外周血清UBE2Q1基因甲基化狀態(tài)在腎透明細胞癌中的臨床價值

胡 娜，解現(xiàn)慈2，張 磊2，柏 平，劉琳琳，來衛(wèi)東

(1山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，山東 臨沂 276000；2山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院)

腎透明細胞癌(Renal clear cell carcinoma，RCC)是最常見的一類腎細胞癌，靶向藥物被證明可延長晚期患者的生存與預(yù)后，但中位生存期仍少于3年。研究腎癌的早期診斷標(biāo)志物和新的治療靶點仍具有挑戰(zhàn)性。DNA甲基化作為表觀遺傳中的重要組成內(nèi)容，是腫瘤發(fā)生的早期分子事件，基因啟動子區(qū)高甲基化或低甲基化是腫瘤發(fā)生早期的一個高度靈敏的腫瘤生物標(biāo)志物[1]。泛素結(jié)合酶E2是泛素-蛋白酶體系統(tǒng)中的重要組成成員，在調(diào)控細胞周期、促進腫瘤細胞的形成及分化等方面都發(fā)揮著重要的作用[1]。本研究主要探討RCC患者外周血清泛素結(jié)合酶UBE2Q1基因啟動子甲基化狀態(tài)及臨床意義。

1 資料和方法

1.1一般資料 選取2020年1月—2021年7月在山東醫(yī)專附屬醫(yī)院確診的60例RCC患者為實驗組，其中男36例，女24例，平均年齡(57.28±17.22)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：初次發(fā)現(xiàn)腎癌；未合并其他部位腫瘤；影像學(xué)檢查診斷為腎臟惡性腫瘤，組織病理學(xué)診斷為RCC；未接受任何形式的抗腫瘤治療。參照2018年美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)腎癌TNM分期：Ⅰ期34例、Ⅱ期19例、Ⅲ期5例、Ⅳ期2例。參照2016版WHO/ISUP(WHO/國際泌尿病理學(xué)會)分級[2]：G1 15例、G2 28例、G3 11例、G4 6例。另選取同期健康志愿者20例為對照組，其中男12例，女8例，平均年齡(56.82±16.90)歲。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會審批，所有入組人員均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1DNA提取及單個核細胞分離 兩組均在空腹?fàn)顟B(tài)下取外周靜脈血5 ml，3000 r/min離心5 min，取上層清液2 mL置于EP管中，根據(jù)QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen，Germany)試劑盒操作說明書提取血清DNA；剩余血細胞樣品通過Ficoll-Paque密度梯度離心法進行單個核細胞(PBMCs)的分離。提取的DNA及PBMCs均-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。?yán)格參照Zymo Research EZ DNA Methylation-GoldTM Kit試劑盒說明進行，先配置Conversion Reagent溶液及M-Wash Buffer溶液，對提取的DNA進行亞硫酸鹽修飾。

1.2.2甲基化特異性PCR 甲基化特異性PCR反應(yīng)體系：無核酶水9.5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，Taq Premix 12.5 μL，DNA模板2 μL，充分混勻后以4000 r/min離心5 s。擴増條件：95℃運行5 min預(yù)變性，95℃運行45 s變性、58℃運行45 s退火，72℃運行60 s引物延伸，連續(xù)進行45個循環(huán)，循環(huán)完畢后在72℃運行10 min延伸，4℃保溫。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL產(chǎn)物，用2%瓊脂糖凝膠電泳并進行圖像處理。結(jié)果判斷：甲基化特異引物(M)擴增出目的條帶，而非甲基化引物(U)未擴出目的條帶，為甲基化；U擴增出目的條帶，而M無條帶擴出，為非甲基化；兩對引物均擴增出目的條帶，這種情況為部分甲基化，記入甲基化。UBE2Q1甲基化特異性PCR引物序列見表1。

1.2.3UBE2Q1基因mRNA表達水平 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測。Trizol法提取PBMCs中的RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。RT-qPCR反應(yīng)體系：2×SYBR Green Premix 10μL，cDNA 1 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，無核酶水8 μL。反應(yīng)條件：95℃、30 s預(yù)變性，95℃、5 s變性，60℃、30 s退火，72℃、30 s延伸，共循環(huán)40次；72℃、7 min終延伸。GADPH為內(nèi)參基因，UBE2Q1與GADPH的PCR引物序列見表1。實驗結(jié)果以UBE2Q1與GADPH的比值作統(tǒng)計分析。

表1 PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1兩組UBE2Q1基因甲基化狀態(tài)比較 實驗組甲基化陽性率為21.67%(13/60)，對照組為65%(13/20)。兩組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=12.84，P<0.01)。兩組UBE2Q1基因甲基化狀態(tài)代表性電泳圖結(jié)果見圖1。

圖1 各組UBE2Q1基因甲基化狀態(tài)代表性電泳圖

2.2實驗組UBE2Q1基因甲基化狀態(tài)與臨床指標(biāo)的關(guān)系 不同腫瘤TNM分期患者的UBE2Q1基因甲基化率不同，二者呈負相關(guān)(r=-0.271，P=0.036)；其他均無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表2 實驗組UBE2Q1基因甲基化與臨床指標(biāo)的關(guān)系[n(%)]

2.3實驗組UBE2Q1基因mRNA表達水平 結(jié)果顯示，腎癌患者中UBE1Q1基因非甲基化的患者mRNA的表達量為(7.40±1.11)×10-4，甲基化患者為(3.89±0.59)×10-4。二者比較有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.94，P<0.01)。

3 討論

DNA甲基化在基因表達調(diào)控、惡性腫瘤發(fā)生等重要生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。殷鳳朝等[2]研究發(fā)現(xiàn)，SERP5基因啟動子區(qū)高甲基化可能與RCC的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，高甲基化可能引起該蛋白表達降低。林英立等[3]研究表明，腎癌組織PCDH10甲基化陽性率較高，與腎癌的發(fā)生、發(fā)展及患者預(yù)后不良相關(guān)。

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在細胞內(nèi)降解了接近80%的蛋白質(zhì)，還參與細胞凋亡、細胞周期調(diào)控以及細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)等多種生理活動過程。如果泛素-蛋白酶體系統(tǒng)發(fā)生異常變化，就會導(dǎo)致生物體出現(xiàn)一系列的反應(yīng)，如炎癥、癌癥以及神經(jīng)退化等。因此，該系統(tǒng)可作為潛在的疾病診斷干預(yù)治療靶點。UBE2Q1屬于泛素結(jié)合酶E2家族成員，可以調(diào)控底物蛋白的降解和功能轉(zhuǎn)換[1]。研究顯示，UBE2Q1基因異常表達與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，UBE2Q1基因啟動子在肝癌患者外周血清中呈低甲基化表達[4-5]。

許多腫瘤患者的cfDNA中均存在異常的DNA甲基化改變[6-7]。檢測外周血清cfDNA中腫瘤相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)，有助于腫瘤患者的早期診斷、預(yù)后判斷。本研究顯示，實驗組外周血清cfDNA中UBE2Q1基因甲基化陽性率明顯低于對照組，其mRNA呈現(xiàn)高表達。提示UBE2Q1基因的低甲基化及mRNA的高表達在腎癌的發(fā)病過程中起促進作用。有研究顯示，基因的甲基化表達異常與患者腫瘤大小、分級等密切相關(guān)[8-9]。本研究分析了UBE2Q1甲基化與患者性別、年齡、腫瘤TNM分期、WHO/ISUP分級的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)RCC患者UBE2Q1甲基化率與腫瘤TNM分期具有負相關(guān)性，與其他無關(guān)。提示UBE2Q1甲基化率可用于RCC的早期診斷及預(yù)后判斷。

綜上所述，RCC患者外周血清cfDNA中UBE2Q1基因的低甲基化表達與其發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后不良相關(guān)。UBE2Q1甲基化指標(biāo)有可能成為RCC早期診斷與預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物。