HPLC 和HPLC-MS 法檢測(cè)配制酒中甜蜜素含量測(cè)量不確定度的比較研究

毛瓊麗，李先芝，2，嚴(yán) 玲，石 豪，劉 洋，胡 楊，朱 艷，楊 峰，陳彥和

（1.勁牌有限公司，湖北大冶 435112；2.中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北大冶 435112）

甜蜜素又名環(huán)己基氨基磺酸鈉，是一種人工合成甜味劑，由于其甜度高而常被用作食品生產(chǎn)中的添加劑，但有研究表明過(guò)量甜蜜素會(huì)對(duì)臟器產(chǎn)生一定危害，造成某些生理指標(biāo)的改變。我國(guó)頒布的GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中對(duì)甜蜜素在酒類(lèi)產(chǎn)品中的使用僅限定于配制酒，維護(hù)了消費(fèi)者的健康權(quán)益。近年來(lái)國(guó)家各級(jí)監(jiān)管部門(mén)對(duì)酒類(lèi)產(chǎn)品的食品安全監(jiān)管力度加強(qiáng)，為酒企對(duì)酒類(lèi)產(chǎn)品質(zhì)量提升和行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供了契機(jī)，甜蜜素的檢測(cè)方法也有所改進(jìn)，其中由于氣相法在檢測(cè)白酒中甜蜜素時(shí)易產(chǎn)生假陽(yáng)性現(xiàn)象，改進(jìn)后國(guó)標(biāo)GB 5009.97—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測(cè)定》中方法的適用范圍標(biāo)明：液相色譜法適用于配制酒，液相色譜-質(zhì)譜法適用于白酒中甜蜜素的測(cè)定。而隨著新的《白酒工業(yè)術(shù)語(yǔ)》和《飲料酒術(shù)語(yǔ)和分類(lèi)》標(biāo)準(zhǔn)即將頒布實(shí)施，市場(chǎng)中的部分“白酒”產(chǎn)品將劃歸入“配制酒”。為研究及評(píng)價(jià)液相、液相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)配制酒中甜蜜素含量的可接受性，本文根據(jù)CNAS-GL06：2019《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》相關(guān)要求及方法，分別對(duì)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測(cè)定》中液相色譜法與液相色譜-質(zhì)譜法的測(cè)量不確定度進(jìn)行量化評(píng)估，通過(guò)對(duì)比，綜合分析兩種方法對(duì)測(cè)量結(jié)果影響較大的因素，為正確評(píng)價(jià)和使用配制酒類(lèi)產(chǎn)品中甜蜜素的檢測(cè)方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

試劑及耗材：甲醇(CHOH)，色譜純；乙酸銨(CHCOONH)，色譜純；次氯酸鈉(NaClO)，分析純；硫酸（HSO），分析純。甜蜜素，含量99.3 %，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；配制酒，市購(gòu)。

儀器設(shè)備：液質(zhì)聯(lián)用儀，三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（ACQUITY TQD），沃特世（Waters）公司；色譜柱，Xselect HSS T3（2.1×100 mm，3.5 μm）；AB135-S電子天平（十萬(wàn)分之一），梅特勒-托利多儀器公司。

液相色譜儀：高效液相色譜儀（Agilent 1260），安捷倫科技有限公司；色譜柱：Sepax Hp-C柱（4.6×250 mm，5 μm）。

1.2 測(cè)定方法

分別按照GB 5009.97—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測(cè)定》中第二法：高效液相色譜法，第三法：液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法開(kāi)展樣品測(cè)定。每種方法測(cè)定流程如下：①樣品前處理（平行操作六份）；②制備系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；③測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線（直線）方程；④測(cè)定試液，檢測(cè)樣品試液的峰面積；⑤計(jì)算測(cè)得濃度。

2 測(cè)量模型

根據(jù)測(cè)定方法建立樣品中甜蜜素檢測(cè)的數(shù)學(xué)模型：

式中：X 為試樣中甜蜜素的含量，mg/kg；C 為樣品濃度，μg/mL；V為試樣定容體積，mL；m為試樣稱(chēng)樣量，g。

3 不確定度的來(lái)源識(shí)別

根據(jù)方法的測(cè)定過(guò)程以及測(cè)量模型，分析影響液相法與液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定食品中甜蜜素的不確定度來(lái)源主要有：①樣品稱(chēng)量時(shí)引入的不確定度；②樣品稀釋過(guò)程中引入的不確定度；③標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱(chēng)量時(shí)引入的不確定度；④標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋時(shí)引入的不確定度；⑤標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)不確定度；⑥方法重復(fù)性測(cè)試引入的不確定度；⑦方法加標(biāo)回收率引入的不確定度。甜蜜素含量測(cè)定不確定度來(lái)源分析因果圖如圖1所示。

圖1 甜蜜素含量測(cè)定不確定度來(lái)源分析

4 不確定度的評(píng)定

4.1 樣品稱(chēng)量時(shí)引入的不確定度

4.1.1 天平允差引入的不確定度

4.1.2 重復(fù)性產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

4.1.3 樣品稱(chēng)量引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算

按照以上計(jì)算方式，對(duì)樣品處理過(guò)程中稱(chēng)量引入的不確定度進(jìn)行計(jì)算u=0.00001，u=0.00003。

4.2 樣品處理過(guò)程中稀釋引入的不確定度

4.2.1 校準(zhǔn)引入的不確定度

表1 樣品處理過(guò)程中玻璃量具引入的不確定度

4.2.2 環(huán)境溫度變化引入的不確定度

4.2.3 重復(fù)性產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

4.2.4 玻璃量具引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

各玻璃量具引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算公式如（7）：

按照以上計(jì)算方式，對(duì)樣品處理過(guò)程中稀釋所用到的玻璃量具引入的不確定度進(jìn)行總結(jié).

結(jié)合樣品處理過(guò)程，液相和液相色譜-質(zhì)譜法由定容體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備引入的不確定度

4.3.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對(duì)不確定度

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)校準(zhǔn)證書(shū)中估計(jì)值引入的不確定度：甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)由中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院提供，純度I 為99.3 %，標(biāo)準(zhǔn)證書(shū)給出的相對(duì)擴(kuò)展不確定度U為0.8%，包含因子k 為2，其引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.3.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱(chēng)量引入的不確定度

稱(chēng)量重復(fù)性產(chǎn)生的不確定度：重復(fù)稱(chēng)量10 次，得到稱(chēng)量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)時(shí)引入的標(biāo)準(zhǔn)偏差為u2=0.00008 g。

液相方法和液相色譜-質(zhì)譜方法所用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱(chēng)量均為0.1 g，所引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度均為：

4.3.3 配制標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液玻璃量具引入的不確定度

液相法標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程中，使用A 級(jí)50 mL容量瓶5 次，A級(jí)100 mL容量瓶1次，容量允差分別為±0.05 mL、±0.10 mL；使用A 級(jí)10 mL 單標(biāo)移液管6次，25 mL單標(biāo)移液管4次，允差分別為±0.020 mL、0.030 mL。按4.2 的方法計(jì)算出液相法標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制時(shí)玻璃量具引入相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

液相色譜-質(zhì)譜法標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程中，使用A 級(jí)10 mL 容量瓶6 次，A 級(jí)100 mL 容量瓶2 次，允差分別為±0.02 mL、±0.10 mL；使用A 級(jí)1 mL 單標(biāo)移液管1次，A級(jí)2 mL單標(biāo)移液管3次，A級(jí)5 mL單標(biāo)移液管3 次，允差分別為±0.007 mL、±0.010 mL、±0.015 mL，按4.2 的方法計(jì)算出玻璃量具引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

經(jīng)計(jì)算，各玻璃量具引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度如表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程中玻璃量具引入的不確定度

結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液的配制過(guò)程，液相和液質(zhì)檢測(cè)方法由玻璃量具引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

綜上，標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度

4.4.1 液相法標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度

對(duì)液相方法的一元線性回歸的標(biāo)準(zhǔn)不確定度開(kāi)展評(píng)定，首先以液相法配制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液濃度及得到的甜蜜素峰面積擬合線性方程，所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=2.4175C-1.2764，R=0.9998，其中斜率a=2.4175，截距b=-1.2764，測(cè)量樣品溶液次數(shù)p=6，標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)量定次數(shù)n=5，被測(cè)供試品溶液濃度平均值為20.9035 mg/L，計(jì)算液相法標(biāo)準(zhǔn)曲線的殘差標(biāo)準(zhǔn)偏差S為：

根據(jù)計(jì)算：S（液相）=2.6053 mg/L；

計(jì)算液相色譜-質(zhì)譜法標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

其相對(duì)不確定度為：

4.4.2 液相色譜-質(zhì)譜法標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度

以液相色譜-質(zhì)譜法所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=7.6647C-83.2332，R=0.9993，其中斜率a=7.6647，截距b=-83.2332，測(cè)量樣品溶液6 次，被測(cè)供試品溶液濃度平均值為164.1183 μg/L，按式17、式18 計(jì)算其殘差標(biāo)準(zhǔn)偏差S（液質(zhì)）=37.8748，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：=2.9924μg/L，則u=0.01823。

4.5 方法重復(fù)性測(cè)定引入的不確定度

液相法樣品重復(fù)測(cè)定引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

液相法樣品重復(fù)測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

以同樣方法開(kāi)展液相色譜-質(zhì)譜法對(duì)配制酒樣品中甜蜜素進(jìn)行重復(fù)測(cè)定，重復(fù)測(cè)定次數(shù)n=6，測(cè)定 值X分 別 為165.2891 μg/L、163.3291 μg/L、165.2393 μg/L、164.9185 μg/L、161.8283 μg/L、164.1055 μg/L，均值xˉ=164.1183 μg/L，計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)偏差s(x 液質(zhì))=1.3517 μg/L，標(biāo)準(zhǔn)不確定度u=0.55181 μg/L，液相色譜-質(zhì)譜法重復(fù)性測(cè)定引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u=0.00336。

4.6 方法加標(biāo)回收率引入的不確定度

4.7 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

分別以兩種方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量計(jì)算相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度u，計(jì)算公式如下：

經(jīng)計(jì)算，兩種方法檢測(cè)甜蜜素的相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：u=0.04178，u=0.02393。

液相法所測(cè)定的配制酒樣品中含甜蜜素41.80 mg/kg，液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定的配制酒樣品中含甜蜜素1.64 mg/kg，兩種方法的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.8 擴(kuò)展不確定度的評(píng)定

在95%的置信水平下，取包含因子k＝2，擴(kuò)展不確定度按式28計(jì)算，得到液相法測(cè)定甜蜜素的擴(kuò)展不確定度為U=3.49 mg/kg，高效液相-質(zhì)譜法測(cè)定甜蜜素的擴(kuò)展不確定度為U=0.08 mg/kg。因此，高效液相色譜法測(cè)定的配制酒中甜蜜素含量測(cè)定結(jié)果表示為（41.80±3.49）mg/kg，高效液相-質(zhì)譜法測(cè)定的配制酒中甜蜜素含量測(cè)定結(jié)果表示為（1.64±0.08）mg/kg。

4.9 不同方法下不確定度評(píng)定對(duì)比

通過(guò)開(kāi)展配制酒類(lèi)中甜蜜素檢測(cè)液相法和高效液相-質(zhì)譜法的不確定度評(píng)定對(duì)比，各分量值見(jiàn)圖2，液相色譜-質(zhì)譜法的相對(duì)不確定度值小于液相色譜法。對(duì)相對(duì)不確定度評(píng)定過(guò)程中各分量值進(jìn)行分析，影響兩種方法測(cè)量結(jié)果不確定度的主要因素是：標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性擬合。液相色譜-質(zhì)譜法中回收率標(biāo)準(zhǔn)不確定度對(duì)結(jié)果的不確定度也有較大影響。

圖2 HPLC與LC-MS測(cè)定配制酒中甜蜜素相對(duì)不確定度分析

5 小結(jié)

降低測(cè)量結(jié)果的不確定度，減小線性擬合過(guò)程引入的不確定度值，可以通過(guò)以下方式對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化與改進(jìn)：①選擇對(duì)化合物響應(yīng)值更高的儀器，以增加線性曲線的斜率a 值；②通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)了解樣品濃度范圍，選擇配制合適的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度區(qū)間，使供試品溶液濃度盡量接近曲線中點(diǎn)；③增加供試品溶液測(cè)試次數(shù)；④增加標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液測(cè)定次數(shù)。

檢測(cè)過(guò)程中，如果供試品溶液濃度很低，在某一方法的檢出限或定量限附近，無(wú)法通過(guò)調(diào)整曲線濃度使供試品溶液濃度接近曲線中點(diǎn)，其檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)不確定度值將較高，此時(shí)則需要選擇靈敏度更高、檢出限更低的儀器，盡量使得供試品溶液濃度在曲線濃度的中間位置。

在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，需要盡量規(guī)范操作，減小標(biāo)準(zhǔn)溶液配制時(shí)定容和移液過(guò)程的重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差、提高樣品檢測(cè)過(guò)程中的重復(fù)性和回收率，對(duì)減小檢驗(yàn)結(jié)果的不確定度也有所幫助。