蘿卜硫素減輕心臟移植模型大鼠缺血/再灌注損傷

王 帥，王建軍，孫秀紅，鄔鵬宇，崔志成，李占清

(華北理工大學附屬醫(yī)院 1.心臟血管外科；2.重癥醫(yī)學科(ICU)，河北 唐山 063000)

心臟移植是終末期心臟病的首選治療方法，然而缺血/再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,I/RI)是臨床器官移植最常見的病理過程[1]，也是導致術后心功能不全和晚期并發(fā)癥的主要相關因素[1-2]。減輕 I/RI是改善移植心臟預后的關鍵途徑之一。

蘿卜硫素(sulforaphane)廣泛存在于十字科植物，在西蘭花中含量最多，具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌及抗炎等藥理作用[3-6]。磷脂酰肌醇激酶-3/絲氨酸蘇氨酸激酶(PI3K/AKT)信號通路能夠抑制細胞凋亡。有報道蘿卜硫素可激活PI3K/AKT信號通路，減輕腎臟細胞的 I/RI[7]。PI3K/AKT信號通路激活后能抑制糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)的活性，進而抑制線粒體通透性轉換孔開放，產(chǎn)生細胞保護作用。蘿卜硫素對心臟移植的保護作用，是否是通過激活PI3K/AKT/GSK-3β信號通路尚不清楚。本研究用大鼠異位異體心臟移植模型，檢測心肌細胞的損傷和細胞凋亡水平及PI3K/AKT信號通路在蘿卜硫素誘導的心肌保護中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑:康斯特保護液(HTK液)、Trizol、氯仿、異丙醇、乙醇和DEPC水(上海生工生物工程有限公司)；蘿卜硫素(格純生物有限公司)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒、肌酸激酶(creatine kinase,CK)試劑盒、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme-MB,CK-MB)試劑盒和肌鈣蛋白T(troponin T,TnT)試劑盒(北京義翹神州生物)；反轉錄試劑盒反轉錄和實時熒光定量PCR試劑盒[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]；線粒體提取試劑盒和線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)分析試劑盒(谷歌生物有限公司)；抗體分別為AKT、p-AKT、p-GSK-3β、GSK-3β、tubulin(CST公司)。

1.1.2 動物：32只SPF級雄性12周齡Wistar大鼠(上海斯萊克生物有限公司，合格證號滬：2020-0213)。

1.2 方法

1.2.1 同種異體活體心臟移植模型構建：受體大鼠在移植前分為心臟移植組(對照組)和蘿卜硫素處理組(每組n=8)，蘿卜硫素處理組在移植前24 h經(jīng)鼠尾靜脈注射藥物2.5 mg/kg，對照組給予同等劑量的0.9%氯化鈉溶液。將供心的主動脈、主肺動脈分別與受體的腹主動脈和下腔靜脈進行端側吻合。放開動脈夾即可見冠狀動脈充血，10 s左右心臟復跳。所用的操作均在潔凈條件下操作，術后注意大鼠保溫，待大鼠清醒后，蘿卜硫素處理組經(jīng)鼠尾靜脈再次注射蘿卜硫素2.5 mg/kg，對照組給予同等劑量的0.9%氯化鈉溶液。

1.2.2 標本的采集：采靜脈血，4 ℃ 2 500 r/min離心15 min，取上清液置于-20 ℃冰箱中凍存。再灌注48 h后苯巴比妥鈉20 mg/kg麻醉大鼠，取出大鼠心臟用于形態(tài)學和分子水平的研究。

1.2.3 生存率的分析:大鼠隨機分為受體和供體，每組20只，所有供體心臟取出后于移植前冷藏于4 ℃ HTK液18 h，20只受體大鼠再次分為對照組和蘿卜硫素處理組，蘿卜硫素處理組的受體于移植前24 h經(jīng)尾靜脈注射蘿卜硫素2.5 mg/kg，對照組為等量的0.9%氯化鈉溶液，每天檢查移植心臟的跳動，記錄大鼠存活日，使用Kaplan-Meier分析大鼠生存率。

1.2.4 心肌酶學的檢測：用全自動生化分析儀檢測血清中乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌鈣蛋白T(TnT)的水平，判斷心肌的損傷程度。步驟詳見試劑盒說明書。

1.2.5 TUNEL染色檢測移植心肌細胞凋亡水平：取心臟組織約50 mg，4%多聚甲醛固定后石蠟包埋，然后切片，依次經(jīng)過脫蠟和水化，3% H2O2浸泡15 min后，加入TUNEL染液反應30 min，PBS洗片最后加入DAB顯色液后，在顯微鏡下拍照，計算心肌細胞的凋亡指數(shù)，凋亡指數(shù)=染色陽性細胞/總細胞。

1.2.6 大鼠心肌細胞線粒體的提取：用差速離心法分離線粒體和胞質(zhì)成分，按照試劑盒說明書進行提取。

1.2.7 線粒體腫脹試驗(mPTP開放試驗)：將新鮮線粒體懸浮于腫脹緩沖液中，包含(mmol/L)：KCl 120，Tris·HCl 10，KH2PO45，MOPS 20。采用BCA蛋白定量試劑盒進行線粒體濃度分析，調(diào)節(jié)線粒體終濃度達到0.5 mg/mL，并接種于96孔板中，加入氯化鈣誘導mPTP開放，利用520 nm吸光度(A)值評估線粒體腫脹程度。即讀取每分鐘吸光度(A)值，吸光度(A)值的差值/分鐘即為吸光度(A)值下降率。

1.2.8 實時熒光定量PCR檢測凋亡相關基因mRNA水平:加Trizol試劑振蕩碾磨提取心臟組織總RNA，加氯仿取出混懸液中的蛋白組織，加異丙醇沉淀總RNA，用75%乙醇洗滌總RNA白色沉，DEPC水溶解總RNA，測RNA濃度后利用反轉錄試劑盒反轉錄，最后利用實時熒光定量PCR試劑盒檢測基因的表達。

具體的引物序列如下：caspase-3 F:5′-ATCG ATCGATCGAGTCGGTAT-3′，R:5′-ATATATCGTGC ATGCTAGCGAT-3′；BaxF:5′-ATCTATCGATGCTGT GTAATATCCG-3′，R:5′-ACGCGCGCGCGTGTGTGT TAACCC-3′；β-actin F:5′-ATCGCGCGCGTATCGAT CGAT-3′，R:5′-ATCGCGCGCGACATTCGATTCC-3′。

1.2.9 Western blot檢測PI3K-AKT通路蛋白表達水平：RIPA緩沖液裂解心臟組織，離心取上清進行蛋白濃度測定和SDS-PAGE。電泳結束后濾紙夾心法放入Bio-Rad濕轉裝置轉膜。加入一抗4 ℃孵育過夜，一抗結合完成后加入配二抗室溫結合2 h，加入ECL結合底物曝光顯影。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 蘿卜硫素對心臟移植大鼠生存率的影響

蘿卜硫素處理組的生存率顯著高于對照組(P<0.05)(圖1)。

圖1 蘿卜硫素處理后同種異體心臟移植大鼠生存率

2.2 蘿卜硫素對心臟移植大鼠心肌酶的影響

蘿卜硫素處理組血清LDH、CK、CK-MB和TnT的濃度均低于對照組(P<0.05)(圖2)。

P<0.001 compared with control

2.3 蘿卜硫素對大鼠心肌細胞凋亡的影響

蘿卜硫素處理組大鼠心肌細胞凋亡數(shù)量顯著低于對照組(P<0.01)(圖3)。

A.TUNEL staining; B.apoptosis index of myocardial cell; <0.01 compared with control group

2.4 蘿卜硫素對心臟移植大鼠心肌細胞凋亡蛋白表達的影響

Caspase-3和Bax在蘿卜硫素處理組的基因表達顯著低于對照組(P<0.01)(圖4)。

*P<0.01,**P<0.001 compared with control group

2.5 兩組大鼠心肌線粒體比較

對照組的線粒體吸光度(A)下降率顯著高于蘿卜硫素處理組[(45.45±8.68)vs(18.37±4.39),P<0.01]。

2.6 蘿卜硫素對心臟凋亡相關分子表達的影響

蘿卜硫素處理組受體大鼠心臟組織中PI3K/Akt/GSK-3β明顯被激活，AKT和GSK-3β的磷酸化水平明顯增加(P<0.01)，GSK-3β下游caspase-3的剪切水平降低(P<0.01)(圖5)。

A.Western blot; B.relative protein expression; <0.01 compared with control

3 討論

心臟移植引起的 I/RI目前尚無理想的治療方法，蘿卜硫素在預防 I/RI腎損傷具有一定的作用[8]，蘿卜硫素可逆轉腎臟 I/RI后凋亡相關分子的高表達。有報道蘿卜硫素對減輕 I/RI誘導的卵巢損傷具有保護作用[9-10]，還可抑制JNK和p38-MAPK依賴性活性氧誘導下的炎性反應和凋亡，在急性肝損傷及急性壞死性胰腺炎中發(fā)揮保護作用[11-12]。本研究表明蘿卜硫素可以顯著減少大鼠同種異體心臟移植術后大鼠的病死率，降低凋亡相關分子caspase-3和bax的表達，抑制心肌細胞凋亡，減輕心臟I/RI，提示蘿卜硫素對心肌I/RI的保護作用可能通過抗凋亡途徑實現(xiàn)的。

最新研究發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號通路激活后，可通過使失活GSK-3β抑制mPTP開放，從而保護細胞 I/RI[13]，那么蘿卜硫素可否通過激活PI3K/AKT信號通路，使GSK-3β失活來抑制mPTP的開放，從而減輕在臨床心臟移植的心肌 I/RI，目前尚無相關研究。

本結果顯示，蘿卜硫素處理組中Akt和GSK-3β蛋白的磷酸化水平較對照組顯著增加,GSK-3β下游的凋亡蛋白Bax和caspase-3的表達在蘿卜硫素治療后顯著降低，表明蘿卜硫素可能通過激活PI3K/Akt/GSK-3β通路抑制心肌細胞凋亡。

綜上所述，蘿卜硫素可減少缺血/再灌注誘導的心肌病理改變，通過激活PI3K/AKT信號通路，使GSK-3β失活，抑制mPTP開放，保護移植心臟。此結果為提高心臟移植手術中心肌的保護提供了實驗和理論依據(jù)。