基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析荊芥—防風(fēng)藥對(duì)的分子作用機(jī)制?

吳春鳳，黃艷霞，鄭景輝

1柳州市人民醫(yī)院，廣西 柳州 545006；2廣西中醫(yī)藥大學(xué)瑞康醫(yī)院

荊芥和防風(fēng)是經(jīng)典的祛風(fēng)解表藥對(duì)，以其作為君藥的眾多復(fù)方廣泛用于呼吸系統(tǒng)疾病、皮膚病的治療。荊芥味苦性溫，歸肝肺經(jīng)，善祛風(fēng)解表、透疹、止血［1］。藥理研究表明，其有效成分揮發(fā)油、黃酮類(lèi)及萜類(lèi)化合物具有解熱［2］、抗炎［3-4］、鎮(zhèn)痛［5］、抗菌抗腫瘤［6-7］等作用。防風(fēng)味辛、甘，歸肝、脾、膀胱經(jīng)，具有祛風(fēng)解表、勝濕止痛、止痙等作用，臨床常用于治療外感表證、風(fēng)疹瘙癢、風(fēng)濕痹痛等［8］。藥理研究表明，防風(fēng)具有抗炎［9］、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜［10］、抗腫瘤［11］、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抗血栓［12］等作用。荊芥與防風(fēng)有相似的藥理作用，兩藥相須為用，相輔相成，共奏發(fā)寒散邪之功。研究表明，表邪是外邪侵入人體肌膚所引起的癥候群，即上呼吸道感染和傳染病初期的癥狀。研究證實(shí)，解表藥的解表功效與抗炎作用相類(lèi)似，而病毒屬于中醫(yī)學(xué)六淫范疇，是引起表證的主要病因之一，因此解表藥的藥理作用研究主要體現(xiàn)在抗炎、抗病毒及抗過(guò)敏方面［13］。藥理學(xué)研究證實(shí)了荊芥-防風(fēng)藥對(duì)具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、抗病毒等作用，而對(duì)其為什么能解除表證的研究尚不能全面、深入闡釋其作用機(jī)制。本研究以系統(tǒng)生物學(xué)為指導(dǎo)，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，從整體水平上分析“藥物-靶點(diǎn)”“靶點(diǎn)-靶點(diǎn)”“分子-細(xì)胞-生物過(guò)程-信號(hào)通路”復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，推導(dǎo)荊芥與防風(fēng)這組藥對(duì)祛風(fēng)解表的可能作用機(jī)理，為利用現(xiàn)代科學(xué)方法、豐富和發(fā)展中醫(yī)藥，實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化提供參考。

1 資料與方法

1.1 對(duì)荊芥-防風(fēng)藥對(duì)化學(xué)成分的收集及活性化合物的篩選從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（traditional Chinese medicines systems pharmacology platform，TCMSP）（http：//lsp.Nwsuaf.Edu.cn/tcmsp/php），檢索荊芥-防風(fēng)藥對(duì)的化學(xué)成分，篩選出口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30、類(lèi)藥性（drug-likeness，DL）≥0.18［14-15］，的候選化合物成分，作為荊芥-防風(fēng)藥對(duì)的活性化學(xué)物。

1.2 收集荊芥-防風(fēng)活性化合物的靶點(diǎn)蛋白及構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)蛋白網(wǎng)絡(luò)圖通過(guò)TCMSP和DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索荊芥-防風(fēng)藥對(duì)活性化合物的靶點(diǎn)蛋白，將預(yù)測(cè)靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org/），檢索并剔除重復(fù)、非人源靶點(diǎn)，并轉(zhuǎn)化為活性化合物規(guī)范的靶點(diǎn)蛋白的基因標(biāo)識(shí)符（gene symbol）。將荊芥-防風(fēng)藥對(duì)活性化合物及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)蛋白信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0軟件，進(jìn)行可視化并計(jì)算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，構(gòu)建荊芥-防風(fēng)活性化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.3 構(gòu)建靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（protein protein interaction，PPI）將荊芥-防風(fēng)藥對(duì)活性化合物的靶點(diǎn)蛋白輸入STRING 10.5在線軟件（http：//string-db.org）檢索框中，限定研究物種為“Homo spaiens”，設(shè)置打分值高于0.9的最高置信度的數(shù)據(jù)，獲得PPI及互作信息，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0（http：//www.Cytoscape.org/）軟件進(jìn)行可視化及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，PPI圖中節(jié)點(diǎn)的顏色、大小反應(yīng)節(jié)點(diǎn)Degree值，邊的顏色、粗細(xì)反映節(jié)點(diǎn)間Combined score值。本研究基于以下參數(shù)：平均最短路徑（average shortest path length，ASPL）、介數(shù)中心性（betweenness centrality，BC）、中心接近度（closeness centrality，CC）、聚類(lèi)系數(shù)（clustering coefficient，CC）、連通度（degree），以評(píng)估節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的重要程度。

1.4 基因本體（gene ontology,GO）及信號(hào)通路分類(lèi)將荊芥-防風(fēng)活性化合物靶點(diǎn)上傳到David數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/），以人類(lèi)全基因組為背景基因和參照集合，進(jìn)行GO的生物學(xué) 過(guò) 程（biological process，BP）、細(xì) 胞 組 成（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）功能富集分析和KEGG信號(hào)通路分析。利用Cytoscape 3.7.0軟件計(jì)算出富集因子并繪制氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 化學(xué)成分及活性成分篩選在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索出與荊芥有關(guān)的化學(xué)成分有159種，與防風(fēng)相關(guān)的化學(xué)成分有173種，兩者含有31種相同成分，故而從荊芥-防風(fēng)藥對(duì)共檢索出相關(guān)化學(xué)成分301種。通過(guò)口服生物利用度和類(lèi)藥性分析發(fā)現(xiàn)：在荊芥和防風(fēng)中，分別有11、18種化合物表現(xiàn)出良好的口服生物利用度（OB≥30%）和類(lèi)藥性（DL≥0.18），其中β-谷甾醇（beta-sitosterol）和谷甾醇（sitosterol）為荊芥和防風(fēng)共有化合物，故荊芥-防風(fēng)藥對(duì)共篩選出27種活性化合物。見(jiàn)表1。

表1 通過(guò)OB和DL預(yù)測(cè)的荊芥-防風(fēng)中的27種活性化合物信息（荊防散有效成分表）

2.2 化合物-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析在TCMSP和DRUGBANK數(shù)據(jù)庫(kù)中分別檢索“荊芥-防風(fēng)”藥對(duì)27種活性化合物的相關(guān)靶點(diǎn)蛋白，其中槲皮素（quercetin）相關(guān)靶點(diǎn)最多（154個(gè)），其次是木犀草素（luteolin）靶點(diǎn)57個(gè)、β-谷甾醇（beta-sitosterol）靶點(diǎn)46個(gè)、漢黃芩素（wogonin）靶點(diǎn)45個(gè)、豆甾醇（stigmasterol）靶點(diǎn)31個(gè)，而角鯊烯（supraene）在上述兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中還未有相關(guān)靶點(diǎn)。總共檢索出509個(gè)靶點(diǎn)，剔除重復(fù)的、非人源的靶點(diǎn)，結(jié)合Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)確認(rèn)及轉(zhuǎn)換，最終共得到208個(gè)靶點(diǎn)。利用Cytoscape軟件構(gòu)建“荊芥-防風(fēng)”藥對(duì)活性化合物-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中包含234個(gè)節(jié)點(diǎn)（2個(gè)化合物和208個(gè)潛在靶標(biāo)）和504條邊。在網(wǎng)絡(luò)中，粉色節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表化合物，一個(gè)節(jié)點(diǎn)的度（degree）表示網(wǎng)絡(luò)中和節(jié)點(diǎn)相連的路線的條數(shù)。經(jīng)過(guò)Network analysis分析，得出208個(gè)靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的度（degree），其中前列腺素過(guò)氧化物合酶2（prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2）度值最大（23），其次為絲氨酸蛋白酶（dipeptidyl peptidase 4，DPP4）、F2（prothrombin，F(xiàn)2）、HSP90（heat shock protein HSP 90-alpha，HSP90）、PTGS1（prostaglandin G/H synthase 1，PTGS1）、NCOA2（nuclear receptor coactivator 2，NCOA2）、SCN5A（sodium channel protein type 5 subunit alpha，SCN5A）等，這些度值（連通度）高的藥物化合物度值越大，在荊芥-防風(fēng)藥對(duì)的藥理功能中發(fā)揮重要作用的可能性越大。見(jiàn)圖1。

圖1 荊芥-防風(fēng)藥對(duì)化合物成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 潛在靶點(diǎn)的拓?fù)鋵W(xué)分析將208個(gè)潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入string軟件中構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，將得到的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治?。荊芥-防風(fēng)藥對(duì)潛在靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)有118個(gè)節(jié)點(diǎn)（90個(gè)靶蛋白未參與蛋白的相互作用），經(jīng)計(jì)算后可知，平均連通度約為4.068，平均最短路徑長(zhǎng)度為3.074，平均介數(shù)約為0.058，平均聚類(lèi)系數(shù)約為0.314。度值大的節(jié)點(diǎn)被認(rèn)為是中心節(jié)點(diǎn)，其中度值超過(guò)平均數(shù)的節(jié)點(diǎn)有35個(gè)，說(shuō)明這35個(gè)節(jié)點(diǎn)作為蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的核心節(jié)點(diǎn)，可能是荊芥-防風(fēng)藥對(duì)化合物作用的關(guān)鍵靶標(biāo)。見(jiàn)圖2、表2。

表2 荊芥-防風(fēng)藥對(duì)潛在靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩?/p>

圖2 荊芥-防風(fēng)藥對(duì)化學(xué)成分靶點(diǎn)蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

續(xù)表2

2.4 荊芥-防風(fēng)藥對(duì)作用關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO分析和KEGG分析將荊芥-防風(fēng)藥對(duì)35個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入David數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO分析和KEGG分析。經(jīng)過(guò)Bonferroni校正P值小于0.05，GO富集分析得到127個(gè)生物學(xué)過(guò)程，包括一氧化氮生物合成過(guò)程的正調(diào)控、對(duì)藥物的反應(yīng)、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)節(jié)、DNA模板轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、對(duì)乙醇的反應(yīng)等；20個(gè)細(xì)胞組成，包括核漿、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性蛋白激酶全酶復(fù)合物、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外間隙、細(xì)胞液等；31個(gè)分子功能，包括識(shí)別蛋白結(jié)合（identical protein binding）、細(xì)胞因子活性（cytokine activity）、酶結(jié)合（enzyme binding）、一氧化氮合成酶調(diào)節(jié)活性（nitric-oxide synthase regulator activity）、蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合（protein complex binding）等，GO分析注釋見(jiàn)圖3。KEGG通路富集分析顯示荊芥-防風(fēng)藥對(duì)35個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)涉及80條信號(hào)通路，包括：腫瘤信號(hào)通路（tumor signaling pathways）、乙肝病毒（hepatitis B）、膀胱癌（bladder cancer）、I型人類(lèi)嗜T細(xì)胞病毒感染（HTLV-I infection）、小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer）、胰腺癌（pancreatic cancer）、PI3K-Akt信號(hào)通路（PI3KAkt signaling pathway）、p53信 號(hào) 通 路（p53 signaling pathway）等。荊芥-防風(fēng)藥對(duì)的作用靶點(diǎn)涉及多種生物過(guò)程及多條通路，說(shuō)明荊芥-防風(fēng)藥對(duì)可以通過(guò)調(diào)節(jié)這些生物過(guò)程和通路來(lái)發(fā)揮治療作用。見(jiàn)圖3—4。

圖3 荊芥-防風(fēng)作用靶點(diǎn)的GO分析

2.5 荊芥-防風(fēng)藥對(duì)作用關(guān)鍵靶點(diǎn)生物學(xué)過(guò)程及信號(hào)通路聚類(lèi)分析對(duì)荊芥-防風(fēng)藥對(duì)的35個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)參與機(jī)體的生物學(xué)過(guò)程進(jìn)行聚類(lèi)，可將其大致分為細(xì)胞代謝過(guò)程、血管生成和收縮、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)和氨基酸磷酸化的調(diào)控等。荊芥-防風(fēng)藥對(duì)的35個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)作用的信號(hào)通路共富集出80條，包括癌癥信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路、P53信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路等，且這些通路是多個(gè)靶點(diǎn)共同調(diào)控的，如35個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)中有16個(gè)靶點(diǎn)（PTEN、CDK2、AKT1、CCN D1、CDKN1A、VEGFA、NOS3、MYC、IL2等）富集在PI3K/AKT信號(hào)通路上，見(jiàn)圖5。推測(cè)荊芥-防風(fēng)可能通過(guò)這些關(guān)鍵靶點(diǎn)參與到炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程和調(diào)控相關(guān)通路發(fā)揮治療作用。見(jiàn)圖5。

圖5 荊芥防風(fēng)藥對(duì)16個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)在PI3K/AKT信號(hào)通路中的分布圖

圖4 荊芥-防風(fēng)藥對(duì)有效化合成分作用的核心靶點(diǎn)的KEGG分析氣泡圖

3 討論

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)荊芥和防風(fēng)的主要活性成分、作用的靶點(diǎn)、參與的生物學(xué)過(guò)程及靶點(diǎn)涉及的信號(hào)通路進(jìn)行了探討。根據(jù)ADME利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)找尋到荊芥-防風(fēng)藥對(duì)共27種有效活性成分，其中槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、漢黃芩素、豆甾醇等可能是荊芥-防風(fēng)發(fā)揮療效的主要活性成分。槲皮素作為一種廣泛存在于自然界的天然黃酮類(lèi)化合物，具有多重生物活性，有抗氧化、抗病毒、抗炎等作用，在細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中可以用來(lái)治療肝、心、脾、肺、腎、骨髓系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等［16］。木犀草素有抑菌抗病毒、降血糖血脂的功效，在免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)痛抗炎、抗腫瘤方面有良好的效果［17］。漢黃芩素是一種來(lái)源于純天然中草藥的黃酮類(lèi)化合物，近年來(lái)，漢黃芩素在抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)方面的作用得到了關(guān)注，CUSICK等［18］用小鼠腦脊髓炎病毒（Theiler's murine encephalomyelitis virus，TMEV）建立C57BL/6小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的模型，在小鼠感染病毒24 h后分別用漢黃芩素和抗中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染藥米諾環(huán)素進(jìn)行腹腔注射，發(fā)現(xiàn)二者均能夠明顯減少小鼠大腦中巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)。由此推測(cè)荊芥防風(fēng)通過(guò)這些有效活性成分發(fā)揮抗炎、抗病毒等作用。對(duì)荊芥防風(fēng)的作用靶點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治龊?，篩選出來(lái)35個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)參與了機(jī)體眾多生物學(xué)過(guò)程，聚類(lèi)后大致分為細(xì)胞代謝過(guò)程、血管生成和收縮、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)和氨基酸磷酸化的調(diào)控等。富集出來(lái)的通路有80條，包括癌癥信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路、P53信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路等，并且這些通路是多個(gè)靶點(diǎn)共同調(diào)控的，如PTEN、CDK2、AKT1、CCND1、CDKN1A、VEGFA、NOS3、MYC、IL2等16個(gè)靶點(diǎn)富集在PI3K/AKT信號(hào)通路上。推測(cè)荊芥防風(fēng)可能通過(guò)這些關(guān)鍵靶點(diǎn)參與到炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程和調(diào)控相關(guān)通路，發(fā)揮治療作用。

綜上所述，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討了荊芥-防風(fēng)藥對(duì)的有效活性成分、關(guān)鍵的作用靶點(diǎn)和參與的生物學(xué)過(guò)程以及信號(hào)通路，與現(xiàn)代藥理研究相符，本研究是通過(guò)現(xiàn)有的文本挖掘和大數(shù)據(jù)來(lái)進(jìn)行預(yù)測(cè)，研究可能存在一些局限性，如數(shù)據(jù)庫(kù)不夠完整、評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)不一的問(wèn)題，因此，后期有必要通過(guò)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)加以完善。