白藜蘆醇對人胎盤滋養(yǎng)細胞氧化應(yīng)激損傷的影響及機制研究?

李美和，黨慧敏，吳曉玲，劉艷巧，劉潤俠，安鵬

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院（西北醫(yī)院）

氧化應(yīng)激（oxidative stress）反映了細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平與抗氧化防御系統(tǒng)之間的失衡。這種不平衡狀態(tài)在妊娠期各種生殖疾病的發(fā)病機制中起著至關(guān)重要的作用。因此，抑制氧化應(yīng)激引起的氧化損傷和凋亡是妊娠疾病的重要干預(yù)策略［1］。胎盤的氧化損傷導(dǎo)致炎癥和細胞凋亡，由此產(chǎn)生的細胞碎片被釋放到母體循環(huán)系統(tǒng)中［2］。這些胎盤源性因子作用于母體內(nèi)皮，導(dǎo)致出現(xiàn)全身內(nèi)皮功能障礙［3］。人滋養(yǎng)細胞如果受到任何原因引起的氧化損傷，都會使其增殖和侵襲能力下降，胎盤形成和發(fā)育異常，最終發(fā)生病理妊娠［4］。因此，減少胎盤氧化應(yīng)激是保障母嬰健康的可行策略。

白藜蘆醇（Resveratrol，RES）是一種天然的非類黃酮多酚，主要來自葡萄、漿果、花生和其他植物［5］，具有抗炎、抗腫瘤和抗氧化作用，也可改善代謝性疾?。?］，RES能有效清除超氧化物，在各種病理生理和生物過程中幫助調(diào)節(jié)細胞凋亡，并可用于治療慢性疾?。?］，糾正自由基誘導(dǎo)的反應(yīng)，如DNA損傷［8］、線粒體氧化還原狀態(tài)失衡［9］、細胞色素P450失活［10］和干擾細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［11］。

本研究選取人胎盤滋養(yǎng)細胞HTR-8/SVneo細胞系作為研究對象，在前期實驗成功建立滋養(yǎng)細胞氧化應(yīng)激體外模型的基礎(chǔ)上［12］，以抗氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)劑——RES作為研究對象，明確其在人胎盤滋養(yǎng)細胞氧化損傷中的作用并探尋其可能的藥理作用機制。

1 材料及方法

1.1 實驗材料人胎盤滋養(yǎng)細胞HTR-8/SVneo細胞系（加拿大安大略省皇后大學(xué)Charles Graham博士提供）；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素混合液及0.25%胰酶（美國GIBCO公司，批號：8119295，8090485，1989511，1930154）；白藜蘆醇及過氧化氫（hydrogen peroxide H2O2，美國Sigma-Aldrich公司，批號：554325，3587191）；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司，批號：20200117）；Cell Counting Kit-8（CCK-8）細胞增殖-毒性檢測試劑盒（日本株式會社上海同仁化學(xué)研究所，批號：NG703）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測試盒（碧云天生物技術(shù)研究所，批號：SO101-1）；超氧化物陰離子熒光探針（Dihydroethidium DHE，英國Abcam公司，批號：145360）；PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I細胞凋亡檢測試劑盒（美國BD公司，批號：7305819）；100 mm培養(yǎng)皿、35 mm培養(yǎng)皿、細胞培養(yǎng)多孔板（美國Corning Costar公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與處理 將HTR-8/SVneo細胞培養(yǎng)在DMEM/F12培養(yǎng)基中，加入10%滅活的胎牛血清和1%青鏈霉素混合液，于37°C，5%CO2培養(yǎng)至細胞對數(shù)生長期。

1.2.2 造模及分組 應(yīng)用前期研究已成功建立的滋養(yǎng)細胞氧化應(yīng)激模型［12］，取對數(shù)生長期的HTR-8/SVneo細胞以每孔1×105細胞種植于6孔培養(yǎng)板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h細胞貼壁后，給予300 μmoL/L濃度的H2O2處理3 h，構(gòu)建成功滋養(yǎng)細胞氧化應(yīng)激模型以用于后續(xù)的實驗研究。空白對照組不造模。造模成功表現(xiàn)：造模組細胞存活率相比空白對照組明顯下降，證實模型細胞既達到了細胞損傷狀態(tài)，又存有一定的細胞活力，符合細胞實驗研究條件要求。將造模成功的細胞，分為模型組，RES 10、50、100、200 μmol/L組，每組設(shè)3個復(fù)孔。所有實驗至少重復(fù)3次。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 細胞形態(tài) 各實驗組對應(yīng)處理后，繼續(xù)培養(yǎng)8 h后，棄培養(yǎng)上清，PBS洗2遍后，放于相差倒置顯微鏡下，于相同的物鏡倍數(shù)（10×）觀察各組的細胞形態(tài)學(xué)改變并拍照。

1.3.2 CCK-8法檢測細胞存活率 各實驗組對應(yīng)處理后，繼續(xù)培養(yǎng)8 h后，棄培養(yǎng)上清，加入提前配制好的CCK-8工作液110 μL（CCK-8溶液與培養(yǎng)基體積比為1∶10），置于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2 h，在自動酶標(biāo)儀上檢測450 nm波長處各孔吸光度（OD）值。按下述公式計算各組的細胞存活率。

細胞存活率（%）=（實驗組OD-空白孔OD）／對照組OD-空白孔OD）×100%

1.3.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 各實驗組對應(yīng)處理后，繼續(xù)培養(yǎng)8 h后，棄培養(yǎng)上清，用0.25%胰酶消化，收集細胞，離心半徑1.12 cm，800 r/min離心5 min，用100 μL 1×結(jié)合緩沖液重懸，分別加入5 μL Annexin-V PE和5 μL 7-AAD，混勻，室溫避光孵育15 min，加入400 μL 1×結(jié)合緩沖液，樣品置于冰上，1 h內(nèi)用采用流式細胞儀［（FACScan?；Becton Dickinson Bioscience，加利福尼亞州圣何塞），配備的Cell Quest?軟件（Becton Dickinson生物科學(xué)）］檢測各組細胞凋亡情況。

1.3.4 檢測細胞培養(yǎng)細胞勻漿中SOD含量 各實驗組對應(yīng)處理后，繼續(xù)培養(yǎng)8 h后，棄培養(yǎng)上清，按SOD試劑盒說明檢測細胞勻漿中SOD含量。

1.3.5 DHE熒光探針檢測細胞內(nèi)ROS水平 各實驗組對應(yīng)處理后，繼續(xù)培養(yǎng)8 h后，棄培養(yǎng)上清，冰冷的PBS洗2遍，用1 mL DHE（5 μmol/L）重懸，37℃避光孵育30 min，離心半徑1.12 cm，800 r/min離心3 min，冰冷的PBS洗2遍，用200 μL PBS重懸，用流式細胞儀進行檢測，結(jié)果用平均熒光強度（mean fluorescence intensity，MFI）表示，MFI數(shù)值高低與細胞內(nèi)ROS水平呈正比。

1.3.6 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測細胞中caspase-3及Bcl-2水平 各實驗組對應(yīng)處理后，繼續(xù)培養(yǎng)8 h后，吸取培養(yǎng)上清，采用雙抗體夾心ABC-ELISA法。用 抗 人（cysteinyl aspartate specific proteinase 3，caspase-3）及（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的caspase-3及Bcl-2與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗人caspase-3及Bcl-2，形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過氧化物酶標(biāo)記的Streptavidin與生物素結(jié)合，加入底物工作液顯藍色，最后加終止液硫酸，在450 nm處測OD值，caspase-3及Bcl-2濃度與OD值成正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中caspase-3及Bcl-2濃度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用GraphPad Prism 8軟件（GraphPad軟件公司）進行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)空白對照組細胞呈細長紡錘形，邊界清晰，胞漿飽滿，細胞核呈圓形或橢圓形，細胞貼壁較多。模型組細胞形態(tài)發(fā)生改變，細胞皺縮、間隙增寬，有些呈片狀壞死脫落，但仍存活相對較多細胞。RES 10 μmol/L組，在8 h的時間節(jié)點觀察細胞形態(tài)較模型組均無明顯改變；RES 50 μmol/L組細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)趨于正常、細胞輪廓清晰，細胞呈長梭形，貼壁較牢，胞漿飽滿；RES 100、200 μmol/L組細胞形態(tài)完整性欠佳，細胞均勻度、核仁清晰度下降，細胞數(shù)逐漸減少，呈片狀壞死脫落，存活細胞較少。見圖1。?

圖1 電鏡下各組細胞形態(tài)（×10）

2.2 細胞存活率與空白對照組比較，模型組細胞的存活率降低（P＞0.05）。與模型組比較，RES 10 μmol/L組的細胞的存活率降低不顯著（P＞0.05）；RES 50、100 μmol/L組細胞存活率顯著提高（P＜0.01），且RES 50 μmol/L組的細胞存活率高于RES 100 μmol/L組（P＞0.05）；RES 200 μmol/L組的細胞存活率較模型組明顯下降（P＜0.05）。見表1。

2.3 細胞凋亡率與空白對照組比較，模型組細胞的凋亡率明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，RES 10、50 μmol/L組隨劑量增加細胞凋亡率逐漸降低趨勢，且RES 50 μmol/L組的凋亡率明顯低于模型組（P＜0.01）；RES 100、200 μmol/L組的細胞凋亡率均明顯升高（P＜0.01），表明該RES濃度作用下引起了較為明顯的滋養(yǎng)細胞壞死和凋亡。見表1，圖2。

圖2 各組細胞凋亡率

表1 各組細胞存活率及細胞凋亡率比較（±s）

表1 各組細胞存活率及細胞凋亡率比較（±s）

注：*表示與空白對照組比較，P＜0.05；&表示與模型組比較，P＜0.05；F、P為模型組與RES 50 μmol/L組比較統(tǒng)計值

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2.4 細胞SOD水平與空白對照組比較，模型組SOD水平明顯下降（P＜0.01）。與模型組比較，RES 10、50、100 μmol/L組SOD活性升高明顯（P＜0.01）；RES 200 μmol/L組SOD的活性與模型組相當(dāng)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組細胞勻漿中SOD、ROS水平比較（±s）

表2 各組細胞勻漿中SOD、ROS水平比較（±s）

注：*表示與空白對照組比較，P＜0.05；&表示與模型組比較，P＜0.05；F、P為模型組與RES50 μmol/L組比較統(tǒng)計值

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2.5 細胞ROS水平與空白對照組比較，模型組細胞MFI值明顯增高（P＜0.01）。與模型組比較，RES 10、50、100 μmol/L組MFI值均下降（P＜0.05），且RES 50 μmol/L組的MFI值較RES 100 μmol/L組降低更顯著（P＜0.01），RES 200 μmol/L組MFI值明顯升高（P＜0.01）。見表2，圖3。

圖3 各組細胞ROS水平圖

2.6 細胞caspase-3、Bcl-2水平與空白對照組顯比較，模型組細胞中caspase-3、Bcl-2水平均明升高（P＜0.001）。與模型組比較，RES 50 μmol/L組caspase-3、Bcl-2水平明顯低于模型組（P＜0.05）。見表3。

表3 各組細胞內(nèi)caspase-3及Bcl-2水平比較（±s） pg/mL

表3 各組細胞內(nèi)caspase-3及Bcl-2水平比較（±s） pg/mL

注：*表示與空白對照組比較，P＜0.05；&表示與模型組比較，P＜0.05；F、P為模型組與RES 50 μmol/L組比較統(tǒng)計值

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3 討論

滋養(yǎng)細胞的正常增殖和生物學(xué)功能是成功妊娠的先決條件，胎盤血管在胎兒-母體界面上的營養(yǎng)、氣體和廢物交換起著至關(guān)重要的作用，其發(fā)展依賴于血管生成信號和相關(guān)生長因子的正確表達和相互作用。氧化應(yīng)激在各種妊娠生殖疾病的發(fā)病機制中起著重要作用，胎盤血管發(fā)育受損可能與子癇前期的發(fā)病機制有關(guān)，氧化應(yīng)激增加可能是子癇前期發(fā)病的原因之一［13］。

研究表明，妊娠疾病與滋養(yǎng)細胞功能損害或缺陷有關(guān)，凋亡和自噬的異常變化是促進滋養(yǎng)細胞功能損害或缺陷，導(dǎo)致胎盤形成缺陷或子癇前期的重要因素［14］。胎盤灌注不足、缺血缺氧可導(dǎo)致機體產(chǎn)生大量ROS［15］，進而誘導(dǎo)大量滋養(yǎng)層細胞死亡，最終導(dǎo)致妊娠疾病等病理損傷。因此，深入研究滋養(yǎng)細胞氧化應(yīng)激，有助于闡明流產(chǎn)、先兆子癇、胎兒生長受限等一類原發(fā)性滋養(yǎng)細胞疾病的發(fā)病機制，為這些疾病的治療提供新的治療靶點。

天然來源的化合物由于其固有的抗氧化活性，長期以來被認為可以減輕氧化應(yīng)激。例如姜黃根中的姜黃素、葡萄中富含的白藜蘆醇等，這些化合物在治療心血管疾病和肥胖等疾病時都可以通過減少氧化應(yīng)激從而對細胞產(chǎn)生保護作用［16］。這些天然化合物在許多疾病中都可以減少氧化應(yīng)激的細胞保護作用。然而，白藜蘆醇作為一種公認的抗氧化劑，對胎盤滋養(yǎng)細胞氧化應(yīng)激損傷的影響尚未被闡明。我們利用HTR-8/SVneo細胞與H2O2共同孵育，通過誘導(dǎo)建立氧化應(yīng)激損傷模型，護觀察RES對該細胞氧化應(yīng)激和凋亡是否存在保作用。

細胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)可以抵抗氧化應(yīng)激，包括不同的自由基清除抗氧化酶和非酶抗氧化劑。SOD是最重要的抗氧化酶，SOD將超氧化物轉(zhuǎn)化為H2O2。SOD等抗氧化酶可降低細胞內(nèi)ROS水平［17］。當(dāng)ROS及SOD水平失去平衡時，ROS可產(chǎn)生一系列自由基，改變細胞的抗氧化防御能力，導(dǎo)致細胞膜、細胞蛋白、DNA的氧化損傷，最終導(dǎo)致細胞凋亡，隨后不同的器官系統(tǒng)表現(xiàn)出組織損傷［18］。近年的研究［19-20］結(jié)果顯示，缺乏充分調(diào)控的ROS被認為是導(dǎo)致胎盤病理、妊娠紊亂和早產(chǎn)的主要原因。以往研究［21］表明，白藜蘆醇具有抗炎、抗氧化作用，能夠抑制ROS的產(chǎn)生，其抗氧化和細胞保護作用于多種疾病，如癌癥、心血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病［22-23］。本實驗研究結(jié)果表明，RES預(yù)處理后能降低細胞ROS的生成，提高抗氧化酶活性，減少氧化應(yīng)激的發(fā)生，進而減少與此相關(guān)的組織破壞［24］。

細胞凋亡是多細胞生物生長和健康的正常過程，是在細胞受到充分損傷后發(fā)生的［25］。此外，細胞凋亡還參與了多種病理過程［3］。因此，抑制細胞凋亡是一種潛在的治療疾病的策略。Bax和Bcl2是細胞凋亡的調(diào)節(jié)因子。Bax是凋亡誘導(dǎo)劑，而Bcl2則是激活存活信號。有研究［4］發(fā)現(xiàn)，活性氧所致的氧化應(yīng)激是造成細胞凋亡的重要環(huán)節(jié)。當(dāng)細胞處于氧化與抗氧化失衡狀態(tài)時，ROS大量生成，ROS可激活Bax等促凋亡蛋白激活，造成線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，也可以直接攻擊線粒體膜，通過脂質(zhì)過氧化反應(yīng)造成損傷，激活下游Caspase途徑，導(dǎo)致細胞凋亡［8］。已有研究［26］表明，白藜蘆醇有助于調(diào)節(jié)多種疾病的病理、生理和生物學(xué)過程的凋亡，其作為一種抗氧化劑，對細胞凋亡的抑制作用也已有多項研究報道［27-28］。本實驗結(jié)果表明，H2O2對滋養(yǎng)細胞有明顯的氧化應(yīng)激損傷作用，而將RES作用于H2O2誘導(dǎo)的發(fā)生氧化損傷的滋養(yǎng)細胞后，可顯著降低細胞中Caspase-1和Bcl-2的活性，減少細胞凋亡率，抑制細胞凋亡，增加滋養(yǎng)細胞的存活率。

此外，本實驗研究發(fā)現(xiàn)，RES 200 μmol/L處理組對HTR-8/SVneo氧化應(yīng)激細胞沒有保護作用，反而有促進細胞凋亡和損傷的作用，其作用機制可能與高劑量的RES產(chǎn)生的細胞毒性作用有關(guān)。有研究顯示［29］，抑癌基因p53在RES作用下被激活，并參與結(jié)腸癌細胞凋亡過程。另外RES誘導(dǎo)DNA損傷如雙鏈斷裂。本研究觀察到的結(jié)果與此前的報道相一致。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，50 μmol/L RES作用8 h可以通過抗氧化和抗凋亡作用，減輕HTR-8/SVneo細胞的氧化應(yīng)激和凋亡，從而保護細胞免受H2O2的損傷，具有預(yù)防和治療H2O2誘導(dǎo)的HTR-8/Svneo細胞氧化應(yīng)激損傷的應(yīng)用前景。但其對于下游途徑的作用機制尚不明確，有待于進一步研究。