基于氧化應(yīng)激研究苦豆子不同提取物的肝毒性機制

劉學(xué)楠，李 芳，華永麗，紀(jì) 鵬，姚萬玲，魏彥明

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070

苦豆子(SophoraalopecuroidesL.)屬豆科槐屬植物。1977年被收入《中華人民共和國藥典》，是甘肅、內(nèi)蒙古、寧夏等省份重要的中藥植物資源和生態(tài)植被組成部分?？喽棺泳哂星鍩峤舛?、除濕的作用，生物堿、黃酮和糖類為主要活性成分[1]，對胃腸道等疾病具有很好的治療作用[2]。Wang等[3,4]發(fā)現(xiàn)苦豆子生物堿主要為喹諾酮類，其在抗氧化、抗寄生蟲和抗菌等方面發(fā)揮重要作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)苦豆子黃酮類成分對乙肝病毒有一定的拮抗作用[6]。目前，國內(nèi)市場上已形成了以生態(tài)環(huán)境保護(hù)、特色產(chǎn)品開發(fā)及區(qū)域發(fā)展的苦豆子植物產(chǎn)業(yè)鏈。

在傳統(tǒng)應(yīng)用中，苦豆子從未因為毒性而引起關(guān)注。近年來，藥物性肝損傷成為我國非感染性肝病的第二大病種，是歐美國家急性肝衰竭的首要病因，比例高達(dá)60%[7]。有關(guān)中藥導(dǎo)致肝毒性的臨床案例報道也日益增多，其潛在的毒性也成為國內(nèi)外研究的熱點[8]。前期急性毒性實驗發(fā)現(xiàn)，苦豆子提取物對大鼠肝臟具有一定的毒性[9]。肝臟作為機體代謝和發(fā)揮解毒功能的主要器官，其毒性的研究具有重要的意義。目前有關(guān)苦豆子引起肝臟毒性的具體作用機制仍不明確。因此，本文通過亞急性毒性實驗，觀察水煎煮(WD)、水超聲(WU)、乙醇回流(ER)和乙醇超聲(EU)四種提取物給藥后對大鼠一般行為學(xué)、組織形態(tài)學(xué)、氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響，并通過測定給藥后大鼠血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)含量、肝臟中氧化應(yīng)激指標(biāo)還原型谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)以及核因子紅系2相關(guān)因子2(Nrf2)、血紅素氧合酶1(HO-1)、SOD1、SOD2蛋白的表達(dá)與分布情況，探討苦豆子對大鼠的肝毒性作用機制，為苦豆子臨床基礎(chǔ)研究提供科學(xué)數(shù)據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦豆子采自甘肅武威地區(qū)，經(jīng)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院中獸醫(yī)學(xué)教研室魏彥明教授鑒定為豆科植物苦豆子(SophoraalopecuroidesL.)。植物鑒定后被保存在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)實驗室植物標(biāo)本室(NO.KDZ20180910)。

AST、ALT、GSH、SOD、MDA測定試劑盒由南京建成有限公司提供，生產(chǎn)批號分別為20200620、20200623、20200622、20200624、20200624。2.5%戊二醛電鏡固定液購買于北京索萊寶生物有限公司。

兔多克隆抗體(一抗)SOD1(bs-10216R)、SOD2(bs-323402R)購于北京博奧森生物有限公司；大鼠單克隆抗體(一抗)Nrf2(16396-1-AP)、HO-1(10701-1010-ap)、β-actin以及二抗HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse均購于武漢三鷹生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒、RIPA蛋白裂解液、上樣緩沖液(Loading Buffer)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、TEMED、Bis-Acr、SDS-PAGE分離膠/濃縮膠緩沖液、甘氨酸、三甲醇氨基甲烷(Tris)、PVDF膜、脫脂奶粉、磷酸鹽緩沖液、吐溫80均購于北京索萊寶科技有限公司；ECL發(fā)光液購于南京諾唯贊生物科技有限公司；蛋白電泳彩虹Marker購于賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.2 實驗動物

清潔級SD大鼠4～6周齡，雌性35只，雄性40只，體重(180 ± 20)g，由中國科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實驗動物中心提供，許可證編號(SCXX(甘)2015 -0001)。室溫調(diào)整在23±1 ℃，濕度在50%±5%，12 h光照和12h黑暗環(huán)境交替進(jìn)行，標(biāo)準(zhǔn)飲食，自由飲水。所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后，進(jìn)行實驗操作。動物福利和實驗過程嚴(yán)格按照《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》(中國科技部，2006)相關(guān)規(guī)定，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物倫理委員會監(jiān)督執(zhí)行。

1.3 實驗方法

1.3.1 藥物制備

樣品粉碎后過40目篩。分別稱取40 g苦豆子按以下4種方法提?。孩?5%乙醇回流提取(ER)，加醇量為10倍。②采用水煎煮提取(WD)，加水量為10倍。①②均浸泡1 h，加熱煎煮2 h，濾過。③采用75%乙醇超聲提取(EU)，加醇量為10倍，浸泡1 h，超聲提取40 min，濾過，收集濾液。④采用水超聲提取(WU)，加水量為10倍，浸泡1 h，超聲提取40 min，濾過，收集濾液。將4組濾液分別濃縮后定容至1 g/mL，冷藏，備用。

1.3.2 劑量選擇與動物分組

根據(jù)實驗室前期苦豆子乙醇回流提取物的亞急性毒性實驗結(jié)果以及毒性實驗劑量指導(dǎo)原則，選擇1/8 LD50作為毒性研究劑量[9]。WD、WU、EU、ER LD50分別為38.397、24.994、19.957、18.536 g/kg。根據(jù)大小鼠體表面積直接換算[9]WD、WU、EU、ER組生藥劑量分別為2.228、1.450、1.158、1.076 g/kg。實驗采用隨機數(shù)字表法分為10組，分別為WD雌性組(7只)、雄性組(8只)，WU雌性組(7只)、雄性組(8只)，EU雌性組(7只)、雄性組(8只)，ER雌性組(7只)、雄性組(8只)，雌性Control組(7只)、雄性Control組(8只)。每天早晨固定時間稱重灌胃。空白組給予等量生理鹽水，每天一次，連續(xù)灌胃30天。

1.3.3 一般行為學(xué)觀察

給藥期間觀察大鼠皮毛狀態(tài)、精神狀況、體重、體溫、飲食、尿量及糞便形狀色澤等一般行為學(xué)狀態(tài)。

1.3.4 樣品采集與處理

實驗結(jié)束后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主動脈采集血液，分別用加EDTA-K2抗凝劑和不加抗凝劑的兩種采血管收集血液，一部分用于血液生理學(xué)分析，另一部分靜置1 h，4 ℃下3 000 rpm離心10 min，收集血清置-80 ℃下保存?zhèn)溆谩？焖偾腥? cm3左右固定于2.5%戊二醛中進(jìn)行肝臟超微組織形態(tài)學(xué)觀察。肝臟右葉固定于10%中性福爾馬林用于組織病理學(xué)觀察。其余進(jìn)行臟器稱重并計算臟器系數(shù)(臟器系數(shù)=臟器重量/體重)，并剪碎-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 血清生化與肝氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測

依照生化試劑盒(南京建成)說明書分別檢測ALT、AST水平。嚴(yán)格按照說明書分別檢測各組大鼠肝組織中GSH、MDA和SOD含量。

1.3.6 肝臟組織病理切片檢測

肝組織樣品經(jīng)10%中性福爾馬林固定15天后，石蠟包埋，切片(厚度：4 μm)，蘇木精-伊紅(HE)染色，并通過Leica DFC顯微拍照系統(tǒng)采集照片。肝組織固定于2.5%戊二醛后4 ℃過夜，包埋，切片，染色，電子顯微鏡用于超微形態(tài)學(xué)觀察。

1.3.7 蛋白免疫印跡檢測(Western blotting)

取各組大鼠肝臟，加入適量裂解液以及蛋白酶抑制劑，置于冰上裂解，低溫勻漿30 min，提取蛋白。采用BCA法進(jìn)行各樣品蛋白濃度測定。吸取50 μg蛋白樣品用于SDS-PAGE(5%濃縮膠，10%分離膠)檢測，電泳結(jié)束后采用0.22 μm PVDF膜進(jìn)行蛋白濕轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)膜1.5 h。5%脫脂奶粉封閉，封閉時間2 h。一抗SOD1(1∶500)、SOD2(1∶1 000)、Nrf2(1∶2 000)、HO-1(1∶6 000)和β-actin(1∶5 000)，分別4 ℃過夜孵育；二抗HPR-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(1∶5 000)，均于室溫孵育1h。二抗孵育結(jié)束后用TBST洗滌，隨后加入ECL化學(xué)發(fā)光液，置于Amersham Imager 600化學(xué)發(fā)光儀(GE Healthcare Bio-Sciences AB，Sweden)進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光信號的采集與拍照。運用Image J 軟件對各組WB條帶灰度值進(jìn)行分析。

1.3.8 免疫組化檢測

從組織蠟塊切下4 μm厚的連續(xù)切片進(jìn)行免疫組化，脫蠟處理，用3% H2O2室溫進(jìn)行阻斷內(nèi)源性酶，PBS洗滌，采用檸檬酸鈉緩沖液煮沸15 min，進(jìn)行抗原熱修復(fù)。BSA 37 ℃封閉30 min，PBS洗滌，一抗4 ℃過夜孵育。PBS洗滌，37 ℃孵育二抗30 min。PBS洗滌，DAB鏡下顯色，水洗終止反應(yīng)，蘇木精復(fù)染，分化，水洗返藍(lán)，脫水封片，顯微鏡拍照分析。

1.3.9 統(tǒng)計方法與相關(guān)性分析方法

2 結(jié)果

2.1 一般行為學(xué)考察

整個實驗過程中，每組大鼠精神狀態(tài)、營養(yǎng)狀況良好，被毛整潔、平滑而有光澤。給藥組相比較對照組體重增長緩慢，采食量降低，而飲水量無明顯變化(見圖1)。

圖1 苦豆子不同提取物對大鼠的一般行為學(xué)影響Fig.1 Effect of different extracts of Sophora alopecuroide on rats general behavior( =5)

2.2 苦豆子不同提取物對臟器系數(shù)的影響

ER雄性組腎臟系數(shù)相比較空白組明顯升高(見圖2，P<0.05)。不同提取物給藥組肝臟系數(shù)相比較空白組呈現(xiàn)升高趨勢，其中WD雄性組、WD雌性組、WU雌性組有顯著性差異(P<0.05)。

圖2 苦豆子不同提取物對大鼠臟器系數(shù)的影響Fig.2 Effect of different extracts of Sophora alopecuroides on rats organ coefficients( =5)

2.3 苦豆子不同提取物對AST、ALT指標(biāo)的影響

AST、ALT是肝損傷的敏感性指標(biāo)。如圖3所示，苦豆子不同提取物給藥后AST指標(biāo)在雄性大鼠各組呈顯著性升高(P<0.01)，雌性WU組相比較空白組顯著性升高。ALT在雄性大鼠中呈上升趨勢，尤其在WD與ER組有顯著性而在雌性大鼠血清中WD、WU、EU均發(fā)生顯著性升高。

圖3 苦豆子不同提取物對AST、ALT指標(biāo)的影響Fig.3 Effects of different extracts of Sophora alopecuroides on AST and ALT indexes( =5)

2.4 苦豆子不同提取物對大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

大鼠肝臟組織氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測結(jié)果表明，與空白組相比較，四種提取物給藥后各組雌雄大鼠肝組織氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA含量明顯升高(P<0.05)，雄性大鼠肝臟GSH含量和SOD含量顯著降低(P<0.05)(見表1)。雌性大鼠GSH給藥各組與空白相比較有上升趨勢，其中WD明顯升高(P<0.001)(見表2)。結(jié)果表明苦豆子提取物可造成肝臟氧化損傷。

表1 不同提取物對雄性大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響Table 1 Effect of different extracts on male rats oxidative stress indexes( =5)

表2 不同提取物對雌性大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響Table 2 Effect of different extracts on female rats oxidative stress indexes( =5)

2.5 組織病理學(xué)觀察

肝臟HE染色檢測發(fā)現(xiàn)，同空白組相比較，苦豆子不同提取物給藥組均出現(xiàn)不同程度的肝細(xì)胞壞死。EU、ER組出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)(見圖4)。對大鼠各組肝臟進(jìn)行電鏡超微形態(tài)學(xué)觀察，不同提取物給藥后，肝臟出現(xiàn)明顯的自噬情況，且肝細(xì)胞核形態(tài)發(fā)生改變，皺縮。肝臟線粒體發(fā)生嵴消失、腫脹等，尤以WD組最為明顯(見圖5)。從以上組織形態(tài)學(xué)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)苦豆子可以通過發(fā)生炎癥以及損傷線粒體從而對肝臟造成一定損傷。

圖4 苦豆子不同提取物對大鼠肝臟HE染色觀察的結(jié)果 Fig.4 HE staining results of rat liver by different extracts of S.alopecuroides注：黃色箭頭代表炎癥；綠色箭頭代表壞死。Note:Yellow arrow:Inflammation;Green arrow:Necrosis.

圖5 苦豆子不同提取物對大鼠肝臟超微形態(tài)學(xué)觀察的結(jié)果Fig.5 Ultramorphologic observation results of different extracts of S.alopecuroides on rat liver注：紅色箭頭代表線粒體輕度腫脹；黃色箭頭代表自噬；綠色箭頭代表糖原顆粒。Note:Red arrow:Mitochondria slight swelling;Yellow arrow:Autophagy;Green arrow:Glycogen.

2.6 苦豆子不同提取物對Nrf2/HO-1信號通路的影響

通過免疫組織化學(xué)定位表達(dá)氧化應(yīng)激Nrf2/HO-1通路中SOD1、SOD2、Nrf2、HO-1等關(guān)鍵蛋白發(fā)現(xiàn)Nrf2主要分布于肝細(xì)胞胞漿以及在膽管上皮細(xì)胞等。如圖6所示，WD、WU、EU、ER各組給藥后Nrf2蛋白表達(dá)明顯降低，其中雄性組WD、WU、EU組Nrf2蛋白與空白相比較有顯著性差異(P<0.05)，雌性大鼠WD、EU、ER組Nrf2蛋白表達(dá)顯著性降低(P<0.05)。HO-1蛋白主要分布于肝血竇中(見圖8、圖9)，且四種提取物大鼠給藥后表達(dá)均顯著性降低(P<0.05，見圖6)。SOD1主要分布于肝血竇中，蛋白在雌性大鼠肝臟中表達(dá)均顯著性降低，而在雄性大鼠肝臟也呈下降趨勢，WD、ER組最為明顯(P<0.05)。SOD2主要分布在肝細(xì)胞胞漿中，在雄性各組大鼠肝臟表達(dá)中顯著性降低，而在雌性大鼠各組中呈上升趨勢，與空白組相比較WD、WU、ER有顯著性差異(見圖7)。

圖6 苦豆子不同提取物對大鼠Nrf2、HO-1的影響(n = 3)Fig.6 Expression of Nrf2 and HO-1 in different extracts of S.alopecuroides (n =3)

圖7 苦豆子不同提取物對大鼠對肝臟SOD1、SOD2蛋白表達(dá)的影響(n = 3)Fig.7 Protein expression of SOD1 and SOD2 in liver of rats with different extracts of S.alopecuroides (n =3)

圖8 苦豆子不同提取物作用下的雄性大鼠肝臟免疫組化圖Fig.8 Liver immunohistochemistry of male rats of different extracts of S.alopecuroides注：黃色箭頭表示目的蛋白。Note:Yellow arrow:Target protein.

圖9 苦豆子不同提取物作用下的雌性大鼠肝臟免疫組化圖Fig.9 Liver immunohistochemistry of female rats of different extracts of S.alopecuroides注：黃色箭頭表示目的蛋白。Note:Yellow arrow:Target protein.

3 討論與結(jié)論

肝臟系數(shù)的變化可以作為肝臟發(fā)生病變的一個重要指標(biāo)?？喽棺硬煌崛∥锝o藥后大鼠肝臟系數(shù)明顯升高。肝臟系數(shù)的升高提示肝臟可能發(fā)生水腫、炎癥等反應(yīng)[11]。肝臟組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞存在壞死，炎癥細(xì)胞增多。通過對ALT、AST的肝臟損傷敏感性指標(biāo)檢測[11]發(fā)現(xiàn)，不同提取物給藥后各組大鼠血清中ALT、AST水平不同程度地升高。說明苦豆子提取物長期給藥后可以造成肝功能受損，這與文獻(xiàn)報道一致[13,14]。為了進(jìn)一步對苦豆子不同提取物肝臟毒性進(jìn)行研究，本論文對肝臟進(jìn)行微觀形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)大鼠肝臟線粒體腫脹，甚至嵴消失，并有明顯的自噬現(xiàn)象。其中，自噬是機體清除異物，對外界不利因素做出的一種反應(yīng)[13]?？喽棺犹崛∥锝o藥后大鼠肝臟發(fā)生明顯的自噬現(xiàn)象，基礎(chǔ)水平的自噬對細(xì)胞是一種保護(hù)性作用，但過度自噬會引起自噬性細(xì)胞死亡甚至加速疾病的進(jìn)展[14]，同時Ravanan等[15]證明通過抑制自噬可以降低NF-κB通路造成的炎癥反應(yīng)?？喽棺硬煌崛∥锝o藥后大鼠肝臟自噬程度增加，可能是苦豆子通過增加自噬來加速肝臟毒性。

線粒體是細(xì)胞的能量代謝中心，在細(xì)胞增殖、遺傳信息傳遞、免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞生長周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡等過程中發(fā)揮重要作用。同時也是細(xì)胞產(chǎn)生ROS類物質(zhì)的關(guān)鍵場所，線粒體損傷功能障礙可引起機體代謝異常和器官功能衰退[16]。因此線粒體的損傷也有可能是肝臟發(fā)生毒性的重要原因，而本研究通過形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，苦豆子不同提取物給藥后大鼠肝臟線粒體發(fā)生腫脹，甚至嵴消失，尤其在WD組中表現(xiàn)最為明顯。究其原因可能是線粒體損傷，引起ROS自由基生成增多，最終引起機體器官功能障礙[17,18]。本研究通過測定MDA、GSH、SOD等相關(guān)氧化應(yīng)激指標(biāo)后發(fā)現(xiàn)，大鼠肝臟毒性與氧化應(yīng)激存在明顯的相關(guān)性?？喽棺硬煌崛∥镌诖菩耘c雄性大鼠給藥后中均可以使氧化應(yīng)激指標(biāo)發(fā)生不同程度的顯著性變化，其中MDA顯著性升高，SOD與空白組相比較均發(fā)生顯著性降低。MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，能反映脂質(zhì)過氧化的程度，從而反映肝細(xì)胞損傷的程度[19]。在正常情況下，SOD能將超氧化物轉(zhuǎn)化為H2O2，CAT能將H2O2轉(zhuǎn)化為H2O，而GSH可直接通過供H+拮抗氧自由基毒性，清除體內(nèi)的超氧離子及其他自由基，從而防止肝細(xì)胞損傷。事實上氧化應(yīng)激在許多疾病的發(fā)病機制中都起著至關(guān)重要的作用，如結(jié)腸炎，動脈粥樣硬化以及阿爾茨海默癥等[20-22]。本研究發(fā)現(xiàn)苦豆子引起肝損傷主要機制為氧化應(yīng)激。

Nrf2信號通路是機體內(nèi)主要氧化應(yīng)激抗氧化的主要通路，在正常情況下，Nrf2主要與Keap1結(jié)合形成一個復(fù)合物存在于細(xì)胞漿中[23,24]，保持較低的水平以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，當(dāng)機體受到外界刺激，例如藥物刺激以及氧自由基等的存在會使Nrf2與Keap1形成的復(fù)合物分離，Nrf2蛋白積累并移至細(xì)胞核內(nèi)。在細(xì)胞核中，Nrf2與抗氧化反應(yīng)元件ARE結(jié)合，誘導(dǎo)下游抗氧化蛋白HO-1、SOD1的表達(dá)[25]。SOD2主要分布線粒體中，是線粒體中清除氧自由基保護(hù)線粒體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定關(guān)鍵蛋白，其活性會隨著機體內(nèi)ROS的改變而變化[26]。HO-1、SOD1可以通過催化血紅素降解生成膽紅素，CO和Fe2+這些都可以發(fā)揮積極的抗氧化作用[26]。SOD2又稱Zn-SOD，可以清除超氧陰離子[28]。Western blotting結(jié)果顯示雄性組WD、WU、EU提取物給藥后大鼠肝臟Nrf2蛋白與空白相比較有顯著性差異，HO-1蛋白在四種提取物大鼠給藥后表達(dá)均顯著性降低(P<0.05，見圖6)，SOD1蛋白在雌性大鼠肝臟中表達(dá)均顯著性降低，而在雄性大鼠肝臟也呈下降趨勢，WD、ER組最為明顯(P<0.05)，SOD2蛋白在雄性各組大鼠肝臟表達(dá)中顯著性降低，而在雌性大鼠各組中呈上升趨勢，與空白組相比較WD、WU、ER有顯著性差異。雖然雌雄大鼠指標(biāo)變化存在差異，但都能通過影響大鼠肝氧化應(yīng)激指標(biāo)而造成肝毒性。雌性大鼠在氧化應(yīng)激狀態(tài)下可能為了維持體內(nèi)的平衡通過代償性來恢復(fù)抗氧化功能。在前期進(jìn)行急性毒性實驗時發(fā)現(xiàn)，雄性小鼠對不同提取物的毒性更為敏感，死亡率高[10]，且雌雄大鼠生理結(jié)構(gòu)不同，這也可能導(dǎo)致各項指標(biāo)在雌雄大鼠中表現(xiàn)出一定的差距。Chen等[29]對金鐵鎖提取物進(jìn)行小鼠和大鼠的急性和亞急性毒性實驗時，也同樣發(fā)現(xiàn)雌雄大鼠指標(biāo)出現(xiàn)明顯差異。

綜上所述，苦豆子提取物可以造成肝毒性，其毒性主要是調(diào)控Nrf2/HO-1通路中相關(guān)蛋白造成機體氧化應(yīng)激。