鹽酸青藤堿對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠NLRP3炎性小體的影響及分子機(jī)制的研究?

姚璐莎，羅常春，張 超

湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007

鹽酸青藤堿（sinomenine，SN）是從中藥青風(fēng)藤中提取的生物堿單體［1］，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、免疫抑制等藥理作用，治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）有確切療效和較好的安全性，逐漸成為治療風(fēng)濕病的一線藥物［2］。已有研究表明，體外一定濃度的SN可通過(guò)抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）的活性，從而降低大鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及白細(xì)胞介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）mRNA的表達(dá)［3］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，SN對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant arthritis，AA）大鼠關(guān)節(jié)肥大細(xì)胞的表達(dá)及其脫顆粒率、血清白細(xì)胞介素6（Interleukin-6，IL-6）水平具有明顯的抑制作用［4］。此外，其他動(dòng)物模型和臨床研究［5-7］報(bào)道，SN可明顯抑制巨噬細(xì)胞炎性因子的分泌、T細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡并下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域受體（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎性小體是一種細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的多蛋白聚合物，主要由NLRP3、半胱氨酸蛋白水解酶1（Caspase-1）、凋亡相關(guān)點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）組成，是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分［8］。NLRP3炎性小體參與Caspase-1的活化，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子IL-1β、白細(xì)胞介素18（interleukin-18，IL-18）、白細(xì)胞介素33（interleukin-33，IL-33）等促炎細(xì)胞因子的分泌，還可調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)［9］。因此，本研究擬探討SN對(duì)AA大鼠NLRP3炎性小體的影響及其分子機(jī)制，以期進(jìn)一步闡明SN對(duì)RA的治療作用及相關(guān)機(jī)制，進(jìn)而為RA的治療提供新的思路與靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用7～11周齡SPF級(jí)雄性Wistar大鼠50只，體質(zhì)量在130～160 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK2010-0016，由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)條件：屏障環(huán)境中。

1.2 試劑及藥品SN粉末（湖南正清制藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)：B21440-20）；雷公藤多苷片（黃石飛云制藥有限公司，批號(hào)：Z44023753，10 mg/片）；完全弗氏佐劑（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：F5881）；卡介苗（BCG）（北京生物制品研究所，批號(hào)：S10820017，500 mg/支）。IL-18、IL-1β和TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：EH0302）；8-OHdG和MDA檢測(cè)試劑盒（上?？道噬锛夹g(shù)有限公司，批號(hào)：S0131）；實(shí)驗(yàn)所用抗體［英國(guó)Abcam及美國(guó)Cell Signaling Technology（CST）公司，批號(hào)：S78465］。

1.3 造模及分組對(duì)40只Wistar大鼠進(jìn)行造模。采用75%酒精消毒大鼠尾部，于尾部中內(nèi)1/3交界處分6、7點(diǎn)皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑（將BCG與CFA臨用前充分搖勻，取適量BCG與CFA經(jīng)雙注射器反復(fù)推吸乳化，配置成20 mg的BCG/mL的乳劑）；另設(shè)10只為正常對(duì)照組，于相應(yīng)部位注射0.2 mL生理鹽水。造模14天后，有40只大鼠出現(xiàn)二次反應(yīng)，關(guān)節(jié)炎指數(shù)大于4為造模成功，成功率80%。共獲得40只成功造模大鼠，將其隨機(jī)分為模型組，陽(yáng)性對(duì)照組，青藤堿高、低劑量組，每組10只。

1.4 給藥方法正常對(duì)照組和模型組每天給予生理鹽水每天1 mL/100 g灌胃。陽(yáng)性對(duì)照組以雷公藤多苷片碾碎后灌胃：給藥劑量為每天4 mg/kg，給藥濃度1 mg/mL。青藤堿高、低劑量組予以SN粉末和無(wú)菌注射用水混合灌胃：給藥劑量為每天20、10 mg/kg，給藥濃度1 mg/mL。給藥時(shí)間均為上午10點(diǎn)，給藥4周。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 HE染色觀察大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理改變 大鼠腹主動(dòng)脈取血后，迅速用剪刀剪下大鼠右踝關(guān)節(jié)，置于10%甲醛固定液中固定24 h，一部分石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度酒精脫水后采用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察踝關(guān)節(jié)的滑膜增生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以及軟骨骨質(zhì)破壞及關(guān)節(jié)周圍組織水腫等病理學(xué)變化，并根據(jù)文獻(xiàn)［10］進(jìn)行半定量評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分：無(wú)紅腫；1分：個(gè)別足趾輕度紅腫；2分：大部分足趾關(guān)節(jié)及足跖紅腫；3分：踝關(guān)節(jié)以下足掌嚴(yán)重紅腫；4分：包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪紅腫。

1.5.2 大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù) 造模后第14天起，每周觀察大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)（arthritic index，AI）值。AI值根據(jù)關(guān)節(jié)紅腫程度參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行評(píng)定［10-11］。AI=四肢關(guān)節(jié)評(píng)分之和。

1.5.3 ELISA檢測(cè)血清炎性因子水平 末次給藥后，大鼠禁食12 h后處死。用10%水合氯醛10 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，剖腹，分離腹主動(dòng)脈取血2 mL，靜置30 min，血標(biāo)本以離心半徑8 cm，2000 r/min離心10 min，吸取上清，分別采用ELISA和比色法檢測(cè)大鼠血清中IL-18、IL-1β、TNF-α、8-OHdG和MDA的表達(dá)水平，檢測(cè)步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5.4 Western blot檢測(cè)滑膜組織中NF-κB/NLRP3信號(hào)通路蛋白表達(dá) 處死大鼠后，將其仰位固定，酒精消毒，沿膝關(guān)節(jié)正中縱行切開(kāi)皮膚直至暴露出以膝關(guān)節(jié)為中心約3 cm×3 cm的區(qū)域，以齒鑷提起髕骨。沿髕骨上沿約0.3 cm×0.4 cm處向下切割直至股骨，再分別沿髕骨兩側(cè)向下分離至脛骨，打開(kāi)膝關(guān)節(jié)腔，可見(jiàn)由髕骨下極向上延續(xù)有一層平滑光亮呈淡黃色的滑膜組織，完整剝離滑膜組織。采用蛋白印跡法，分別進(jìn)行蛋白樣本提取制備，SDS-PAGE的制備，灌膠及上樣，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入封閉液和一抗NF-κB、NLRP3及二抗（1∶5000）進(jìn)行免疫反應(yīng)，最后按0.1 mL/cm2的顯影液計(jì)算用量，將顯影液加在PVDF膜上，暗室曝光，進(jìn)行顯影和圖像分析，以目的蛋白與作為內(nèi)參的β-actin的密度比值作為蛋白的相對(duì)含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理表現(xiàn)正常對(duì)照組大鼠關(guān)節(jié)組織有少量散在淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組大鼠關(guān)節(jié)組織與正常對(duì)照組大鼠比較，表現(xiàn)出關(guān)節(jié)炎的典型特點(diǎn)，有不同程度的充血、水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分出現(xiàn)滑膜細(xì)胞、滑膜纖維組織增生。陽(yáng)性對(duì)照組與青藤堿各劑量組，滑膜炎癥明顯減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，血管翳形成減輕。病理評(píng)分結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組大鼠比較，其余各組大鼠關(guān)節(jié)組織的病理改變積分顯著增高（P＜0.05），而陽(yáng)性對(duì)照組、青藤堿各劑量組大鼠病理表現(xiàn)評(píng)分均較模型組明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理表現(xiàn)（HE×400）

2.2 關(guān)節(jié)炎指數(shù)造模后第21、28、35、42天，模型組大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)較正常對(duì)照組顯著增加（P＜0.05）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組及青藤堿各劑量組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著降低（P＜0.05）；其中青藤堿高劑量組關(guān)節(jié)炎指數(shù)低于低劑量組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)變化（±s）

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)變化（±s）

注：#表示與正常對(duì)照組比較，P＜0.05；*表示與模型組比較，P＜0.05；△表示與青藤堿低劑量組比較，P＜0.05；-表示無(wú)數(shù)值

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2.3 血清炎性因子水平模型組大鼠血清中IL-18、IL-1β、TNF-α、8-OHdG和MDA水平較正常對(duì)照組明顯升高（P＜0.05），表明造模成功。與模型組比較，青藤堿各劑量組血清中IL-18、IL-1β、TNF-α、8-OHdG和MDA水平顯著降低（P＜0.05）。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，青藤堿各劑量組血清炎性因子水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與青藤堿低劑量組相比，高劑量組血清中IL-18、IL-1β、TNF-α、8-OHdG和MDA水平顯著降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠血清細(xì)胞因子的表達(dá)變化

2.4 滑膜組織中NF-κB/NLRP3信號(hào)通路蛋白表達(dá)與正常對(duì)照組比較，其余各組大鼠滑膜組織中NF-κB/NLRP3通路相關(guān)蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05）。與模型組比較，青藤堿各劑量組NL‐RP3、ASC、IL-1β的表達(dá)、caspase-1/caspase-1的比率及IκB、NF-κB的磷酸化顯著下調(diào)（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠滑膜組織中NF-κB/NLRP3信號(hào)通路蛋白表達(dá)

3 討論

RA是一種全身性炎癥性疾病，主要表現(xiàn)為身體多關(guān)節(jié)慢性多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、滑膜增生，最終導(dǎo)致功能喪失［12］。RA的病理進(jìn)展與細(xì)胞因子介導(dǎo)的多關(guān)節(jié)炎癥密切相關(guān)，導(dǎo)致骨糜爛，甚至關(guān)節(jié)破壞［13］。然而，臨床可用藥物主要集中在控制疼痛或炎癥方面。目前，在治療自身免疫性疾病的臨床和實(shí)驗(yàn)研究方面取得很大的進(jìn)展。

CFA誘導(dǎo)的大鼠AA是一種實(shí)驗(yàn)常用的多關(guān)節(jié)炎性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，大鼠AA表現(xiàn)為滑膜增生、慢性炎癥、軟骨和骨關(guān)節(jié)的進(jìn)行性破壞［14-16］。此外，關(guān)節(jié)損傷主要是單核細(xì)胞浸潤(rùn)所致，降解酶的合成與炎癥的產(chǎn)生AA表現(xiàn)為滑膜增生、慢性炎癥和軟骨、骨關(guān)節(jié)的進(jìn)行性破壞［17］。此外，關(guān)節(jié)損傷主要是單核細(xì)胞浸潤(rùn)所致。降解酶的合成及TNFα、白細(xì)胞介素等炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生IL-1β和IL-6［18］。TNF-α在關(guān)節(jié)損傷中起著至關(guān)重要的作用。RA患者滑膜增生的調(diào)解與生產(chǎn)關(guān)節(jié)炎侵蝕發(fā)

病因機(jī)制中的趨化因子。IL-1β是一種促炎性細(xì)胞子，可引起全身炎癥癥狀，過(guò)量的IL-6可促進(jìn)骨吸收［19］。IL-1β和IL-6在體外可誘導(dǎo)產(chǎn)生TNF-α。本研究采用CFA誘導(dǎo)的大鼠AA模型，分別檢測(cè)了大鼠血清中IL-18、IL-1β和TNF-α水平以及8-OHdG和MDA含量［20］。結(jié)果表明，不同劑量的鹽酸青藤堿可顯著降低血清中IL-18、IL-1β、TNF-α、8-OHdG和MDA的水平，表明鹽酸青藤堿對(duì)AA具有較好的治療作用。青藤堿組與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明鹽酸青藤堿對(duì)AA的治療作用與雷公藤多苷相當(dāng)。上述結(jié)果表明，鹽酸青藤堿可顯著抑制AA大鼠細(xì)胞因子以及氧化應(yīng)激產(chǎn)物的合成和釋放。

巨噬細(xì)胞表達(dá)黏附分子、趨化因子受體（chemokine receptor，CR）和其他表面抗原，分泌趨化因子、細(xì)胞因子如IL-6、IL-1β、TNF-α及生長(zhǎng)因子、蛋白酶和其他介質(zhì)，這些炎癥介質(zhì)是關(guān)節(jié)炎中炎癥和血管新生發(fā)生的重要病理機(jī)制。根據(jù)上述機(jī)制［21］，目前已開(kāi)發(fā)出各種細(xì)胞因子類生物制劑如IL-1和TNF-α拮抗劑等，對(duì)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有一定療效，可有效改善RA患者臨床指標(biāo)和生活質(zhì)量［22］。然而，大規(guī)模臨床試驗(yàn)顯示，現(xiàn)有的藥物只能緩解RA，并不能達(dá)到治愈的目的，且仍有許多RA患者對(duì)IL-1和TNF-α拮抗劑不敏感，療效不佳。

炎癥是清除體內(nèi)危險(xiǎn)刺激的一種防御反應(yīng)，炎性小體通過(guò)促炎細(xì)胞因子的裂解并使其成熟來(lái)調(diào)節(jié)炎癥［23］。核苷酸結(jié)合NLRP3炎性小體是一種細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的多蛋白聚合物，主要由NLRP3、ASC、Caspase-1組成，是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分［24］。NLRP3炎性小體參與Caspase-1的活化，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-18、IL-33等促炎細(xì)胞因子的分泌，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)。研究顯示［25］，激活NLRP3炎性小體需要兩個(gè)步驟：?jiǎn)?dòng)信號(hào)，通過(guò)NF-кB途徑使NLRP3炎性小體和IL-1β前體轉(zhuǎn)錄。激活信號(hào)，微生物或者危險(xiǎn)相關(guān)分子模式直接激活炎性小體［26］。

既往研究［27］認(rèn)為，NLRP3炎性小體的過(guò)度激活在代謝性、心血管及肝臟疾病發(fā)病過(guò)程中起重要作用。而近年來(lái)的諸多研究表明，NLRP3炎性小體參與了RA的發(fā)病進(jìn)程。NLRP3炎性蛋白的遺傳變異被證實(shí)與RA的易感性與嚴(yán)重程度密切相關(guān)，抗TNF藥物對(duì)RA的療效受NLRP3炎性小體遺傳變異的影響。值得一提的是，WANG等［28］在近來(lái)發(fā)現(xiàn)中國(guó)傳統(tǒng)中藥材仙茅苷A可抑制AA大鼠NFκB/NLRP3通路激活，降低血清中炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α、前列腺素E2和丙二醛表達(dá)?，F(xiàn)代藥理學(xué)亦證實(shí)，中藥有較強(qiáng)的消炎止痛作用，同時(shí)有免疫調(diào)節(jié)作用，可降低炎癥因子IL-1β、TNF-α改善炎癥狀況［29-30］；但尚不清楚NF-κB/NLRP3炎性小體通路是否參與了SN對(duì)RA的治療作用。