同位素內(nèi)標(biāo)-UPLC-MS/MS法同時測定羊肉中金剛烷胺和金剛乙胺的殘留量*

張 季，凌 蕾，盧 葉，楊 沙，王蘭蘭，李 霞

(遵義市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測院，國家茶及茶制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，貴州 遵義 563099)

金剛烷胺和金剛乙胺屬于三環(huán)癸烷的結(jié)構(gòu)，廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)，對流感病毒和抗帕金森綜合征有很好的抑制效果[1]。但是隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷增加，各類傳染病此起彼伏，這類藥物的用量和頻率也隨之出現(xiàn)正增長[2]。金剛烷胺類藥物用量的不斷增加會導(dǎo)致畜禽產(chǎn)生耐藥性，也會過多地殘留在體內(nèi)，食用后影響人的健康[3]。例如會導(dǎo)致動物中毒，導(dǎo)致人體產(chǎn)生神經(jīng)毒性等副作用[4]。所以，目前明令禁止金剛烷胺和金剛乙胺在畜禽養(yǎng)殖業(yè)上的使用已是大勢所趨。在我國，農(nóng)業(yè)部2005年就已明令禁止金剛烷胺、金剛乙胺等抗病毒藥，參見農(nóng)業(yè)部560號公告[5]。由于此類藥物的可替代產(chǎn)品少有，相關(guān)畜禽養(yǎng)殖業(yè)人食品缺乏對藥物殘留的認識，所以此類藥物違規(guī)超量使用的現(xiàn)象時有發(fā)生[6]。所以，對于金剛烷胺類藥物在畜禽類食品中殘留量的檢測，是當(dāng)前需要解決的現(xiàn)實問題[7]。

當(dāng)前已報道的檢測動物源性食品中金剛烷胺和金剛乙胺的方法主要有液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8]。例如高效液相色譜-示差折光檢測器(HPLC-RID)測定金剛烷胺的含量[9]，基于超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法建立了一種測定禽糞便中金剛烷胺殘留量方法[10]，一種液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛奶中金剛烷胺藥物殘留的方法被建立[11]。除此以外，一些其它類型的檢測方法也相繼確立。例如，建立快速檢測禽肉中金剛烷胺和氯霉素的間接競爭化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析方法[12]，在篩選金剛烷胺單克隆抗體的基礎(chǔ)上，建立酶聯(lián)免疫檢測方法，并研制出檢測動物組織中金剛烷胺殘留的試劑盒[13]，基于具備氣相色譜儀的中小型實驗室進行金剛烷胺的監(jiān)控，建立了金剛烷胺藥物的氣相色譜檢測法[14]，一種基于羥丙基-β-環(huán)糊精主客體競爭性包合作用的金剛烷胺藥物熒光色譜檢測方法被設(shè)計研究[15]。

目前還沒有報道在羊肉中金剛烷胺類藥物殘留量的檢測，所以本文建立了一種位素內(nèi)標(biāo)-UPLC-MS/MS法同時測定羊肉中金剛烷胺和金剛乙胺的殘留量，該方法快速高效、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，適用于羊肉中金剛烷胺類藥物的檢測。

1 實 驗

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈(質(zhì)譜純)，購自德國默克公司；實驗用水為Milli-Q超純水；金剛烷胺、金剛烷胺-D15、金剛乙胺、金剛乙胺-D4標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，購自Bepure公司；正己烷(分析純)、無水硫酸鈉(分析純)，購置科密歐公司；微孔濾頭孔徑 0.22 μm，購置安譜公司。羊肉供試樣品均為當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場購買。

1%甲酸乙腈溶液：量取1 mL甲酸，加乙腈至100 mL，搖勻即得。20%乙腈溶液：取乙腈20 mL，加水至100 mL，要搖勻即得。20%乙腈溶液飽和的正己烷：取20%乙腈溶液適量，與正己烷混合，振搖后靜止使分層。

1.2 儀器與設(shè)備

UPLCXevo TQ-S超高效液相串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀，美國Waters公司產(chǎn)品；Milli-Q Reference超純水發(fā)生器，美國Millipore公司；ALC-210.4型電子天平，德國Sartorius公司；臺式高速冷凍離心機，美國Sigma公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

金剛烷胺和金剛乙胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取金剛烷胺和金剛乙胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。-20℃保存，有效期1年。

金剛烷胺-D15和金剛乙胺-D4內(nèi)標(biāo)儲備液：準(zhǔn)確移取金剛烷胺-D15和金剛乙胺-D4標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)1.0 mg/mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。-20 ℃保存，有效期1年。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別精密量取上述金剛烷胺和金剛乙胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.1 mL和金剛烷胺-D15和金剛乙胺-D4內(nèi)標(biāo)儲備液1.0 mL于100 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻，配制成金剛烷胺和金剛乙胺、金剛烷胺-D15和金剛乙胺-D4濃度為1.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液的標(biāo)準(zhǔn)工作液。2～8 ℃保存，有效期2周。

1.4 樣品前處理

試樣的制備與保存：取適量新鮮或冷凍的空白或供試組織，絞碎并使均質(zhì)，-20 ℃以下貯存?zhèn)溆?。稱取試樣2 g置于50 mL離心管中，加金剛烷胺-D15和金剛乙胺-D4內(nèi)標(biāo)中間工作液20 μL，再加無水硫酸鈉3 g，1%甲酸乙腈溶液10 mL，2500 r/min下渦旋混勻10 min。常溫下8000 r/min離心8 min，取上清液5 mL于50 ℃下氮氣吹干。

加入20%乙腈溶液1.0 mL，充分渦旋溶解，再加入20%乙腈溶液飽和的正己烷2 mL，充分渦旋混勻，常溫下8000 r/min離心5 min。吸取下層溶液至1.5 mL離心管中，常溫下 16000 r/min離心5 min，取下層清液過0.22 μm濾膜，上機檢測。

1.5 儀器參數(shù)與測定

1.5.1 色譜條件

色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18(1.7 μm, 2.1 mm×100 mm)，柱溫：40 ℃，流動相：A：乙腈；B：0.1%甲酸水溶液，進樣量：5 μL，梯度洗脫程序見表2。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

表2 定性、定量離子和電壓Table 2 Qualitative, quantitative ions and voltages

1.5.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧ESI+，采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測MRM，毛細管電壓：3.1 kV，脫溶劑氣溫度：500 ℃，定性、定量離子和電壓見表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制Table 3 Standard working fluid

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備

準(zhǔn)確量取金剛烷胺和金剛乙胺標(biāo)準(zhǔn)工作液，用20%乙腈溶液稀釋成濃度為2、4、10、20、50 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2.2 上機條件優(yōu)化

金剛烷胺和金剛乙胺及其內(nèi)標(biāo)中含有氨基，在ESI+模式下進行檢測，能夠形成加氫的離子，在摸索質(zhì)譜條件時，配置濃度較高的標(biāo)準(zhǔn)溶劑不經(jīng)過色譜直接打入質(zhì)譜中，根據(jù)實時調(diào)節(jié)毛細管電壓，錐孔電壓，碰撞電壓等條件的方法進行方法優(yōu)化。優(yōu)化后的目標(biāo)物特征離子色譜圖見圖1～圖4。

圖1 金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)溶液特征離子色譜圖(20 ng/mL)Fig.1 Characteristics ion chromatogram ofAmantadine standard solution

圖2 金剛烷胺-D15標(biāo)準(zhǔn)溶液特征離子色譜圖(20 ng/mL)Fig.2 Characteristics ion chromatogram ofAmantadine-D15 standard solution

圖3 金剛乙胺標(biāo)準(zhǔn)溶液特征離子質(zhì)量色譜圖(20 ng/mL)Fig.3 Characteristics ion chromatogram ofRimantadine standard solution

圖4 金剛乙胺-D4標(biāo)準(zhǔn)溶液特征離子質(zhì)量色譜圖(20 ng/mL)Fig.4 Characteristics ion chromatogram ofRimantadine-D4 standard solution

2.3 前處理條件摸索

同位素內(nèi)標(biāo)的選擇：比較了使用同位素內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)法定量兩種實驗，結(jié)果顯示，不使用同位素內(nèi)標(biāo)的實驗回收率較低，不能滿足實驗需求，添加了同位素內(nèi)標(biāo)的實驗，內(nèi)標(biāo)法定量，校正了回收率，能滿足實驗需求。

凈化方式的選擇：比較了正己烷除脂凈化和過SPE小柱凈化兩種方式，SPE小柱選擇了Prime HLB和Captive EMR兩種無需活化的固相萃取柱，結(jié)果顯示，兩種SPE小柱凈化效果尚可，但均對金剛烷胺和金剛乙胺具有一定的吸附作用，導(dǎo)致提取效率不足，而正己烷除脂凈化價格便宜，效率高，也不會對目標(biāo)物進行吸附，能滿足實驗需求。

2.4 添加回收實驗

試劑空白和空白樣品：試劑空白不加試樣外，與待測試樣同步處理?？瞻讟悠啡】瞻自嚇?，與待測試樣同步處理。添加樣品：取空白試樣2 g，添加100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間工作液 100 μL，制得含量為5 μg/kg的陽性試樣，與待測試樣同步處理?；厥章蕦嶒灁?shù)據(jù)見表4。

表4 金剛烷胺和金剛乙胺的添加濃度及其平均回收率的試驗數(shù)據(jù)Table 4 Test data for adding concentrations of sterogantamine and diamine and its average recovery

3 討 論

本研究依托超高效液相色譜-三種四級桿質(zhì)譜儀和同位素內(nèi)標(biāo)法，建立了一種羊肉中金剛烷胺和金剛乙胺的檢測方法，該方法采用1%甲酸乙腈溶液提取，正己烷除脂凈化后上機檢測，線性條件為2～50 ng/mL，檢測限為2.5 μg/kg，定量限為5.0 μg/kg，在5.0 μg/kg添加濃度水平上的回收率為100.63%～114.63%。整個檢測過程，前處理簡單易操作，成本低，檢測結(jié)果穩(wěn)定準(zhǔn)確，為羊肉中金剛烷胺和金剛乙胺的檢測提供了相關(guān)性研究。