苦參堿對(duì)胰腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞化療敏感性的影響

郭晨博,毛玉寧,張賀,張彩勤,張延英,汪永鋒*,師長(zhǎng)宏*

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué),蘭州 730030;2. 空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,西安 710032)

胰腺癌(pancreatic cancer,PC)是最致命的惡性腫瘤之一,發(fā)病率和死亡率分別位于惡性腫瘤的第七位和第六位[1-2],近幾年的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[3]。目前手術(shù)切除仍是PC患者唯一可能治愈的手段,但由于PC早期缺乏臨床癥狀和體征,直到晚期才被發(fā)現(xiàn),導(dǎo)致手術(shù)效果不佳[4]。雖然近幾年免疫療法在PC治療方面取得了一定進(jìn)展,但仍然具有一定的局限性,因此化療依舊是PC治療的最主要手段之一[5]。吉西他濱(gemcitabine,GEM)是治療PC的一線化療藥物[6],但是由于對(duì)吉西他濱的耐藥性,導(dǎo)致治療效果并不顯著,因此急需深入研究吉西他濱耐藥的機(jī)制,增強(qiáng)其敏感性[7]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)ATP結(jié)合盒(ATP binding cassette,ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)體的過(guò)表達(dá)與腫瘤耐藥相關(guān)[8]。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體是一種介導(dǎo)ATP驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的膜蛋白家族[8]。多藥耐藥蛋白2(the ATP-binding cassette ABC superfamily gmember 2,ABCG2)是ABC膜蛋白家族成員之一,研究發(fā)現(xiàn)ABCG2通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度以顯著增加化療藥物耐藥性[9],但其在胰腺癌吉西他濱耐藥中的作用并不明確,因此將ABCG2作為改善胰腺癌吉西他濱耐藥的治療靶點(diǎn)[9]。

大部分針對(duì)特定基因的分子抑制劑只能延遲癌癥的進(jìn)展,癌細(xì)胞最終將通過(guò)激活替代途徑獲得對(duì)抑制劑的耐藥性。與傳統(tǒng)的治療抑制劑相比,中藥單體具有低毒性、高安全性的特點(diǎn),在改善腫瘤細(xì)胞耐藥性中發(fā)揮著重要的作用。研究表明苦參堿具有改善腫瘤耐藥的作用?？鄥A(matrine,MT)是從豆科植物苦豆子的根和莖中分離得到的一種天然生物堿[10-11]。具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬、抑制細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移與EMT過(guò)程,逆轉(zhuǎn)耐藥,細(xì)胞周期阻滯等生物學(xué)功能,因其高生物活性而被廣泛發(fā)展為多種制劑[12]。研究發(fā)現(xiàn)苦參堿在改善胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、肝癌[13-18]耐藥中發(fā)揮著重要的作用。目前苦參堿在胰腺癌吉西他濱耐藥中的作用并不清楚,并且是否調(diào)控ABCG2的表達(dá)不明確。本研究旨在研究苦參堿在胰腺癌耐藥中的作用,探索其調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

20只SPF級(jí)雄性BALB/c裸鼠,6 ~ 7周齡,體重22 ~ 25 g,購(gòu)買自成都藥康生物科技有限公司【SCXK(川)2020-034】。環(huán)境溫度23 ~ 25℃,相對(duì)濕度40%,光照/黑暗各12 h,晝夜交替;動(dòng)物自由攝食和飲水,飼養(yǎng)于空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)屏障設(shè)施中【SYXK(陜)2019-001】。細(xì)胞異種移植模型分為對(duì)照組、苦參組、吉西他濱組、苦參堿和吉西他濱聯(lián)合組,每組5只裸鼠。相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(IACUC-20220427)。

1.1.2 細(xì)胞

人類胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)sPC-1購(gòu)自國(guó)家細(xì)胞庫(kù)-ATCC細(xì)胞資源中心。

1.1.3 主要試劑與儀器

苦參堿購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司,DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;0.05%胰酶購(gòu)自美國(guó)HyClone公司;熒光定量PCR及RNA提取試劑盒等酶標(biāo)儀(Biotek Take,美國(guó)),CCK-8檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海七海復(fù)泰生物科技有限公司;吉西他濱購(gòu)自ELI LILLY公司。

酶標(biāo)儀(Bio Tek,美國(guó)),超凈工作臺(tái)(Thermo Fisher Scientific,美國(guó)),顯微鏡(Olympus,日本),普通離心機(jī)(安徽中佳科學(xué)儀器有限公司,中國(guó)),恒溫水浴鍋(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司,中國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

AsPC-1細(xì)胞用培養(yǎng)基為含有10% FBS及青霉素(100 IU/mL)/鏈霉素(100 μg/mL)的DMEM,在5% CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 誘導(dǎo)吉西他濱耐藥胰腺癌細(xì)胞株

采用96孔板分不同濃度的吉西他濱進(jìn)行篩選,最終發(fā)現(xiàn)AsPC-1細(xì)胞系在4 μg/mL濃度的吉西他濱作用下可持續(xù)增長(zhǎng),因此選用4 μg/mL吉西他濱持續(xù)誘導(dǎo)吉西他濱敏感的胰腺癌AsPC-1細(xì)胞株,持續(xù)6個(gè)月,并觀察細(xì)胞死亡情況,最終通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其耐藥性并將胰腺癌吉西他濱耐藥株命名為AsPC-1-GEM。

1.2.3 細(xì)胞增殖

通過(guò)CCK-8測(cè)定法檢測(cè)細(xì)胞增殖。將腫瘤細(xì)胞鋪在96孔板(3000個(gè)細(xì)胞/孔)中,在細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的吉西他濱和苦參堿,培育72 h后加入100 μL培養(yǎng)基/CCK-8混合物(培養(yǎng)基:CCK-8,9∶1)孵育3 h后,測(cè)量450 nm處吸光度值,再根據(jù)吸光度值算出細(xì)胞活力。

1.2.4 實(shí)時(shí)RT-PCR分析

將AsPC-1細(xì)胞和AsPC-1-GEM細(xì)胞按照商品化RNA提取試劑盒(總RNA提取試劑盒,TIANGEN,DP419)說(shuō)明書提取總RNA。用微量酶標(biāo)儀測(cè)定RNA濃度,根據(jù)測(cè)定結(jié)果,將其濃度調(diào)整至500 ng/μL。根據(jù)TaKaRa試劑盒說(shuō)明書(PrimeScriptRTMaster Mix,TaKaRa,RR036A)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,反轉(zhuǎn)錄條件設(shè)置為37℃ 15 min,85℃ 15 s。熒光定量PCR反應(yīng)按照TaKaRa試劑盒(SYBR Premix Ex Taq Ⅱ,TaKaRa,RR820A)進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系(20 μL):SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL,上下游引物各0.5 μL,ROX Reference Dye(50×)0.4 μL,cDNA模板1 μL,ddH2O 7.6 μL。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30 s,PCR反應(yīng)95℃ 15 s,60℃ 30 s(熒光測(cè)量)40個(gè)循環(huán)。測(cè)各個(gè)樣本中的Ct值,每組樣本檢測(cè)3次,每次檢測(cè)均做3個(gè)復(fù)孔,最終Ct值以平均值表示,擴(kuò)增的基因有ABCG2,內(nèi)參為β-actin,相關(guān)信息見(jiàn)表1。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequences of genes

1.2.5 免疫印跡分析

將培養(yǎng)瓶中的AsPC-1細(xì)胞、AsPC-1-GEM細(xì)胞、0.3 mg/mL苦參堿處理72 h的AsPC-1-GEM、0.02 μg/mL吉西他濱處理72 h的AsPC-1-GEM、0.3 mg/mL苦參堿和0.02 μg/mL吉西他濱處理72 h的AsPC-1-GEM的蛋白收集起來(lái)用RIPA裂解緩沖液裂解細(xì)胞。用BCA試劑(中國(guó)Beyotime)檢測(cè)蛋白濃度。液體配置:電泳液和轉(zhuǎn)膜液配置,通過(guò)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、發(fā)光,并用相應(yīng)抗體ABCG2(Proteintech,27286-1-AP)、β-actin(Cell Signaling,8H10D10)進(jìn)行免疫印跡。最終利用Image J軟件對(duì)Western Blot結(jié)果中各條帶灰度值進(jìn)行半定量分析。

1.2.6 腫瘤細(xì)胞異種移植

將Aspc-1-GEM細(xì)胞用0.25%的胰酶消化后制備成細(xì)胞懸液,用PBS將細(xì)胞稀釋成每毫升1 × 106接種到6 ~ 7周齡的免疫缺陷裸鼠皮下,每組5只,用游標(biāo)卡尺測(cè)量皮下腫瘤的長(zhǎng)度(l)和寬度(w),腫瘤體積(V)計(jì)算公式為:V=1/2 ×l×w2。每隔3 d測(cè)定1次腫瘤體積,待對(duì)照組腫瘤體積接近1000 mm3時(shí),處死裸鼠,并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。

1.2.7 免疫組化

腫瘤組織用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,切片,用二甲苯和梯度乙醇浸泡,再通過(guò)高溫抗原修復(fù)后,內(nèi)源性過(guò)氧化物酶被阻斷。用37℃封閉山羊血清10 min。一抗(ABCG2抗體、Abcam,稀釋比1∶100)在4℃下孵育過(guò)夜。生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗在室溫黑暗中孵育20 min。在3,3’-二氨基聯(lián)苯胺染色、蘇木精、鹽酸醇分化、脫水、密封、中性膠密封后,使用Image Pro Plus 6.0軟件定量對(duì)視野中陽(yáng)性細(xì)胞的比例進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 8.4.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,計(jì)量資料以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差(± s)表示,組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),以P < 0.05為差異具有顯著性,P< 0.01為差異極具顯著性。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建胰腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞株

為了探究胰腺癌細(xì)胞耐藥性的變化,首先通過(guò)4 μg/mL吉西他濱持續(xù)誘導(dǎo)吉西他濱敏感的胰腺癌AsPC-1細(xì)胞株6個(gè)月,構(gòu)建胰腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞株,并將其命名為AsPC-1-GEM。采用CCK-8檢測(cè)不同濃度吉西他濱對(duì)AsPC-1和AsPC-1-GEM細(xì)胞株的抑制效果,結(jié)果顯示AsPC-1-GEM株對(duì)吉西他濱的敏感性降低,AsPC-1的IC50為10 μg/mL,N為8,AsPC-1-GEM的IC50為110 μg/mL,N為8,比較IC50,發(fā)現(xiàn)AsPC-1-GEM的IC50比AsPC-1具有顯著性差異(P< 0.01)(圖1A,1B)。

圖1 構(gòu)建胰腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞株Note. A. Analyze the effect of gemcitabine on the pancreatic cancer cell lines AsPC-1 and AsPC-1-GEM by CCK-8. B. Compared with AsPC-1,IC50 of AsPC-1-GEM increased significantly, **P < 0.01. (The same in the following figures)Figure 1 Inducing gemcitabine resistant cell lines by treatment with pancreatic cancer

2.2 苦參堿提高AsPC-1-GEM細(xì)胞化療敏感性

將AsPC-1-GEM細(xì)胞分成苦參堿組、吉西他濱組、苦參堿和吉西他濱聯(lián)用組。CCK-8結(jié)果顯示,聯(lián)合組對(duì)比其他兩組具有顯著性差異(圖2A)。為了進(jìn)一步確定,將苦參堿最小有效劑量0.3 mg/mL加入到不同濃度的吉西他濱中,CCK-8結(jié)果顯示苦參堿最小有效劑量在不同濃度的吉西他濱作用下都具有提高AsPC-1-GEM細(xì)胞敏感性的作用(圖2B)。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)苦參堿劑量選擇為0.3 mg/mL,吉西他濱劑量為0.02 mg/mL。

圖2 苦參堿提高了AsPC-1-GEM細(xì)胞化療敏感性Note. A. Analyze the effect of matrine on AsPC-1-GEM cellsby CCK-8. B. Analysis of the effects of matrine and gemcitabine on AsPC-1-GEM cellsby CCK-8.Compared with AsPC-1,***P < 0.001.(The same in the following figures)Figure 2 Treatment with matrine increases the sensitivity of AsPC-1-GEM cells to gemcitabine

2.3 AsPC-1-GEM細(xì)胞株ABCG2高表達(dá)

通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR篩選ABC基因,發(fā)現(xiàn)ABCG2在AsPC-1和AsPC-1-GEM差異性最大,因此將ABCG2作為研究目標(biāo)(圖3A),再通過(guò)文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)ABCG2在胰腺癌吉西他濱耐藥中發(fā)揮著重要作用[19],因此檢測(cè)了耐藥相關(guān)蛋白ABCG2的表達(dá),通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR和免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)AsPC-1-GEM對(duì)比AsPC-1的ABCG2具有顯著性差異(P< 0.01)(圖3B)。

圖3 AsPC-1耐藥前后ABCG2表達(dá)情況Note. A. qRT-PCR screening of expression of individual ABC genes before and after resistance to AsPC-1.B. Analysis ABCG2 expression after AsPC-1 resistance to gemcitabine by Western Blot.Figure 3 Expression of ABCG2 in AsPC-1 cell and AsPC-1-GEM cell

2.4 苦參堿通過(guò)降低ABCG2的表達(dá)提高AsPC-1-GEM的敏感性

為了探索苦參堿的具體分子作用機(jī)制,將AsPC-1-GEM細(xì)胞分成溶劑組、苦參堿組、吉西他濱組、苦參堿和吉西他濱聯(lián)合處理組,Western Blot結(jié)果顯示苦參堿組、苦參堿和吉西他濱聯(lián)合處理組對(duì)比對(duì)照組中的ABCG2具有顯著性差異(圖4)。

圖4 苦參堿降低AsPC-1-GEM細(xì)胞中ABCG2的表達(dá)Note. The expression of ABCG2 in AsPC-1-GEM cell after treated with matrine was analyzed by Western Blot.Compared with AsPC-1, *P < 0.05.Figure 4 Treatment with matrine reduces the expression of ABCG2 in AsPC-1-GEM cell

2.5 苦參堿降低ABCG2表達(dá)可延緩腫瘤生長(zhǎng)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證苦參堿在體內(nèi)的作用,將AsPC-1-GEM細(xì)胞以每毫升1 × 106接種到20只裸鼠皮下,監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)情況。待腫瘤長(zhǎng)至80 mm3左右時(shí),將其分為溶劑組、苦參堿組、吉西他濱組、苦參堿和吉西他濱組4組處理,苦參堿用量為50 mg/kg[20],1 d 1次,給藥方式為腹腔注射,吉西他濱用量為25 mg/kg,1周2次,給藥方式為腹腔注射,待溶劑組腫瘤體積接近1000 mm3,處死裸鼠,每3 d測(cè)量腫瘤最長(zhǎng)直徑(l),腫瘤最短直徑(w),計(jì)算體積。結(jié)果顯示苦參堿和吉西他濱聯(lián)合組對(duì)比其他三組具有顯著性差異(圖5A),腫瘤重量也具有顯著性差異(圖5B),且腫瘤生長(zhǎng)緩慢(圖5C),裸鼠體重并無(wú)顯著性差異(圖5D),免疫組化發(fā)現(xiàn)MT組和聯(lián)合組對(duì)比對(duì)照組有顯著性差異(圖5E)。

圖5 苦參堿和吉西他濱聯(lián)合組可顯著延緩體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)Note. A. Tumor growth of AsPC-1-GEM cell xenograft tumor in nude mice. B. The tumor weight AsPC-1-GEM cell xenograft. C. Tumor growth curves of AsPC-1-GEM cell l xenograft tumor in nude mice. D. Body weight changes in nude mice with AsPC-1-GEM cellxenograft tumor. E. Expression of ABCG2.Figure 5 Treatment with matrine and gemcitabine significantly delayed tumor growth

3 討論

中藥單體具有低毒、高安全性的特點(diǎn),并通過(guò)多種途徑抑制腫瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[21-22]。臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)中藥單體可顯著增強(qiáng)化療藥物的敏感性,抑制腫瘤的作用[23-24]?？鄥⑹且环N傳統(tǒng)的中藥,具有獨(dú)特的抗癌作用?？鄥A是苦參的有效成分,近年來(lái)發(fā)現(xiàn)苦參堿可以通過(guò)影響耐藥基因從而在腫瘤耐藥中發(fā)揮著重要作用[25-27],目前苦參堿在胰腺癌吉西他濱耐藥中的作用并無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道,因此本研究旨在明確苦參堿是否能夠提高胰腺癌吉西他濱耐藥株敏感性,并探索其相應(yīng)的機(jī)制。

首先選取吉西他濱敏感的人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞株,采用4 μg/mL吉西他濱持續(xù)誘導(dǎo)獲得人胰腺癌AsPC-1-GEM耐藥株,發(fā)現(xiàn)AsPC-1細(xì)胞和AsPC-1-GEM在10 000 μg/mL、1000 μg/mL、100 μg/mL、10 μg/mL的吉西他濱作用下的細(xì)胞活力的對(duì)比發(fā)現(xiàn)AsPC-1-GEM細(xì)胞活力顯著提高,并且AsPC-1-GEM的IC50為110 μg/mL,而AsPC-1細(xì)胞的IC50為10 μg/mL,AsPC-1-GEM的IC50比AsPC-1具有顯著性差異,從而證實(shí)人胰腺癌AsPC-1耐藥株建立成功。進(jìn)一步觀察苦參堿在胰腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞中的作用,圖2中CCK-8實(shí)驗(yàn)表明苦參堿具有提高胰腺癌細(xì)胞的敏感性的作用,分別設(shè)置了不同劑量的苦參堿組和不同劑量的吉西他濱組,觀察到最小有效劑量0.3 mg/mL的苦參堿可以提高AsPC-1-GEM耐藥株對(duì)吉西他濱的敏感性,因此后續(xù)研究中都是選擇0.3 mg/mL的苦參堿進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

研究發(fā)現(xiàn)腫瘤耐藥與ABCG2相關(guān)[27-30],通過(guò)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)腺癌癌吉西他濱耐藥與ABCG2有著密切的關(guān)系[31],并在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在胰腺癌細(xì)胞耐藥前后ABCG2具有顯著性差異,因此本研究將ABCG2和吉西他濱耐藥聯(lián)系起來(lái)。通過(guò)qRT-PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ABCG2在胰腺癌耐藥細(xì)胞AsPC-1-GEM中高表達(dá),并具有顯著性差異,ABCG2可能成為胰腺癌吉西他濱耐藥的治療靶點(diǎn)。將0.3 mg/mL的苦參堿加入到胰腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞株中,Western Blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)苦參堿具有降低ABCG2的表達(dá)的作用,量化結(jié)果顯示具有顯著性差異。進(jìn)一步將耐藥腫瘤細(xì)胞移植入裸鼠體內(nèi)建立異種移植模型,發(fā)現(xiàn)苦參堿和吉西他濱聯(lián)合組腫瘤對(duì)比其他三組具有顯著性差異;苦參堿和吉西他濱聯(lián)合組腫瘤的體重對(duì)比其他三組具有顯著性差異;苦參堿和吉西他濱聯(lián)合組對(duì)腫瘤體積對(duì)比其他三組有著明顯的抑制作用;通過(guò)文獻(xiàn)報(bào)道吉西他濱為25 mg/kg為安全劑量[32-33],吉西他濱毒性使吉西他濱組和聯(lián)合組的裸鼠體重均有下降,這也使得腫瘤窗口期不佳,目前苦參堿可以增加吉西他濱敏感性的作用,對(duì)吉西他濱毒性的影響較小;通過(guò)組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)苦參堿可有效降低ABCG2的表達(dá)。因此通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)苦參堿通過(guò)降低ABCG2的表達(dá),進(jìn)而提高了胰腺癌耐藥細(xì)胞的吉西他濱敏感性。

總之,本研究表明,苦參堿具有提高胰腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞敏感性的作用。體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)苦參堿可以降低ABCG2的表達(dá),從而提高胰腺癌吉西他濱耐藥株敏感性,提示苦參堿可能成為改善胰腺癌耐藥的潛在藥物。