馬尾伸筋草化學(xué)成分及抗骨質(zhì)疏松活性研究

滕希峰，劉雅蘭，楊 菲，王海娟，何 琳,2*

1廣東藥科大學(xué)，廣州 510006；2廣東省化妝品工程技術(shù)研究中心，中山 528458； 3國家中醫(yī)藥管理局嶺南藥材生產(chǎn)與開發(fā)重點(diǎn)研究室，廣州 510006

蕨類植物全世界有12 000余種，在中國分布超過2 000種[1]。蕨類植物中的石松科石松屬包含多種可以作為藥用的植物。文獻(xiàn)報(bào)道石松屬植物富含生物堿、萜類、甾體類、酚類和黃酮等多種化學(xué)成分[2,3]，具有抑制乙酰膽堿酯酶活性、細(xì)胞毒活性、抗炎、抑制α-葡萄糖苷酶、抗骨質(zhì)疏松等藥理活性[3,4]，有廣闊的開發(fā)潛力。

馬尾伸筋草(LycopodiumfargesiiHert.)是蕨類石松科石松屬植物，主要分布在廣西、貴州、四川及臺(tái)灣等地。馬尾神經(jīng)草主要治療跌打損傷和關(guān)節(jié)腫痛[5]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，馬尾伸筋草中含有大量揮發(fā)油，通過GC-MS已鑒定出74種化合物，化合物類型主要為脂肪酸類化合物，其次為烷烴類、醇類化合物[6]，尚未見文獻(xiàn)報(bào)道其他類型的化合物。為了尋找活性化合物，本研究對(duì)馬尾伸筋草95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位的化學(xué)成分進(jìn)行研究，并對(duì)所有分離得到的化合物進(jìn)行抗骨質(zhì)疏松活性篩選。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Agilent 1200 Series LC-MS液質(zhì)聯(lián)用儀(美國Agilent公司)；Bruker Advance 500型核磁共振波譜儀(德國Bruker公司)；島津SPD-20A(島津公司)；超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1F，中國蘇州凈化設(shè)備廠)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo)；多功能酶標(biāo)儀工作站(Flex Station3，美國Moleculardevices)。

硅膠(青島海洋化工有限公司)；反相填充材料RP-18(40～75 μm，Biotage公司)；Sephadex LH-20(瑞典GE healthcare)；MCI-gel CHP-20P(三菱化學(xué)公司)；MEM-α培養(yǎng)基(美國Gibco)；胎牛血清(美國Hyclone)；青霉素和鏈霉素雙抗溶液(美國Hyclone)；巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Macrophage colony stimulating factor，M-CSF)、GST-rRANKL(中山大學(xué)藥學(xué)院藥物分子設(shè)計(jì)中心)；DMSO、MTT(上海翌圣生物科技)；4%多聚甲醛(安徽Biosharp)；TRAcP染色試劑盒(美國Sigma Aldrich)。

實(shí)驗(yàn)藥材于2018年12月采于廣西玉林，經(jīng)中山大學(xué)藥學(xué)院顧瓊副教授鑒定為馬尾伸筋草(L.fargesiiHert.)，標(biāo)本(編號(hào)：20181208)存放于廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院。

動(dòng)物：雌性C57BL/6J小鼠(7周，21～22 g)由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取與分離

馬尾伸筋草的干燥品經(jīng)粉碎后稱重(5 kg)，以95%乙醇為溶劑，固液比(重量比)1∶5，利用冷浸法提取3次，合并提取液，濃縮得到粗提物(600 g)。粗提物用水混懸，用乙酸乙酯分別萃取3次，合并萃取液，濃縮得到萃取物(200 g)。

乙酸乙酯萃取物(200 g)用二氯甲烷-甲醇為溶劑(100∶0→0∶100，V/V)，經(jīng)硅膠柱色譜(100～200目)進(jìn)行梯度洗脫，得到4個(gè)組分(Fr.A～D)。Fr.A(40 g)以甲醇-水為溶劑(0∶100→100∶0，V/V)經(jīng)MCI柱層析，進(jìn)行梯度洗脫，得到4個(gè)亞組分(Fr.A1～A4)。Fr.A2(8 g)用石油醚-乙酸乙酯為溶劑(100∶0→0∶100，V/V)經(jīng)硅膠柱色譜(100～200目)得到3個(gè)亞組分(Fr.A2a～2c)。Fr.A2a(1.1 g)經(jīng)過HPLC(60%乙腈-水，2 mL/min)分離得到化合物12(10 mg)，F(xiàn)r.A2b(2.3 g)經(jīng)過HPLC(70%乙腈-水，2 mL/min)分離得到化合物11(8 mg)、13(7 mg)、14(9 mg)、15(8 mg)和16(9 mg)。Fr.B(31 g)用甲醇-水為溶劑(0∶100→100∶0，V/V)，經(jīng)RP-18柱層析，進(jìn)行梯度洗脫，得到4個(gè)亞組分(Fr.B1-B4)。Fr.B1(10 g)用甲醇洗脫，經(jīng)Sephadex LH-20柱層析得到化合物1(4.5 g)。Fr.B2(3 g)用石油醚-乙酸乙酯為溶劑(100∶0→0∶100，V/V)經(jīng)硅膠柱色譜(100～200目)得到3個(gè)亞組分Fr.B2a～2c，F(xiàn)r.B2b(1.2 g)經(jīng)過HPLC(60%乙腈-水，2 mL/min)分離得到化合物3(25 mg)、5(31 mg)和6(5 mg)。Fr.B3(6.5 g)經(jīng)Sephadex LH-20柱層析，以甲醇-水為溶劑(100∶0→0∶100，V/V)進(jìn)行梯度洗脫，得到5個(gè)亞組分(Fr.B3a～3e)。Fr.B3a(1.5 g)經(jīng)過HPLC(60%乙腈-水，2 mL/min)分離得到化合物2(23 mg)、4(11 mg)、7(13 mg)、8(9 mg)和17(9 mg)。Fr.B3c(0.93 g)經(jīng)過HPLC(60%乙腈-水，2 mL/min)分離得到化合物9(8 mg)和18(13 mg)。Fr.B3d(0.71 g)經(jīng)過HPLC(60%乙腈-水，2 mL/min)分離得到化合物10(13 mg)。

1.2.2 抗骨質(zhì)疏松活性篩選[7]

采用RANKL(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)誘導(dǎo)小鼠骨髓單核巨噬細(xì)胞(bone marrow macrophage，BMM)模型進(jìn)行抗骨質(zhì)疏松活性篩選，分離正常C57BL/6J小鼠的BMM，將BMM細(xì)胞以6×104個(gè)/mL接種于96孔板中，每孔100 μL，設(shè)置模型組(model group，MOD)、陽性對(duì)照組(control group，CON)、藥物組。細(xì)胞培養(yǎng)過夜后，用完全培養(yǎng)基配制待測化合物，使化合物的終濃度為10 μM，棄去培養(yǎng)基，將配制好的化合物分別加入孔中，陽性對(duì)照組給予阿侖膦酸鈉，模型組為等體積的培養(yǎng)基。在各組中加入M-CSF和GST-rRANKL，使培養(yǎng)液中M-CSF和GST-rRANKL的終濃度分別為30 ng/mL和50 ng/mL。每48 h換藥1次，直至第5天模型組出現(xiàn)明顯的細(xì)胞融合，獲得破骨細(xì)胞。棄去培養(yǎng)基，用4%的多聚甲醛固定30 min。之后用雙蒸水輕輕洗3次，加入配好的TRAcP染液，37 ℃孵育30 min直至出現(xiàn)顏色。在顯微鏡下觀察，將細(xì)胞核≥3個(gè)融合細(xì)胞的視為破骨細(xì)胞，計(jì)數(shù)。

用Excle軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；IC50應(yīng)用Graphpad Prism 軟件進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1無色粉末；ESI-MS：m/z442.7[M]+；分子式為C30H50O2；1H NMR(400 MHz，C5D5N)δ：5.04(2H，s，H-26)，5.02(2H，s，H-27)，3.53(2H，dd，J=10.8，5.1 Hz，H-3，21)，2.49(2H，d，J=12.6 Hz，H-7，15)，2.12(2H，m，H-7，15)，1.25(6H，s，H-23，29)，1.05(6H，s，H-24，30)，0.79(6H，s，H-25，28)；13C NMR(400 MHz，C5D5N)δ：38.1(C-1，19)，30.5(C-2，20)，78.5(C-3，21)，40.2(C-4，10，18，22)，55.5(C-5，17)，25.0(C-6，16)，39.2(C-7，15)，149.8(C-8，14)，58.4(C-9，13)，23.6(C-11，12)，29.4(C-23，29)，16.8(C-24，30)，15.4(C-25，28)，107.3(C-26，27)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道基本一致，鑒定化合物1為α-芒柄蠟素。

化合物2無色粉末；ESI-MS：m/z467[M+Na]+；分子式為C29H48O3；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：4.90(2H，s，H-27)，3.33(1H，dd，J=11.7，4.1 Hz，H-3)，3.23(1H，dd，J=11.7，4.2 Hz，H-21)，2.46(2H，m，H-7)，2.35(1H，m，H-15α)，2.07(1H，m，H-15β)，1.08(3H，s，H-25)，0.98(3H，s，H-28)，0.81(3H，s，H-24)，0.75(3H，s，H-30)，0.69(3H，s，H-23)，0.63(3H，s，H-29)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：37.1(C-1)，28.4(C-2)，78.7(C-3)，39.3(C-4)，54.8(C-5)，27.7(C-6)，42.5(C-7)，212.2(C-8)，64.8(C-9)，42.4(C-10)，21.2(C-11)，23.7(C-12)，57.3(C-13)，147.5(C-14)，37.3(C-15)，23.7(C-16)，53.7(C-17)，38.3(C-18)，37.1(C-19)，28.0(C-20)，79.1(C-21)，39.4(C-22)，27.7(C-23)，15.5(C-24)，14.6(C-25)，108.0(C-27)，14.9(C-28)，28.5(C-29)，15.5(C-30)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道基本一致，鑒定化合物2為26-nor-8-oxo-α-onocerin。

化合物3白色片狀結(jié)晶；ESI-MS：m/z458.7[M]+；分子式為C30H50O3；1H NMR(500 MHz，C5D5N)δ：5.39(1H，br s，H-15)，4.54(1H，d，J=10.9 Hz，H-24a)，3.74(1H，d，J=10.9 Hz，H-24b)，3.70(1H，m，H-3)，3.57(1H，m，H-21)，1.57(3H，s，H-23)，1.21(3H，s，H-25)，1.12(3H，s，H-26)，0.92(3H，s，H-28)，0.86(3H，s，H-29)，0.81(3H，s，H-30)；13C NMR(125 MHz，C5D5N)δ：37.8(C-1)，28.6(C-2)，80.4(C-3)，43.7(C-4)，50.4(C-5)，20.1(C-6)，46.1(C-7)，38.0(C-8)，63.3(C-9)，36.8(C-10)，25.9(C-11)，28.1(C-12)，57.9(C-13)，139.0(C-14)，123.2(C-15)，25.0(C-16)，56.7，(C-17)，38.6(C-18)，39.2(C-19)，29.0(C-20)，78.6(C-21)，39.9(C-22)，29.2(C-23)，64.9(C-24)，15.9(C-25)，24.1(C-26)，57.0(C-27)，16.9(C-28)，20.4(C-29)，14.2(C-30)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道基本一致，鑒定化合物3為serrat-14-en-3β,21α,24-triol。

化合物4白色粉末；ESI-MS：m/z481[M+Na]+；分子式為C30H50O3；1H NMR(500 MHz，C5D5N)δ：5.49(1H，s，H-15)，4.53(1H，d，J=11.2 Hz，H-24a)，3.72(1H，d，J=10.9 Hz，H-24b)，1.56(3H，s，23-CH3)，1.19(3H，s，30-CH3)，0.97(3H，s，29-CH3)，0.84(3H，s，25-CH3)，0.80(3H，s，28-CH3)，0.79(3H，s，26-CH3)；13C NMR(125 MHz，C5D5N)δ：39.4(C-1)，29.2(C-2)，80.5(C-3)，44.3(C-4)，57.0(C-5)，20.2(C-6)，46.3(C-7)，38.5(C-8)，63.5(C-9)，38.7(C-10)，25.9(C-11)，28.2(C-12)，57.8(C-13)，139.4(C-14)，123.3(C-15)，25.0(C-16)，43.8(C-17)，36.9(C-18)，32.3(C-19)，27.1(C-20)，75.7(C-21)，37.9(C-22)，24.1(C-23)，65.0(C-24)，17.0(C-25)，20.5(C-26)，57.1(C-27)，14.3(C-28)，22.6(C-29)，29.3(C-30)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道基本一致，鑒定化合物4為serrat-14-en-3β,21β,24-triol。

化合物5白色粉末；ESI-MS：m/z328.3[M]+；分子式為C21H44O2；1H NMR(400 MHz，(CD3)2CO)δ：3.52(4H，t，J=6.5 Hz，H-1，21)；13C NMR(100 MHz，(CD3)2CO)δ：62.6(CH2，C-1，21)，33.9(CH2，C-2，20)，26.8(CH2，C-3，19)，30.5(CH2，C-4，18)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致，鑒定化合物5為1,20-eicosanediol。

化合物6白色蠟狀固體；ESI-MS：m/z324.6[M]+；分子式為C23H48；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：1.25(42H，s，(CH2)21)，0.88(6H，t，J=6.6 Hz，CH3×2)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：14.3(C-1，23)，22.9(C-2，22)，32.08(C-3)，29.9(C-4～20)，31.6(C-21)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道基本一致，鑒定化合物6為二十三烷。

化合物7無色油狀物；ESI-MS：m/z355[M+H]+；分子式為C21H38O4；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.42～5.29(4H，m，H-9′，10′，12′，13′)，4.20(1H，dd，J=11.7，4.6 Hz，H-1α)，4.14(1H，dd，J=11.8，6.2 Hz，H-1β)，3.96(1H，m，H-2)，3.72(1H，m，H-3α)，3.64(1H，m，H-3β)，2.77(2H，t，J=6.8 Hz，H-11′)，2.35(2H，t，J=7.6 Hz，H-2′)，2.08(4H，m，H-8′，14′)，1.67(2H，m，H-3′)，1.25(14H，m，H-4′，5′，6′，7′，15′，16′，17′)，0.89(3H，t，J=6.5 Hz，H-18′)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：65.3(C-1)，70.4(C-2)，63.5(C-3)，174.5(C-1′)，34.3(C-2′)，25.0(C-3′)，29.5(C-4′)，29.3(C-5′)，29.2(C-6′)，29.0(C-7′)，27.3(C-8′)，130.2(C-9′)，128.0(C-10′)，25.8(C-11′)，128.2(C-12′)，130.4(C-13′)，27.4(C-14′)，29.7(C-15′)，31.7(C-16′)，22.7(C-17′)，14.2(C-18′)。上述核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道基本一致，鑒定化合物7為glycerol monolinoleate。

化合物8無色油狀物；ESI-MS：m/z352[M]+；分子式為C21H36O4；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.36(6H，m，H-9′，10′，12′，13′，15′，16′)，4.16(2H，m，H-1)，3.92(1H，m，H-2)，3.83(1H，dd，J=12.0，4.8 Hz，H-3a)，3.73(1H，dd，J=12.0，6.0 Hz，H-3b)，2.80(2H，m，H-8′)，2.34(2H，t，J=7.6 Hz，H-2′)，2.06(2H，m，H-17′)，1.60(4H，t，J=7.2 Hz，H-11′，14′)，1.25(10H，m，H-3′，7′)，0.97(3H，t，J=4.4 Hz，H-18′)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：174.5(C-1′)，34.3(C-2′)，25.0(C-3′)，29.2(C-4′，5′，6′)，29.8(C-7′)，27.3(C-8′)，130.4(C-9′)，127.9(C-10′)，25.7(C-11′)，128.4(C-12′)，128.4(C-13′)，25.8(C-14′)，127.3(C-15′)，132.1(C-16′)，22.8(C-17′)，14.4(C-18′)，65.3(C-1)，70.4(C-2)，63.5(C-3)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道基本一致，鑒定化合物8為glyceryl linolentate。

化合物9無色結(jié)晶；ESI-MS：m/z256[M]+；分子式為C15H12O4；1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ：9.68(1H，s，CHO)，9.65(1H，s，CHO)，7.64(2H，d，J=8.4 Hz，H-3′，H-5′)；13C NMR(CDCl3，100 MHz)δ：129.6(C-1)，109.0(C-2)，152.1(C-3)，147.3(C-4)，114.6(C-5)，128.0(C-6)，162.4(C-1′)，116.2(C-2′，C-6′)，132.7(C-3′，C-5′)，129.8(C-6′)，191.5(CHO)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道基本一致，鑒定化合物9為3-(4′-formylphenoxy)-4-methoxybenzaldehyde。

化合物10黃色粉末；ESI-MS：m/z271[M+H]+；分子式為C15H10O5；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.85(2H，d，J=8.3 Hz，H-2′，6′)，6.93(2H，d，J=9.2 Hz，H-3′，5′)，6.59(1H，s，H-3)，6.49(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.19(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：166.3(C-2)，103.8(C-3)，183.9(C-4)，104.8(C-10)，162.7(C-5)，100.1(C-6)，166.0(C-7)，95.0(C-8)，159.4(C-9)，122.6(C-1′)，129.5(C-2′，6′)，117.0(C-3′，5′)，163.2(C-4′)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道基本一致，鑒定化合物10為芹菜素。

化合物11白色粉末；ESI-MS：m/z121[M-H]-；分子式為C7H6O2；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：8.74(1H，s，H-7)，5.89(2H，dd，J=8.6，2.7 Hz，H-3，5)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：130.1(C-1)，133.5(C-2，6)，117.0(C-3，5)，165.5(C-4)，192.8(C-7)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道基本一致，鑒定化合物11為對(duì)羥基苯甲醛。

化合物12白色粉末；ESI-MS：m/z168.2[M]+；分子式為C8H8O4；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.44(1H，d，J=2.0 Hz，H-2)，7.42(1H，dd，J=9.0，2.0 Hz，H-6)，6.71(1H，d，J=8.7 Hz，H-5)，3.75(3H，s，3-OCH3)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：123.2(C-1)，115.8(C-2)，148.6(C-3)，152.5(C-4)，113.7(C-5)，125.2(C-6)，56.3(3-OCH3)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道基本一致，鑒定化合物12為香草酸。

化合物13白色粉末；ESI-MS：m/z167[M-H]-；分子式為C8H8O4；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.59(1H，J=1.6 Hz，H-2)，7.56(1H，dd，J=8.4，1.6 Hz，H-6)，6.84(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，3.92(3H，s，4-OCH3)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：115.6(C-2)，148.5(C-3)，151.9(C-4)，113.9(C-5)，125.0(C-6)，56.3(4-OCH3)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道基本一致，鑒定化合物13為3-羥基-4-甲氧基苯甲酸(異香草酸)。

化合物14白色粉末；ESI-MS：m/z219[M+Na]+；分子式為C10H12O4；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.54(1H，d，J=2.0 Hz，H-2)，7.47(1H，dd，J=2.0，8.3Hz，H-6)，6.98(1H，d，J=8.3 Hz，H-5)，5.12(1H，q，J=7.0 Hz，H-2′)，3.97(3H，s，3-OCH3)，1.45(3H，d，J=7.0 Hz，H-3′)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：126.1(C-1)，110.6(C-2)，151.3(C-3)，147.0(C-4)，114.2(C-5)，124.2(C-6)，200.9(C-1′)，69.0(C-2′)，23.1(C-3′)，56.3(3-OCH3)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報(bào)道基本一致，鑒定化合物14為2-羥基-1-(4-羥基-3-甲氧基-苯基)-丙基-1-酮。

化合物15淡黃色油狀物；ESI-MS：m/z177.2[M-H]-；分子式為C10H10O3；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.40(1H，d，J=15.9 Hz，H-2)，7.12(1H，dd，J=8.2，2.0 Hz，H-6′)，7.07(1H，d，J=1.9 Hz，H-3)，6.96(1H，d，J=8.2 Hz，H-5′)，6.58(1H，dd，J=16.0，7.7 Hz，H-2′)，3.95(3H，s，3′-OCH3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：126.8(C-1′)，109.6(C-2′)，147.1(C-3′)，149.1(C-4′)，115.1(C-5′)，124.2(C-6′)，153.3(C-1)，126.6(C-2)，193.8(C-3)，56.2(3′-OCH3)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報(bào)道基本一致，鑒定化合物15為3-甲氧基-4-羥基桂皮醛。

化合物16無色油狀物；ESI-MS：m/z428[M]+；分子式為C26H32O6；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.63(1H，d，J=10 Hz，H-4′)，7.35(1H，d，J=8.6 Hz，H-5′)，6.81(1H，dd，J=8.0，2.5 Hz，H-6′)，6.78(1H，d，J=2.5 Hz，H-8′)，6.24(1H，d，J=9.4 Hz，H-3′)，5.53(1H，br t，J=6.5 Hz，H-2)，5.42(1H，br d，J=8.0 Hz，H-6)，5.04(1H，t，J=7.0 Hz，H-8)，4.96(1H，br t，J=7.0 Hz，H-10)，4.71(2H，br d，J=6.5 Hz，H-1a，b)，2.34(1H，m，H-9a)，2.23(1H，m，H-9b)，1.78(3H，s，H-15)，1.67(3H，s，H-14)，1.65(3H，s，H-12)，1.58(3H，s，H-13)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：65.3(C-1)，122.1(C-2)，138.5(C-3)，47.4(C-4)，66.2(C-5)，130.1(C-6)，136.0(C-7)，78.3(C-8)，31.8(C-9)，119.0(C-10)，134.6(C-11)，25.9(C-12)，17.3(C-13)，12.8(C-14)，18.1(C-15)，161.4(C-2′)，112.7(C-3′)，143.6(C-4′)，128.9(C-5′)，113.2(C-6′)，162.1(C-7′)，101.7(C-8′)，155.9(C-9′)，113.2(C-10′)，170.4(-CO-)，21.4(-CH3)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]報(bào)道基本一致，鑒定化合物16為8-acetoxy-5-hydroxyumbelliprenin。

化合物17無色油狀物；ESI-MS：m/z171.1[M-H]-；分子式為C9H16O3；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.04(1H，dd，J=15.8，4.7 Hz，H-3)，6.04(1H，d，J=15.6 Hz，H-2)，4.41(1H，m，H-4)，1.5(2H，m，H-5)，1.29(2H，m，H-8)，0.87(3H，t，J=6.7 Hz，H-9)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：171.6(C-1)，119.6(C-2)，152.9(C-3)，71.3(C-4)，36.7(C-5)，31.8(C-6)，25.3(C-7)，22.7(C-8)，14.2(C-9)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]報(bào)道基本一致，鑒定化合物17為trans-4-hydroxy-2-nonenoic acid。

化合物18白色粉末；ESI-MS：m/z174[M]+；分子式為C10H22S；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：2.39(2H，m，SCH2)，1.66(2H，m，H-2)，1.26(15H，m，7×CH2，SH)，0.88(3H，t，J=5.2 Hz，10-CH3)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：34.2(C-1)，32.1(C-2)，29.8(C-3)，29.6(C-4)，29.5(C-5)，29.4(C-6)，29.2(C-7)，24.8(C-8)，22.9(C-9)，14.3(C-10)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]報(bào)道基本一致，鑒定化合物18為正十烷硫醇。

2.2 抗骨質(zhì)疏松活性

如圖1所示，與模型組(MOD)比較，化合物4、5、9、14、16能抑制破骨細(xì)胞生長(P<0.05)，其中5、16有顯著性差異(P<0.01)，化合物16與陽性對(duì)照組(CON)相比，結(jié)果無顯著性差異(P>0.05)，說明化合物16具有顯著的抗骨質(zhì)疏松活性，通過Graphpad Prism軟件進(jìn)行計(jì)算，其IC50為1.98 μM。

圖1 化合物1～18抗骨質(zhì)疏松活性的結(jié)果Fig.1 Anti-osteoporotic activity results of compounds 1-18注：與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。Note:Compared with model group,*P<0.05,**P<0.01.

3 結(jié)論

本論文對(duì)馬尾伸筋草全草95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部分進(jìn)行了系統(tǒng)化學(xué)成分研究，共分離鑒定了18個(gè)化合物，包括三萜類、黃酮類、香豆素類、醛類、酚酸類、脂肪酸類、烯酸類、脂肪醇類、烴類和硫醇類，表明馬尾伸筋草中含有結(jié)構(gòu)多樣的化學(xué)成分。

采用RANKL誘導(dǎo)BMM細(xì)胞模型進(jìn)行抗骨質(zhì)疏松活性評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)了1個(gè)具有潛在抗骨質(zhì)疏松活性的化合物16，其IC50值為1.98 μM，首次揭示了馬尾伸筋草中抑制骨質(zhì)疏松的活性成分，為馬尾伸筋草資源進(jìn)一步的藥物開發(fā)與利用奠定了基礎(chǔ)。

本次從馬尾伸筋草分離到的α-芒柄蠟素含量大(4.5 g/5 kg)，文獻(xiàn)報(bào)道α-芒柄蠟素有抑制乙酰膽堿酯酶活性[25]，表明馬尾伸筋草具有多種與抑制乙酰膽堿酯酶活性相關(guān)疾病的潛在應(yīng)用價(jià)值。

致謝：中山大學(xué)藥學(xué)院顧瓊副教授為本課題進(jìn)行指導(dǎo)，張毓婷博士為本課題的化合物進(jìn)行抗骨質(zhì)疏松活性測試。