川芎內(nèi)生菌Pseudeurotium ovale代謝產(chǎn)物研究

郭文秀，巨 鳳，沈芋蓉，譚 璐，李新愛，郭大樂，鄧 赟

成都中醫(yī)藥大學藥學院 西南特色中藥資源國家重點實驗室；中藥材標準化教育部重點實驗室，成都 611137

植物內(nèi)生菌在與宿主互惠共生過程中也會產(chǎn)生很多具有藥理活性的代謝產(chǎn)物[1]。川芎為傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖。其味辛、微苦，性溫。具有活血行氣，祛風止痛的功效。目前有大量關于川芎的化學成分、藥理活性等研究，但關于川芎內(nèi)生菌的化學成分研究還較少。川芎中的內(nèi)生菌種類繁多，Wang[2]等從川芎根莖中分離得到87株內(nèi)生真菌；有學者對川芎內(nèi)生菌Cladosporiumsp.[3]、Fusariumtricinctum[4]的代謝產(chǎn)物進行研究，從中分離得到一些結(jié)構(gòu)新穎、活性良好的化合物。Pseudeurotium(假散囊菌屬)屬含有10個菌種，分別為P.bakeri、P.irregulare、P.jaipurense、P.desertorum、P.luteolum、P.ovale、P.punctatum、P.zonatum、P.macroglobosum、P.hygrophilum[5-8]。從1960年代末到21世紀初，一些學者對Pseudeurotium的代謝產(chǎn)物開展了一系列研究并從中分離得到卵磷脂[9]，pseurotins A～E[10-12]，細胞松弛素G、X、Y、Z[13]。課題組前期一直從事中藥內(nèi)生菌的化學成分研究，從川芎的根部獲取一株P.ovale內(nèi)生菌，本研究采用PDB培養(yǎng)基[14]對其進行大規(guī)模發(fā)酵，對其中的次生代謝產(chǎn)物進行分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定，并檢測抗炎活性，以期找到具有藥理活性的化合物，豐富川芎內(nèi)生菌的化學成分研究。

1 材料與方法

1.1 材料

Q Exactive UHMR復合四極桿-軌道阱質(zhì)譜儀(美國賽默飛世爾公司)，Bruker Bruker-Ascend-700-MHz核磁共振儀(德國布魯克公司)；NP7000型半制備高效液相色譜儀，NU3000型紫外檢測器(中國江蘇漢邦科技)；HPLC柱(ChromCore PFP，10×250 mm，5 μm)(鈉譜分析技術(蘇州)有限公司)。大孔樹脂D101(成都市科隆化學品有限公司)，HP-20(日本三菱化學公司)；MCI(75～150 μm，日本三菱化學公司)；Sephadex LH-20(GE醫(yī)療生命科學中國)；試劑為分析純(成都市科隆化學品有限公司)

噻唑藍(MTT)(德國Biofroxx)；鬼臼毒素(中國食品藥品檢定研究院)；小鼠巨噬細胞RAW 264.7細胞系(中國科學院上海生物科學研究院細胞資源中心)；DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清(美國Hyclone公司)；青霉素，鏈霉素(北京索拉爾生物有限公司)；小鼠IL-6 ELISA試劑盒(欣博盛生物科技有限公司，M200624-004a)；NO檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，A012-1-2)；二甲基亞砜(DMSO)(法國MP Biomedicals)。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的獲得及擴培

實驗中使用的菌株從傳統(tǒng)中藥川芎(Ligusticumchuanxiong)的新鮮植株中分離得到，菌株在PDA平板上菌落為白色，呈同心圓生長，背面呈淡黃色，培養(yǎng)基菌絲周圍有黑色球形的子囊殼；菌絲白色，子囊孢子球形，直徑1.5～2.3 μm，光滑(如圖1)。菌種(Pseudeurotiumovale)由生工生物工程(上海)股份有限公司鑒定完成(GenBank登錄號DQ513513，序列號MH858209.1)，現(xiàn)保存于成都中醫(yī)藥大學藥學院生化制藥實驗室。

圖1 Pseudeurotium ovale的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of P.ovale注：A：菌落；B：菌絲；C：子囊孢子。Note:A:Colony;B:Mycelium;C:Ascospore

將獲得的菌種P.ovale接種于PDB培養(yǎng)基中(500 mL錐形瓶，每瓶200 mL培養(yǎng)基)開展擴培，置于搖床中，以28 ℃、180 rpm培養(yǎng)14天，得到約30 L發(fā)酵液。

PDB培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L。

1.2.2 提取和分離

發(fā)酵液用乙酸乙酯萃取3次并減壓濃縮后獲得浸膏(21.25 g)，先用大孔樹脂D101進行粗分，以甲醇-水(0∶100、30∶70、60∶40、90∶10)進行洗脫，獲得4個部位(Fr.1～4)。再將Fr.4上HP-20樹脂，以甲醇-水(60∶40→95∶5)進行洗脫分離得到14個組分(組分Frs.1～14)。將Frs.4經(jīng)中壓C18柱分離，以甲醇-水(60∶40→95∶5)為洗脫液洗脫，經(jīng)半制備型HPLC進行純化得到化合物1(以70%甲醇洗脫，tR13.437 min，3.47 mg)；Frs.6經(jīng)凝膠柱，以甲醇為洗脫液進行分離，得到化合物4(以80%甲醇洗脫，tR19.100 min，33.71 mg)；Frs.7經(jīng)中壓MCI柱，以甲醇-水(40∶60→95∶5)進行分離，后經(jīng)半制備型HPLC純化后得到化合物2(以80%甲醇洗脫，tR18.413 min，4.05 mg)、3(以85%甲醇洗脫，tR14.040 min，0.52 mg)、5(以70%甲醇洗脫，tR14.930 min，0.99 mg)。

1.2.3 抗炎活性測定

通過MTT法測定化合物1對小鼠巨噬細胞(RAW 264.7)的細胞毒活性，陽性對照藥物為鬼臼毒素，詳細步驟參照Guo等[15]的方法。

抗炎活性測試，脂多糖(LPS)誘導的小鼠巨噬細胞RAW 264.7細胞炎癥篩選模型用于測試化合物1的抗炎活性。Griess方法用于檢測RAW 264.7細胞釋放的NO量，通過測量亞硝酸鹽的積累來測量NO的產(chǎn)生。在24孔板中接種RAW 264.7巨噬細胞(1×105個/mL)，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，然后分別與濃度為7.5、15、30 μg/mL的化合物1和1 μg/mL脂多糖(LPS)培養(yǎng)24小時，將沒有亞硝酸鹽的細胞培養(yǎng)基用作空白對照，并以亞硝酸鈉為標準溶液計算培養(yǎng)基中亞硝酸鹽的濃度。同時，用ELISA法檢測RAW 264.7細胞中IL-6和TNF-α的釋放，并通過細胞因子分析檢查化合物1對促炎細胞因子(IL-6和TNF-α)的抑制作用。使用小鼠酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒測定用LPS(1 μg/mL)處理的RAW 264.7巨噬細胞上清液中促炎細胞因子的表達情況。

2 實驗結(jié)果

圖2 化合物1～5的結(jié)構(gòu)Fig.2 The structure of compounds 1～5

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1淡黃色無定形粉末；由HR-ESI-MS：m/z207.101 5 [M+H]+(calcd for C12H15O3，207.102 1)推測該化合物的分子式為C12H14O3。紅外光譜顯示該化合物有羰基和雙鍵，1H NMR(700 MHz,CD3OD)和13C NMR(175 MHz,CD3OD)見表1。

表1 化合物1的NMR數(shù)據(jù)(CD3OD)Table 1 NMR spectroscopic data of compound 1 (CD3OD)

化合物1含有兩個甲基(δH1.88、δC8.65；δH1.86、δC18.71)，一個甲氧基(δH3.94，δC57.29)，13C NMR數(shù)據(jù)δ：167.31、102.34、168.96、97.04、159.59表示化合物1與3-methyldes-methoxyyangonin[16]具有相似的氧化的芳香族結(jié)構(gòu)。另外，在δ：121.43、137.02、131.90、137.61處的13C NMR數(shù)據(jù)表明它可能含有1，3-丁二烯片段。1H NMR數(shù)據(jù)表明，并且化學位移δ6.17(1H，d，J=15.4 Hz，H-1′)、7.06(1H，dd，J=15.3，10.9 Hz，H-2′)、6.27(1H，dd，J=15.0，10.9 Hz，H-3′)、6.11(1H，dq，J=14.0，6.9Hz，H-4′)表明存化合物1存在反式1，3丁二烯結(jié)構(gòu)。

根據(jù)HMBC的結(jié)果(圖3)，δH3.94(H-8)與δC168.96(C-4)相關，表明甲氧基與C-4連接；δH1.88(H-7)與δC167.31(C-2)、δC102.34(C-3)、δC168.96(C-4)相關，故C-7與C-3連接；δH6.17(H-1′)與δC159.59(C-6)，δC97.04(C-5)的HMBC相關表明C-1′和C-6相連。故化合物1的平面結(jié)構(gòu)可歸納為4-methoxy-3-methyl-6-(1E,3E)-1,3-pentadien-1-yl-2H-pyran-2-one。

圖3 化合物1的關鍵HMBC相關Fig.3 Key HMBC correlations of compound 1

化合物2淡黃色無定形粉末;1H NMR(700 MHz，CD3OD)δ：7.56(1H，s，H-4′)，7.41(1H，dd，J=14.8，11.0 Hz，H-3)，7.12(1H，d，J=14.8 Hz，H-2)，6.45(1H，ddd，J=14.4，11.0，1.3 Hz，H-4)，6.30(1H，dq，J=13.7，6.8 Hz，H-5)，2.19(3H，s，H-7′)，2.08(3H，s，H-8′)，1.91(3H，dd，J=6.8，1.3 Hz，H-6)；13C NMR(175 MHz，CD3OD)δ：193.91(C-1)，163.64(C-6′)，162.28(C-2′)，145.33(C-3)，141.66(C-5)，131.98(C-4)，130.04(C-4′)，123.48(C-2)，117.26(C-3′)，113.94(C-1′)，112.04(C-5′)，18.91(C-6)，16.36(C-7′)，8.02(C-8′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[17]報道一致，故鑒定為(2E,4E)-1-(2,6-dihydroxy-3,5-dimethylphenyl)-2,4-hexadien-1-one。

化合物3淡黃色粉末;1H NMR(700 MHz，CD3OD)δ：7.47(1H，s，H-2′)，5.51(2H，dq，J=4.9，2.1 Hz，H-4，5)，2.97(2H，t，J=7.0 Hz，H-2)，2.36(2H，m，H-3)，2.17(3H，s，H-7′)，2.06(3H，s，H-8′)，1.64(3H，m，H-6)；13C NMR(175 MHz，CD3OD)δ：205.98(C-1)，162.52(C-5′)，161.97(C-4′)，131.04(C-4)，130.43(C-2′)，126.83(C-5)，117.18(C-3′)，113.39(C-6′)，111.93(C-1′)，38.71(C-2)，29.01(C-3)，18.05(C-6)，16.35(C-7′)，7.97(C-8′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[18]報道一致，故鑒定為2-deoxy-sohirnone C。

化合物4黃色無定形粉末;1H NMR(700 MHz，CD3OD)δ：7.29(1H，dd，J=14.8，11.0 Hz，H-3′)，6.38(1H，dd，J=14.8，11.3 Hz，H-2′)，6.32(1H，d，J=14.8 Hz，H-4′)，6.22(1H，dq，J=13.8，6.8 Hz，H-5′)，3.09(1H，s，H-1)，1.90(3H，d，J=6.9 Hz，H-6′)，1.39(3H，s，4-CH3)，1.36(3H，s，2-CH3)；13C NMR(175 MHz，CD3OD)δ：201.36(C-5)，175.76(C-1′)，144.10(C-3′)，140.77(C-5′)，132.23(C-4′)，120.15(C-2′)，105.74(C-3)，104.55(C-6)，80.29(C-2)，60.93(C-4)，58.59(C-1)，21.81(4-CH3)，19.80(2-CH3)，18.91(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[19]報道一致，故鑒定為trichodimerol。

化合物5無色針狀結(jié)晶;1H NMR(700 MHz，CD3OD)δ：6.70(2H，d，J=2.2 Hz，H-4，6)，6.56(2H，dd，J=2.3，0.7 Hz，H-2，8)，2.80(6H，s，1-CH3，9-CH3)；13C NMR(175 MHz，CD3OD)δ：159.18(C-4a，5a)，156.92(C-3，7)，132.88(C-1，9)，117.58(C-9a，9b)，114.78(C-2，8)，96.56(C-4，6)，25.05(1-CH3，9-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[20]報道一致，故鑒定為3,7-dihydroxy-1,9-dimethyldibenzofuran。

2.2 抗炎活性

化合物1在56.27 μg/mL濃度下對RAW 264.7無明顯的抑制作用，對LPS誘導RAW 264.7細胞的NO、細胞炎性因子IL-6和TNF-α釋放量的影響如圖3所示。與模型LPS組相比，將化合物1和LPS與RAW 264.7細胞孵育后，NO、IL-6和TNF-α的表達顯著降低(P<0.001)，并且濃度在7.5～30 μg/mL之間存在劑量依賴關系。當化合物濃度為30 μg/mL時，NO、IL-6和TNF-α的表達水平最低。因此，化合物1對經(jīng)LPS誘導的RAW 264.7巨噬細胞的NO和炎性因子都具有良好保護作用，即具有良好的抗炎活性。

圖4 化合物1對LPS誘導的RAW 264.7細胞中NO、IL-6和TNF-α含量的影響Fig.4 Effect of compounds 1 on content of NO,IL-6 and TNF-α in LPS induced RAW 264.7 cells注：與空白組相比，###P<0.001；與LPS組相比，*P<0.05，***P<0.001。Note:Compared with control group,###P<0.001;Compared with LPS group,*P<0.05,***P<0.001.

3 討論

本研究從川芎中分離得到一株內(nèi)生菌P.ovale，并將其擴大發(fā)酵后的乙酸乙酯萃取部位經(jīng)大孔樹脂、中壓C18、中壓MCI、凝膠柱分離得到1個新的聚酮類化合物及4個已知的化合物。5個化合物均為首次從該屬菌中分離得到。此次P.ovale發(fā)酵分離的代謝物種，由分析型高效液相顯示其過了D101大孔樹脂的60%(Fr.3)甲醇部位還有很多化合物，且多為同系物，但因發(fā)酵量不夠未分離得到，由此猜測此菌還有很多未發(fā)現(xiàn)的化學成分，其中不乏具有結(jié)構(gòu)新穎的化合物值得探索；又因化合物1具有較好的抗炎活性，據(jù)文獻報道，化合物2也具有較強的抗炎活性[21]，除以上活性外，化合物3顯示出對MRSA有中等抗菌活性，MIC值為80 μg/mL[18]；化合物4對P388和A-549細胞系具有細胞毒活性，并對肝癌細胞(CBRH-7919)具有顯著的抑制作用[22]，如果對P.ovale進行進一步的研究，有望從中得到更多具有良好藥理活性的化合物。