每組細(xì)胞3個(gè)復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)4 h。并進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

1.5.1 溴脫氧核苷尿嘧啶(BrdU)核酸摻入實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞周期分布 在vp16處理前后分別檢測各組細(xì)胞的細(xì)胞周期。將培養(yǎng)48 h的細(xì)胞密度調(diào)整至1×106/mL，每組3個(gè)復(fù)孔，按照1∶1 000加入3 mg/L BrdU，培養(yǎng)2 h后收集各組細(xì)胞。邊渦旋邊滴入70%的乙醇重懸細(xì)胞，-20 ℃孵育過夜。次日用染色緩沖液[含1%FBS的PBS，0.09%三氮化鈉(NaN3)]洗滌2次后將細(xì)胞重懸于2 mL 2 mol/L HCl和0.5% Triton X-100中，室溫孵育30 min。染色緩沖液洗滌后加入500 μL 0.1 mol/L的四硼酸鈉(Na2B4O7)重懸細(xì)胞2 min，洗滌后用100 μL染色緩沖液重懸，加入抗-BrdU-異硫氰酸熒光素(FITC)5 μL，室溫避光孵育45 min。加入5 μL碘化丙啶(PI)，室溫避光孵育5 min。加入400 μL 染色緩沖液重懸后使用流式細(xì)胞儀檢測，使用FlowJo v10分析各組細(xì)胞周期。

1.5.2 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力 在vp16處理前后，分別將SCR組、DBC1-sh1組和DBC1-sh2組細(xì)胞稀釋至1×105/mL。將2×RPMI-1640培養(yǎng)基、FBS和1.2%軟瓊脂按照3∶2∶5的比例混合配制下層膠，將2×RPMI-1640、FBS、1.2%軟瓊脂和無菌水按照6∶4∶5∶5的比例混合配制上層膠備用。在6孔板中每孔加入1.5 mL下層膠，4 ℃冰箱中放置15 min。然后將1 mL上層膠和100 μL細(xì)胞懸液混勻，加入到6孔板中，37 ℃培養(yǎng)箱中放置30 min，4 ℃冰箱中放置15 min后轉(zhuǎn)移至37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察1周左右。每組細(xì)胞3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。期間，每3 d補(bǔ)充適量新鮮培養(yǎng)液。7～10 d后于顯微鏡下觀察集落形成情況，細(xì)胞數(shù)>50/集落則為陽性集落。各組細(xì)胞克隆形成能力的差異即為各組細(xì)胞增殖能力的差異。

1.5.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡水平 在vp16處理前后分別進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)。每組至少收集1×105個(gè)細(xì)胞，用結(jié)合緩沖液洗滌2次后加入100 μL重懸。在細(xì)胞懸液中加入5 μL膜聯(lián)蛋白V (Annexin V)，室溫避光10 min，加入5 μL PI，室溫避光5 min后加入400 μL結(jié)合緩沖液重懸，使用流式細(xì)胞儀檢測，F(xiàn)lowJo v10分析各組細(xì)胞凋亡水平。

1.5.4 DNA損傷相關(guān)和非同源性末端接合(non-homologous end joining，NHEJ)途徑關(guān)鍵蛋白質(zhì)的檢測 γ-H2AX 的形成是 DNA 雙鏈斷裂的標(biāo)志，在vp16處理前后，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測各組細(xì)胞γ-H2AX 的表達(dá)水平。在vp16處理后采用蛋白質(zhì)印跡法檢測BRAC1、DNA-PKcs、c-MYC的表達(dá)水平。使用Image J 1.53進(jìn)行蛋白質(zhì)條帶灰度分析。

1.5.5 單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)檢測vp16處理后細(xì)胞DNA損傷程度 在vp16處理后，將各組細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105/mL。在沸水中溶解低熔點(diǎn)瓊脂糖，將50 μL 溶解后的低熔點(diǎn)瓊脂糖和10 μL細(xì)胞懸液混合，輕彈混勻后加在玻片圓槽處。將玻片放入4 ℃冰箱凝固30 min,放入裂解緩沖液中4 ℃過夜。將玻片浸入50 mL 解螺旋液漂洗2次，隨后浸入預(yù)冷的解螺旋液中1 h。電壓21 V，電泳30 min。將玻片用無菌水漂洗2次后放入70%乙醇中浸沒5 min。將玻片置于37 ℃烘箱晾干10～15 min。每個(gè)圓槽加入100 μL SYBR Gold，避光染色30 min。短暫瀝水后，將玻片放置在37 ℃烘箱內(nèi)完全晾干。使用熒光顯微鏡拍照，細(xì)胞損傷越嚴(yán)重，電泳拖尾越明顯，尾部DNA含量越高。應(yīng)用Comet Assay Ⅳ軟件分析每組細(xì)胞DNA損傷程度。

1.6 Kaplan-Meier生存分析 髓系白血病患者中DBC1的mRNA表達(dá)情況，以及患者生存信息均經(jīng)癌癥基因組圖譜(TCGA) 腫瘤數(shù)據(jù)庫 (https://cancergenome.nih.gov/)及其分析門戶網(wǎng)站(http://www.cbioportal.org/) 檢索下載。

2 結(jié) 果

2.1 DBC1在白血病細(xì)胞系尤其是K562細(xì)胞高表達(dá) qRT-PCR發(fā)現(xiàn)，以DBC1 mRNA相對(duì)表達(dá)量最低的THP1細(xì)胞為對(duì)照，THP1、Namalwa、Jurkat、Nalm6、NB4、KG1、Kasumi和K562細(xì)胞的DBC1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.00、2.47±1.03、3.31±1.61、4.48±2.53、5.71±1.68、9.10±1.10、9.83±0.42、10.84±0.78。DBC1 mRNA在髓系白血病細(xì)胞系KG1、Kasumi、K562中相對(duì)表達(dá)量均顯著高于THP1細(xì)胞(P值均<0.05)，且在K562細(xì)胞系中表達(dá)量最高。蛋白質(zhì)印跡法檢測THP1、Namalwa、Jurkat、Nalm6、NB4、KG1、Kasumi和K562細(xì)胞的DBC1蛋白質(zhì)，其相對(duì)表達(dá)量依次為0.28±0.05、0.49±0.04、0.51±0.07、0.63±0.02、0.68±0.15、1.00±0.01、1.10±0.12、1.73±0.02。KG1、Kasumi、K562細(xì)胞的DBC1相對(duì)表達(dá)量均顯著高于THP1細(xì)胞(P值均<0.05)。見圖1。

泳道 1 THP1 2 KG1 3 Nalm6 4 Jurkat5 Namalwa 6 K562 7 Kasumi 8 NB4圖1 蛋白質(zhì)印跡法檢測各血液腫瘤細(xì)胞系中DBC1蛋白質(zhì)表達(dá)情況

2.2 DBC1表達(dá)與髓系白血病患者生存率的關(guān)系 檢索TCGA腫瘤數(shù)據(jù)庫，獲得173例髓系白血病患者DBC1表達(dá)水平與生存情況數(shù)據(jù)。繪制生存曲線，通過log-rank檢驗(yàn)分析DBC1 與總體生存率(overall survival, OS) 的關(guān)系，DBC1高表達(dá)的患者生存率顯著低于低表達(dá)的患者 (P=0.012 2)，見圖2。

圖2 生存曲線分析TCGA腫瘤數(shù)據(jù)庫中DBC1表達(dá)水平與髓系白血病患者OS之間的關(guān)系

2.3 慢病毒轉(zhuǎn)染K562并驗(yàn)證下調(diào)效率 為進(jìn)一步研究DBC1基因在髓系白血病細(xì)胞中的生物學(xué)功能，本實(shí)驗(yàn)選擇DBC1表達(dá)較高的髓系白血病細(xì)胞K562構(gòu)建DBC1基因的shRNA的干擾載體。SCR組、DBC1-sh1組和DBC1-sh2組的DBC1相對(duì)表達(dá)量分別為0.77±0.05、0.07±0.01和0.30±0.13，兩干擾組的DBC1相對(duì)表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組(P值均<0.05)。見圖3。表明成功建立了穩(wěn)定下調(diào)DBC1的髓系白血病細(xì)胞株。

1 SCR 2 DBC1-sh1 3 DBC1-sh2圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測shRNA DBC1慢病毒感染后DBC1蛋白質(zhì)表達(dá)情況

2.4 下調(diào)DBC1表達(dá)后，藥物處理對(duì) K562細(xì)胞細(xì)胞周期的影響 vp16處理前，DBC1-sh1組和DBC1-sh2組與SCR組細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。而用vp16處理4 h造成細(xì)胞DNA損傷后，DBC1-sh1組和DBC1-sh2組的S期細(xì)胞百分比均顯著高于SCR組(P值均<0.05),G2/M期細(xì)胞百分比均顯著低于SCR組(P值均<0.05)。見圖4和表2。

2.5 下調(diào)DBC1表達(dá)后，藥物處理對(duì)K562細(xì)胞的克隆形成能力的影響 vp16處理前，DBC1-sh1組、DBC1-sh2組與SCR組形成的克隆大小均無明顯差異， 而vp16處理造成細(xì)胞DNA損傷后，DBC1-sh1組和DBC1-sh2組細(xì)胞形成的克隆大小較SCR組明顯減小，見圖5。vp16處理前，SCR組、DBC1-sh1組和DBC1-sh2組的克隆形成數(shù)目分別為(108±8)、(96±5)和(92±4)個(gè)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)；vp16處理后，SCR組的克隆形成數(shù)目為(58±8)個(gè)， DBC1-sh1和DBC1-sh2組分別為(13±2)和(24±2)個(gè)，兩干擾組克隆數(shù)目均顯著少于對(duì)照組(P值均<0.05)。

表2 K562細(xì)胞各vp16處理前后細(xì)胞周期細(xì)胞百分比比較

2.6 下調(diào)DBC1后，藥物處理對(duì)K562細(xì)胞凋亡的影響 vp16處理前，DBC1-sh1、DBC1-sh2和SCR組凋亡細(xì)胞百分比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。vp16處理4 h造成細(xì)胞DNA損傷后，DBC1-sh1組凋亡細(xì)胞百分比為(38.37±0.20)%，顯著高于SCR組凋亡細(xì)胞百分比[(35.21±0.58)%,P<0.05]。DBC1-sh2組凋亡細(xì)胞百分比為(35.78±0.55)%，與SCR組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖6。

A、B、C依次為vp16處理前SCR、DBC1-sh1、DBC2-sh2組 D、E、F依次為vp16處理4 h后SCR、DBC1-sh1、DBC2-sh2組圖5 各組vp16處理前后細(xì)胞克隆形成情況示意圖

A、B、C依次為vp16處理前SCR、DBC1-sh1、DBC2-sh2組 D、E、F依次為vp16處理4 h后SCR、DBC1-sh1、DBC2-sh2組(Q2與Q3的百分?jǐn)?shù)之和為凋亡細(xì)胞百分比)圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡情況代表圖

2.7 DBC1對(duì)K562細(xì)胞DNA損傷程度的影響

2.7.1 DNA損傷相關(guān)蛋白質(zhì)的比較 vp16處理前，SCR、DBC1-sh1、DBC1-sh2組細(xì)胞γ-H2AX相對(duì)表達(dá)量分別為0.80±0.28、1.51±0.24和1.10±0.06；DBC1-sh1組細(xì)胞DNA損傷較SCR組加重(P<0.05)。vp16處理后，SCR、DBC1-sh1和DBC1-sh2組細(xì)胞γ-H2AX相對(duì)表達(dá)量分別為1.30±0.05、2.00±0.04和1.32±0.22；DBC1-sh1組細(xì)胞DNA損傷程度顯著重于SCR組(P<0.01)。見圖7。

圖7 vp16處理前后K562細(xì)胞γ-H2AX表達(dá)水平

2.7.2 單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果 vp16處理后，SCR、DBC1-sh1和DBC1-sh2組細(xì)胞彗尾DNA含量百分比分別為(20.21±6.65)%、(54.64±11.21)%和(39.09±15.36)%；DBC1-sh1組細(xì)胞DNA損傷程度顯著重于SCR組(P<0.01)。見圖8。提示下調(diào)DBC1表達(dá)的K562細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力明顯降低。

A、B、C依次為vp16處理前SCR、DBC1-sh1、DBC2-sh2組，D、E、F依次為vp16處理后SCR、DBC1-sh1、DBC2-sh2組圖8 單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.8 下調(diào)DBC1對(duì)K562細(xì)胞NHEJ途徑關(guān)鍵蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響 SCR、DBC1-sh1和DBC1-sh2組細(xì)胞的c-MYC相對(duì)表達(dá)量分別為0.79±0.00、2.00±0.04和1.36±0.17；DNA-PKcs相對(duì)表達(dá)量分別為0.26±0.04、0.55±0.16和0.48±0.07。兩干擾組c-MYC和DNA-PKcs相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組(P值均<0.05)。DBC1-sh1和DBC1-sh2組的BRAC1相對(duì)表達(dá)量(0.29±0.13和0.31±0.12)均顯著低于SCR組(0.74±0.07，P值均<0.05)。見圖9。這提示下調(diào)DBC1表達(dá)影響了K562細(xì)胞NHEJ修復(fù)途徑。

1 SCR 2 DBC1-sh1 3 DBC1-sh2圖9 蛋白質(zhì)印跡法檢測NHEJ途徑關(guān)鍵蛋白質(zhì)表達(dá)情況

3 討 論

DBC1在不同腫瘤中的表達(dá)存在多樣性，如在肝癌[11]、胃癌[13]中呈低表達(dá)，在乳腺癌[14]、結(jié)直腸癌[15]等癌癥中呈高表達(dá)。因此，DBC1在腫瘤形成和發(fā)展中的作用十分復(fù)雜。本研究通過查詢數(shù)據(jù)庫，利用Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，DBC1在髓系白血病患者中異常高表達(dá)，且高表達(dá)者預(yù)后不良。這提示DBC1可能作為促癌基因參與髓系白血病，并且是潛在的獨(dú)立預(yù)后因子。

白血病細(xì)胞在受到DNA損傷時(shí)常具有較強(qiáng)的修復(fù)能力，這使得細(xì)胞對(duì)化療藥物耐受。有效地干預(yù)白血病細(xì)胞DNA修復(fù)系統(tǒng),可在很大程度上改善白血病常規(guī)化療的療效和疾病的預(yù)后，這也是目前白血病DDR研究的熱點(diǎn)。本研究采用DBC1高表達(dá)的髓系白血病細(xì)胞系K562，構(gòu)建DBC1表達(dá)下調(diào)的慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)化療藥物vp16處理造成細(xì)胞DNA損傷后，K562細(xì)胞周期被阻滯于S期，細(xì)胞增殖能力下降，凋亡增加。單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)表明，下調(diào)DBC1的K562細(xì)胞DNA損傷程度顯著重于對(duì)照組細(xì)胞。蛋白質(zhì)印跡法顯示，DNA損傷標(biāo)志物γ-H2AX表達(dá)上調(diào)。這提示DBC1下調(diào)后，細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力減弱。

細(xì)胞NHEJ修復(fù)直接通過將DNA雙鏈斷裂末端連接來介導(dǎo)修復(fù)，發(fā)生在整個(gè)細(xì)胞周期。哺乳動(dòng)物體內(nèi)的DNA雙鏈斷裂的修復(fù)以NHEJ方式為主[16]。Ku蛋白[17]、DNA-PKcs[18]、BRAC1[19]、c-MYC[20]等多種蛋白因子參與NHEJ修復(fù)途徑[21]。為了探究DBC1對(duì)K562細(xì)胞NHEJ修復(fù)通路的影響，本研究采用蛋白質(zhì)印跡法檢測了NHEJ關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平變化。為了探究DBC1是否會(huì)影響細(xì)胞NHEJ修復(fù)，本研究采用蛋白質(zhì)印跡法檢測了NHEJ關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)表達(dá)情況。結(jié)果顯示，BRAC1在DBC1下調(diào)組表達(dá)顯著降低，DNA-PKcs、c-MYC表達(dá)顯著升高。表明下調(diào)DBC1降低了K562細(xì)胞NHEJ修復(fù)能力。

綜上所述，本研究證實(shí)DBC1參與髓系白血病細(xì)胞系K562的DDR，初步明確了其作用機(jī)制，為提高白血病的化療效果提供了潛在靶點(diǎn)和新思路。盡管本文初步闡釋了DBC1在K562細(xì)胞系DDR中的作用，然而髓系白血病中與DBC1直接或間接作用的分子尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。