模擬干旱脅迫下褪黑素和表油菜素內(nèi)酯對(duì)溝葉結(jié)縷草長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)愈傷組織再生的影響

周認(rèn)，蔡宇，林恬逸，柴明良

（浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，杭州 310058）

干旱是影響植被生長(zhǎng)最嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題之一，全球干旱半干旱地區(qū)占總陸地面積的41%，我國(guó)243 萬(wàn)km2面積的土地為干旱和半干旱地區(qū)。近年來(lái)，全球氣候的變化，人口、農(nóng)業(yè)用水需求的增長(zhǎng)以及淡水儲(chǔ)量的降低，加劇了干旱對(duì)草業(yè)生產(chǎn)的影響[1]。因此，探究植物干旱脅迫的生理生化響應(yīng)機(jī)制、培育耐旱節(jié)水型新品種是草坪草性狀改良的重要途徑。溝葉結(jié)縷草[Zoysia matrella(L.)Merr.]是我國(guó)南方最重要的草坪草之一，屬于耐旱性較強(qiáng)的暖季型草坪草，是應(yīng)對(duì)淡水資源短缺和全球變暖導(dǎo)致夏季干旱頻發(fā)問(wèn)題的潛在優(yōu)質(zhì)草種，因此，進(jìn)一步選育耐旱性強(qiáng)的新品種迫在眉睫。但溝葉結(jié)縷草幾乎無(wú)可育的種子，難以進(jìn)行雜交育種，故主要使用體細(xì)胞無(wú)性系變異技術(shù)對(duì)其性狀改良，該技術(shù)依賴于高效的離體再生體系[2]。溝葉結(jié)縷草普遍存在胚性愈傷組織誘導(dǎo)率低、繼代生長(zhǎng)緩慢以及胚性維持困難等問(wèn)題[3]。為此，本實(shí)驗(yàn)室建立了長(zhǎng)期培養(yǎng)的溝葉結(jié)縷草愈傷組織體系，通過(guò)逐代積累變異增加了獲得變異株的可能性，已借助生物技術(shù)手段篩選出多種性狀優(yōu)良的植株[4?8]。由此可見(jiàn)，選擇繼代多年的溝葉結(jié)縷草愈傷組織進(jìn)行抗旱植株選育，具有培養(yǎng)條件可控、變異率高等優(yōu)勢(shì)，獲得的變異植株是篩選、評(píng)價(jià)耐旱溝葉結(jié)縷草的理想材料。

目前，關(guān)于褪黑素（melatonin, MEL）和表油菜素內(nèi)酯（epibrassinolide,EBL）對(duì)植物離體再生培養(yǎng)影響的相關(guān)研究結(jié)果表明：MEL 能提高滇黃芩（Scutellaria amoena）愈傷組織的生長(zhǎng)與再生水平[9]，也能促進(jìn)葡萄（Vitis vinifera）體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)[10]；EBL 顯著提升了長(zhǎng)期繼代的溝葉結(jié)縷草愈傷組織的增殖、再生能力[11]。故探究MEL和EBL恢復(fù)愈傷組織再生能力的最適濃度，能解決干旱選擇壓力下長(zhǎng)期繼代的愈傷組織再生率下降的問(wèn)題，有利于獲得抗性變異株系。

干旱時(shí)植物體產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species, ROS），從而引發(fā)氧化脅迫，該現(xiàn)象對(duì)植物細(xì)胞干旱脅迫下的再生過(guò)程具有雙重作用：一方面抗氧化酶活性提高能促進(jìn)再生；另一方面發(fā)生氧化脅迫的細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，可導(dǎo)致細(xì)胞死亡[12]。聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）作為模擬干旱劑，通過(guò)調(diào)節(jié)基質(zhì)的滲透壓來(lái)抑制植物體的水分吸收，創(chuàng)造類似于在實(shí)際干旱時(shí)完整植物細(xì)胞中觀察到的水分虧缺條件，且PEG 無(wú)毒性，是誘導(dǎo)植物干旱狀態(tài)理想的滲透調(diào)節(jié)劑之一[13]?？梢?jiàn)，選擇適宜濃度的PEG 是篩選獲得耐旱植株至關(guān)重要的前提。

本研究以MEL和EBL作為外源激素，探究2種激素對(duì)干旱脅迫下長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)的溝葉結(jié)縷草愈傷組織再生水平的影響，分析再生過(guò)程中愈傷組織抗氧化酶的活性變化，為外源MEL 和EBL 對(duì)繼代多年的溝葉結(jié)縷草在逆境脅迫下的生理生化調(diào)控機(jī)制研究、再生能力的恢復(fù)以及耐旱體細(xì)胞無(wú)性系變異篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為浙江大學(xué)觀賞植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室離體繼代培養(yǎng)17 年的溝葉結(jié)縷草胚性愈傷組織體系，繼代培養(yǎng)基為Murashige & Skoog（MS）培養(yǎng)基＋2.00 mg/L 2，4?二氯苯氧乙酸＋1.15 g/L 脯氨酸＋40.00 g/L 蔗糖＋3.00 g/L 植物凝膠，添加0.10 mg/L芐氨基嘌呤、0.20 mg/L糠基腺嘌呤、0.15 mg/L玉米素和0.10 mg/L噻苯隆，每4周繼代培養(yǎng)1次[14]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 模擬干旱脅迫下愈傷組織的再生

在1/2 MS 基本培養(yǎng)基中加入30.00 g/L 蔗糖、3.00 g/L植物凝膠，并分別添加0、5%、10%、15%、20%的PEG?6000（上海阿拉丁生物試劑有限公司），再加入2?嗎啉乙磺酸（2?morpholinoethanesulfonic acid,MES）緩沖液，穩(wěn)定培養(yǎng)基的pH[15]。在預(yù)培養(yǎng)3周的愈傷組織中，選取直徑約為3 mm，大小相似、長(zhǎng)勢(shì)旺盛的愈傷組織塊接種至培養(yǎng)瓶中，每瓶接種9（3×3）塊，各濃度梯度設(shè)置5個(gè)生物學(xué)重復(fù)。在光照16 h/d，光照強(qiáng)度約為40.00 μmol/（m2·s），溫度為（25±2）℃的組織培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)。再生6周后，觀察并計(jì)算愈傷組織的生芽數(shù)、再生率及褐化率[11]等。

1.2.2 模擬干旱脅迫下褪黑素、表油菜素內(nèi)酯對(duì)愈傷組織再生的影響

在0～20%PEG?6000的再生培養(yǎng)基中，分別添加不同濃度的MEL 或EBL（表1），MEL、EBL 均購(gòu)于上海阿拉丁生物試劑有限公司。愈傷組織接種方式、再生培養(yǎng)條件、周期以及再生指標(biāo)觀察記錄方法同1.2.1節(jié)。

表1 模擬干旱脅迫下溝葉結(jié)縷草愈傷組織再生過(guò)程中添加的MEL、EBL濃度Table 1 Concentrations of MEL and EBL added during the callus regeneration of Z. matrella under simulated drought stress

1.2.3 模擬干旱脅迫下褪黑素、表油菜素內(nèi)酯對(duì)愈傷組織再生生理的影響

對(duì)不同處理的溝葉結(jié)縷草愈傷組織再生6周后的植株進(jìn)行抗氧化酶活性測(cè)定，包括過(guò)氧化氫酶（catalase, CAT）、超 氧 化 物 歧 化 酶（superoxide dismutase, SOD）、過(guò)氧化物酶（peroxidase, POD）的活性和丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量。隨機(jī)稱取每個(gè)處理下再生培養(yǎng)6周后的植株0.10 g，加入液氮，每個(gè)處理取3 個(gè)重復(fù)，隨后加入3 mL 50 mmol/L 磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline,PBS），將混合物置于研磨儀中，研磨充分后，在4 ℃條件下以1.2×104r/min 離心20 min，保留上清液。參考LIN 等[16]、LIU 等[17]的方法，用UV?2550 型分光光度計(jì)分別測(cè)定抗氧化酶CAT、POD、SOD 活性及MDA含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果均取3 次生物學(xué)重復(fù)的平均值，使用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行方差分析（analysis of variance,ANOVA）以及鄧肯多重比較，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 模擬干旱脅迫下褪黑素、表油菜素內(nèi)酯對(duì)溝葉結(jié)縷草愈傷組織再生的影響分析

由觀察得知，再生過(guò)程中溝葉結(jié)縷草胚性愈傷組織的顏色由淺黃轉(zhuǎn)為深綠，14 d 后表面突起分化形成再生芽，繼而長(zhǎng)出再生苗，愈傷組織部分則變?yōu)楹诤稚Ｔ诟珊得{迫下，其再生率受到影響，且隨著干旱脅迫程度加劇，再生率從17.4%降至0（表2）。當(dāng)PEG?6000 質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到15%時(shí)，大部分愈傷組織褐化死亡，分化芽平均數(shù)降至0.6個(gè)；當(dāng)使用20%PEG?6000脅迫時(shí)，愈傷組織失去分化能力，再生率為0；而在5%或10% PEG?6000 脅迫下，部分愈傷組織能分化成苗并生根。

愈傷組織的再生水平在不同濃度MEL 或EBL處理下存在差異。在0.20 mmol/L MEL 處理下，愈傷組織的再生率最高，為61.1%，是對(duì)照組的3.5倍。當(dāng)MEL 濃度大于0.50 mmol/L 或EBL 濃度大于0.50 μmol/L 時(shí)，愈傷組織喪失再生能力，褐化率顯著上升，說(shuō)明高濃度激素抑制了再生，甚至導(dǎo)致愈傷組織死亡。

干旱脅迫時(shí)添加不同濃度MEL或EBL，溝葉結(jié)縷草愈傷組織再生率表現(xiàn)出明顯差異（表2）。培養(yǎng)6周后，添加適宜濃度的MEL或EBL對(duì)愈傷組織再生率具有促進(jìn)作用，2種激素均緩解了干旱脅迫對(duì)愈傷組織再生造成的負(fù)面影響。MEL 或EBL 對(duì)愈傷組織再生水平的促進(jìn)效果隨著濃度的增加先增大后減小。無(wú)干旱脅迫時(shí)，0.20 mmol/L MEL使愈傷組織再生率達(dá)到最高，褐化率隨著MEL 濃度升高而增加。在5% PEG?6000 脅迫下，0.10 mmol/L MEL 和0.10 μmol/L EBL對(duì)愈傷組織再生率促進(jìn)最大，能恢復(fù)并提高其再生率分別至37.0%、20.3%，分別為對(duì)照的2.3倍和1.2倍，其次是0.05 mmol/L MEL顯著提高了愈傷組織的再生水平。在10%PEG?6000 脅迫下，0.20 mmol/L MEL和0.50 μmol/L EBL使愈傷組織再生率高達(dá)55.6%和20.8%，除了0.10 mmol/L EBL 處理，其余各濃度的MEL、EBL處理組都在一定程度上恢復(fù)了愈傷組織的再生能力。當(dāng)PEG?6000質(zhì)量分?jǐn)?shù) 達(dá) 到15%時(shí)，0.10 mmol/L MEL 和0.05 μmol/L EBL 促進(jìn)再生的作用最強(qiáng)，再生率分別為對(duì)照的10.4倍、6.7倍，0.20 mmol/L MEL和0.10 μmol/L EBL的作用次之。高濃度PEG破壞了愈傷組織胚性細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，造成了無(wú)法逆轉(zhuǎn)的傷害，外源施加MEL 和EBL 不能恢復(fù)其再生能力。值得注意的是，0.05 mmol/L MEL對(duì)高濃度干旱脅迫下愈傷組織的再生有一定的恢復(fù)作用，再生率為44.4%，該部分再生植株可作為耐旱株系進(jìn)一步進(jìn)行田間篩選。

表2 模擬干旱脅迫下MEL、EBL對(duì)溝葉結(jié)縷草愈傷組織再生的影響Table 2 Effects of MEL and EBL on callus regeneration of Z.matrella under simulated drought stress

在5%～15% PEG?6000 脅 迫 下，0.05～0.20 mmol/L MEL或0.05～0.50 μmol/L EBL處理對(duì)長(zhǎng)期繼代的愈傷組織分化水平具有顯著的恢復(fù)作用，其中，在10%PEG?6000脅迫時(shí)加入0.20 mmol/L MEL的條件下，培養(yǎng)基水勢(shì)較低，愈傷組織細(xì)胞滲透吸水能力變差，但仍然保持一定的吸水量，故能保持高再生率。MEL和EBL濃度過(guò)高則抑制再生，并導(dǎo)致褐化率顯著升高（圖1）。

圖1 再生6周后模擬干旱脅迫下MEL處理的愈傷組織再生情況Fig.1 Regeneration status of the callus treated with MEL under simulated drought stress after six weeks

2.2 MEL、EBL 對(duì)模擬干旱脅迫下溝葉結(jié)縷草再生生理指標(biāo)的影響分析

模擬干旱脅迫下，MEL或EBL對(duì)溝葉結(jié)縷草愈傷組織再生過(guò)程中的保護(hù)酶活性和MDA含量有明顯影響（P＜0.05）（圖2），不同濃度MEL 或EBL 對(duì)CAT、SOD、POD 活性以及MDA 的作用效果不同。在未獲得再生植株的處理組中，對(duì)其愈傷組織進(jìn)行生理測(cè)定。無(wú)干旱脅迫時(shí)，0.20 mmol/L MEL 處理的愈傷組織分化芽總數(shù)最多，此時(shí)CAT活性顯著升高，POD、SOD活性顯著降低。當(dāng)用5%、10%PEG?6000 脅迫時(shí)，0.05～0.20 mmol/L MEL 處理的愈傷組織酶活性變化遵循以上規(guī)律。在10%PEG?6000脅迫下，當(dāng)MEL濃度為0.10 mmol/L時(shí)，CAT活性最高，為相應(yīng)對(duì)照組的4.8倍；POD活性比相應(yīng)對(duì)照減少70.3%；SOD 活性降低至對(duì)照的61.0%。隨著MEL 濃度的增加，CAT 活性先升高后降低再升高。由此可知，MEL對(duì)溝葉結(jié)縷草愈傷組織的再生形態(tài)及生理生化機(jī)制具有重要的調(diào)節(jié)作用。

圖2 模擬干旱脅迫下MEL、EBL處理的愈傷組織再生過(guò)程中生理指標(biāo)的變化Fig.2 Physiological index differences of the regenerated callus treated with MEL and EBL under simulated drought stress

在不同程度干旱脅迫時(shí)，EBL處理的愈傷組織CAT活性先降低再升高，POD、SOD活性則先升高后降低，其中，在10% PEG?6000 脅迫時(shí)，0.10 μmol/L EBL處理的CAT活性最低，比同組對(duì)照減少31.8%，POD 活性比對(duì)照增加39.5%，SOD 活性比對(duì)照增加34.0%。在5%、10% PEG?6000 處理時(shí)，0.05～0.10 μmol/L EBL 使CAT 活性顯著降低，POD、SOD 活性升高，MDA 含量變化無(wú)顯著差異。MEL 或EBL 的濃度與其對(duì)愈傷組織抗氧化酶系統(tǒng)的調(diào)節(jié)程度呈負(fù)相關(guān)，抗氧化酶活性呈現(xiàn)的變化趨勢(shì)與再生形態(tài)指標(biāo)的變化趨勢(shì)基本一致。綜上所述，在5%、10%PEG?6000 脅迫下加入0.05～0.20 mmol/L MEL 或0.05～0.10 μmol/L EBL，可通過(guò)激活不同的抗氧化反應(yīng)途徑以減輕干旱脅迫對(duì)植物體細(xì)胞的傷害，并促進(jìn)胚性細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)育。

3 討論

采用長(zhǎng)期保存的溝葉結(jié)縷草愈傷組織進(jìn)行再生培養(yǎng)，能提高變異植株的獲得率，但隨著繼代時(shí)間和次數(shù)的增加，愈傷組織的再生率由繼代6 年的80%降至繼代17 年的17.4%[2]，且高濃度PEG 作用下愈傷組織的再生能力顯著減弱，以致無(wú)法獲得足夠的理想再生植株。因此，在再生培養(yǎng)基中添加適宜濃度的MEL 或EBL 對(duì)耐旱植株的選育十分關(guān)鍵。相關(guān)研究表明，培養(yǎng)基中添加低濃度（0.10 μmol/L或1.00 μmol/L）MEL有助于滇黃芩愈傷組織再生，高濃度（100.00 μmol/L）MEL 則抑制再生[9]。本研究中，0.20 mmol/L MEL 顯著增強(qiáng)了繼代多年的溝葉結(jié)縷草愈傷組織的再生水平，但當(dāng)MEL濃度大于0.50 mmol/L 時(shí)則抑制再生，故MEL 能促進(jìn)長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)的愈傷組織胚性保持和增殖、不定芽分化及生根，提高干旱脅迫下愈傷組織的再生率[18?19]，進(jìn)而為田間耐旱植株的篩選提供豐富材料。

繼代多年的溝葉結(jié)縷草胚性愈傷組織開(kāi)始分化時(shí)，細(xì)胞中出現(xiàn)折疊盾片狀胚胎，CAT 和POD 活性降低，SOD活性升高，MDA含量下降，說(shuō)明植物愈傷組織的再生水平與抗氧化酶活性密切相關(guān)[16,20]。測(cè)定干旱脅迫時(shí)愈傷細(xì)胞抗氧化酶活性及MDA含量，發(fā)現(xiàn)再生能力強(qiáng)的愈傷組織中至少有一種抗氧化酶活性較高，MDA含量較低。有報(bào)道表明，2種生態(tài)型的蘆葦（Phragmites communisTrin.）在20% PEG?8000 脅迫下胚性懸浮再生培養(yǎng)時(shí)，沙丘蘆葦?shù)腟OD、CAT 活性升高，比沼澤蘆葦顯示出更強(qiáng)的ROS 清除能力[21]。因此，抗氧化酶活性及MDA 含量指標(biāo)能在一定程度上反映溝葉結(jié)縷草愈傷組織在干旱脅迫下的再生能力。BAYOUMI等使用20%的PEG?6000處理幼苗1周，證實(shí)PEG?6000在小麥（Triticum aestivumL.）中產(chǎn)生了化學(xué)干旱的作用[22]，隨后PEG?6000 被用于水稻（Oryza sativaL.）[23]、甘蔗（Saccharum officinarumL.）[24]、番茄（Lycopersicon escolentumMill.）[25]、百里香（Thymus vulgarisL.）[26]等植物的耐旱性篩選研究[27]中，但在草坪草中鮮有報(bào)道。本研究中溝葉結(jié)縷草愈傷組織經(jīng)5%、10%PEG?6000處理能產(chǎn)生再生植株，說(shuō)明溝葉結(jié)縷草愈傷組織對(duì)干旱脅迫具有適應(yīng)性。

MEL具有優(yōu)越的抗氧化性，通過(guò)在酶水平或轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)活性氮、氧類代謝酶來(lái)實(shí)現(xiàn)植物的硝基氧化穩(wěn)態(tài)，從而有效緩解干旱脅迫的傷害[28?29]。本研究中，適宜濃度的MEL提高了溝葉結(jié)縷草愈傷組織離體分化過(guò)程中的CAT活性，有利于早期胚胎發(fā)育和胚性細(xì)胞的分化，這與BIDABADI等的研究結(jié)果[30]基本一致；同時(shí)降低了POD 活性，而低水平POD活性對(duì)細(xì)胞分裂、增殖具有促進(jìn)作用[20]。因此，MEL主要通過(guò)提高CAT活性、降低POD活性來(lái)減輕干旱脅迫對(duì)愈傷組織分化的負(fù)面影響。0.02 μmol/L EBL能通過(guò)油菜素內(nèi)酯（brassinolide,BR）途徑激活長(zhǎng)期繼代的溝葉結(jié)縷草愈傷組織抗氧化酶的響應(yīng)，促進(jìn)其生長(zhǎng)和提高其再生能力，在培養(yǎng)基中可作為細(xì)胞分裂素的替代物，用于胚性愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)和再生，而濃度大于0.10 μmol/L時(shí)則抑制再生[11]。本研究表明，干旱脅迫時(shí)較高濃度EBL仍能提高愈傷組織的再生率，促使愈傷組織再生過(guò)程中POD、SOD活性顯著升高，但其作用效果不如MEL。

試驗(yàn)中，MDA 含量與再生能力呈負(fù)相關(guān)，作為判斷細(xì)胞過(guò)氧化反應(yīng)強(qiáng)弱的一個(gè)指標(biāo)，未加MEL、EBL時(shí)，細(xì)胞內(nèi)MDA含量升高，當(dāng)添加適宜濃度的MEL、EBL 后，MDA 含量降低。說(shuō)明MEL、EBL 通過(guò)激活抗氧化酶系統(tǒng)來(lái)降低膜脂質(zhì)過(guò)氧化作用，提高抗氧化酶的活性，從而抑制MDA的產(chǎn)生和積累，增強(qiáng)愈傷組織的再生能力。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，0.20 mmol/L MEL 能促進(jìn)繼代培養(yǎng)17年的溝葉結(jié)縷草愈傷組織再生，顯著提高其CAT 活性。模擬干旱脅迫導(dǎo)致愈傷組織的再生能力下降，在5%或10%PEG?6000 脅迫下，愈傷組織仍能再生；而在高濃度PEG?6000 模擬干旱脅迫下，愈傷組織褐化死亡，喪失分化能力。外源MEL和EBL能顯著緩解干旱脅迫對(duì)愈傷組織的損傷，恢復(fù)其生長(zhǎng)和再生的能力，從而獲得足夠的再生植株。0.20 mmol/L MEL 或0.50 μmol/L EBL 對(duì)10%PEG?6000 模擬干旱脅迫下的愈傷組織再生生長(zhǎng)具有顯著的促進(jìn)作用，其中0.20 mmol/L MEL的效果最佳。0.05～0.20 mmol/L MEL 或0.05～0.10 μmol/L EBL 可調(diào)控愈傷組織再生的生理生化過(guò)程并提高胚性細(xì)胞分化水平，進(jìn)而提高植株再生率?？傊?，本研究探索了逆境脅迫下提高長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)的愈傷組織再生能力的方法，為溝葉結(jié)縷草耐旱體細(xì)胞無(wú)性系變異育種提供了新思路。