碳青霉烯耐藥高毒力肺炎克雷伯菌的實驗室檢測與臨床轉歸危險因素分析

黃燕惠,徐靖,羅文軍（江西省撫州市臨川區(qū)第一人民醫(yī)院,江西 撫州 344100）

作為臨床當中比較多見的條件致病菌，肺炎克雷伯菌（klebsiella pneumonia，KPN）在免疫功能比較弱的患者、老人、新生兒中易引發(fā)尿路感染、肺炎等疾病。但是，相較于普通的肺炎克雷伯菌（classic Klebsiella Pneumonia，cKP）來說，在毒性方面，高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent Klebsiella Pneumonia，HvKP）相對更高，會導致健康的年輕人發(fā)生重度的社區(qū)獲得性感染，譬如腦炎、肝膿腫等，具顯著的侵襲性[1]。因為抗生素的運用缺少規(guī)范性，再加上耐藥質粒和毒力質粒在細菌之間的傳播十分迅速，現如今出現了碳青霉烯耐藥高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent and carbapen-em-tesistant Klebsiella pneumonia，CR-HvKP）[2]。CR-HvKP的侵襲力非常強，有著HvKP的特性，播散幾率高，會導致胸腔、血流感染和其他器官的感染等[3-5]。近些年，CR-HvKP檢出率持續(xù)提升，使得臨床的醫(yī)治難度增加，而且已經是臨床中造成患者死亡的一個關鍵因素[1,6]。各個地區(qū)CR-HvKP感染狀況以及致死狀況都有所區(qū)別。此次研究主要對本院CR-HvKP的實驗室檢測及臨床轉歸相關危險因素展開分析與探討，以期為臨床工作提供參考與支持。

1 資料和方法

1.1 研究對象 挑選40例于2019年1月-2020年12月在我院接受治療的CR-HvKP感染患者，對其展開回顧性研究。其中源于痰/肺泡灌洗液標本、血培養(yǎng)、腹腔引流液的分別為32例、6例、2例。

1.2 儀器和和試劑 全自動微生物鑒定儀（制造商為法國生物梅里埃公司Vitek2 Compact）、凝膠成像儀（制造商為美國Bio-Rad公司）、聚合酶鏈反應（PCR）擴增儀（制造商為美國Bio-Rad公司）、細菌DNA提取試劑盒（制造商為北京天根生化科技有限公司）、電泳儀（制造商為上?？等A公司）、2×Taq Master Mix（制造商為北京康為科技有限公司）、50×TAE 緩沖液（制造商為上海生工有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 臨床資料收集 對研究對象的住院天數、年齡、臨床抗生素治療方案、治療成效、感染嚴重程度評估等信息資料進行收集，并且做好無誤記錄。

1.3.2 菌株鑒定和藥敏試驗 菌株鑒定和藥敏試驗選用的是全自動微生物鑒定儀Vitek2 Compact，借助E-test法完成替加環(huán)素的藥敏試驗，藥敏結果判定標準以CLSI2016年為參照；質控菌株是肺炎克雷伯菌ATCC700603、大腸埃希菌ATCC25922。

1.3.3 高黏液表型檢測 運用拉絲試驗方法，通過接種環(huán)挑取血瓊脂平板上新鮮菌落做牽拉，黏液絲形成而且長度不小于5mm則可做出高黏液表型陽性的判斷，反之則可作出陰性的判斷。

1.3.4 高毒力肺炎克雷伯菌菌株 以文獻[7-8]資料為參照，選擇運用PCR檢測毒力基因（rmpA2、rmpA）、碳青霉烯酶基因（OXA、KPC-2、VIM、NDM-1、IMP）、血清型（K2、K1）。1.3.5 碳青霉烯酶表型檢測 借助接種環(huán)來對受試菌株進行刮取，而且添至2ml TSB里，緊接著在菌懸液里浸入10μg美羅培南紙片，再以無菌棉簽對大腸埃希菌ATCC25922菌懸液（0.5麥氏濁度單位）進行蘸取，并在M-H、瓊脂平板上涂抹勻稱，最后從菌懸液里拿出藥敏紙片，貼于該M-H瓊脂平板上。結果判讀：抑菌圈直徑為6-15mm或是在16-18mm抑菌圈里有菌落出現，則為碳青霉烯酶陽性。

1.3.6 血清殺傷試驗 把血清抗體放進肺炎克雷伯菌懸液里，接種在Mueller-Hinton瓊脂板，1h之后菌量達到10%-100%，3h后＜10%則可判定為高敏感；1h、2h、3h后均過度生長＞100%則可判定為抵抗組，1h內過度生長＞100%，2h后或3h后＜100%則可判定為中敏感。

1.4 統(tǒng)計學分析 數據分析選擇運用SPSS21.0軟件，以頻數代表計數資料，運用Fisher確切概率法或χ2檢驗，以(±s)代表計量資料，運用t檢驗。若P＜0.05則提示對比區(qū)別存在統(tǒng)計學價值。

2 結果

2.1 患者的實驗室檢測結果 研究對象中，女性、男性分別為6例、34例，標本來源以痰/肺泡灌洗液為主，有32例，占比約為80%。所有入選的患者的毒力基因rmpA2都是陽性；拉絲試驗陽性34例，占比約為85%；K2型血清型有32例，占比約為80%；血清殺傷試驗都是抵抗組；碳青霉烯酶表型mCIM都是陽性；碳青霉烯酶基因KPC-2型36例，占比約為90%。詳細數值可見表1。

表1 患者的實驗室檢測結果

2.2 患者臨床轉歸相關危險因素分析 研究對象中，治療好轉、無效的分別為18例、22例，治療有效率是45%。對比治療無效組和治療好轉組的患者年齡區(qū)別并不存在統(tǒng)計學價值（t=1.445，P＞0.05）；對比兩個小組的感染性休克、氣管插管輔助呼吸方面的區(qū)別都存在統(tǒng)計學價值（χ2=5.689，χ2=7.592，均P＜0.05）。詳細數值可見表2。

表2 患者臨床轉歸相關危險因素分析

3 討論

現如今，國內外臨床實驗室主要是以拉絲試驗陽性來對HvKP進行判定[9-10]。而在此次研究當中，一些HvKP拉絲試驗卻是陰性，所以，此次研究參照文獻[7-8]，借助毒力基因rmpA/rmpA2陽性和血清殺傷試驗抵抗組來對HvKP作出判定。在以往，普遍認為HvKP極少會對抗生素產生耐藥性，除了天然耐藥氨芐西林以外，絕大部分菌株對于常用藥物都比較敏感。然而，近幾年有研究指出HvKP有多種結合以及整合元素存在，導致毒力基因/耐藥基因經質粒傳播于細菌之間[11-14]。當前，能夠形成CR-HvKP的途徑有兩種，具體如下：其一，HvKP借助質粒得到碳青霉烯酶基因而形成CR-HvKP，并且能夠迅速傳播于細菌之間[13-14]；其二，碳青霉烯耐藥高毒力肺炎克雷伯菌（carbapenem-Resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）借助質粒得到毒力基因，從而促進其形成[15]。傳播性強、耐多藥、毒性高，這是CR-HvKP的突出特點，所以其又被叫做真正超級細菌，為醫(yī)院感染控制以及臨床治療帶來了不小的考驗。所以，對其展開實驗室檢測和臨床轉歸相關危險因素分析是極具現實價值的。

從此次研究的結果可以看出，碳青霉烯酶基因主要是KPC-2型，這和楊欣[16]等的研究結果基本無異。血清型主要是K2，同盧峰[17]等的研究結果大致相同，而李麗[18]等曾對5例K1血清型的CR-HvKP進行了報道，付雪松[19]等曾對2例K1型和2例K2型的CR-HvKP進行了報道，表明現如今無論是K1還是K2血清型都已有CR-HvKP出現，而在我院主要是K2血清型，還需深度探究其存在的詳細機制。mCIM試驗是對碳青霉烯酶表型確認檢測的手段，特異性及敏感度都極高[20]。此外，此次研究還對比了治療無效組和治療好轉組感染性休克、氣管插管呼吸機輔助呼吸的情況，發(fā)現對比區(qū)別都存在統(tǒng)計學價值。可見，這些并發(fā)癥都會對治療成效造成干擾。此次研究結果表明，CR-HvKP的臨床治愈率偏低，即便已經治療痊愈，相較于肺炎克雷伯菌感染來說，在嚴重程度和用藥天數等方面都相對更高。所以，對此類患者的預后評估工作具有極高的復雜度，需基于藥品選用、輔助治療、基礎疾病等進行全面的思考，從而做出客觀的判斷。

總而言之，在臨床中，CR-HvKP感染具有較強的傳播性，而且治愈率偏低，對其必須加以高度重視。