非洲栽培稻基因滲入系粒形和劍葉形態(tài)性狀的QTL定位

楊瑩瑩 李若思 王一平 袁筱萍 章孟臣 楊窯龍 魏興華 馮 躍

(中國水稻研究所國家水稻改良中心/水稻生物學國家重點實驗室,浙江 杭州 310006)

水稻是重要的糧食作物，全世界1/3的人口以水稻為主食。在我國水稻約占糧食播種面積與總產(chǎn)量的35%和45%，是第一大糧食作物，是近65%人口的口糧[1]。近年來，我國人均耕地面積明顯減少，極端天氣事件頻發(fā)，糧食安全問題日益突出，提高單產(chǎn)水平成為解決該問題的重要途徑。水稻粒形性狀是影響產(chǎn)量的重要因素之一，反映粒形性狀的指標有粒長、粒寬、粒厚、籽粒長寬比、千粒重等[2]。水稻粒形不僅是評價水稻產(chǎn)量的重要指標，還會影響稻米的外觀品質(zhì)、蒸煮食味品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)[3]。水稻產(chǎn)量的物質(zhì)來源主要是光合產(chǎn)物，水稻葉片是光合作用的主要器官，劍葉作為功能葉，可以促進籽粒灌漿，對水稻千粒重起著非常關鍵的作用，從而影響水稻的產(chǎn)量[4]。因此，研究粒形和劍葉形態(tài)性狀的遺傳基礎對水稻高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)育種具有重要意義。

水稻劍葉形態(tài)和粒形性狀一般是由多基因控制的數(shù)量性狀[4-6]。隨著分子生物學特別是分子標記技術的飛速發(fā)展，DNA分子標記技術已廣泛應用于水稻遺傳連鎖圖譜的構建、基因定位克隆、分子標記輔助育種等研究領域。近20年來，越來越多的劍葉形態(tài)和粒形性狀數(shù)量性狀位點(quantitative trait locus, QTL)或基因被定位和克隆。盡管目前已經(jīng)定位了許多劍葉形態(tài)性狀QTL或基因，但只有如NAL1[7]、NAL2[8]、NAL3[8]、NAL7[9]、NRL1[10]、NRL2[11]等少數(shù)幾個基因被克隆。目前水稻中已有500多個控制粒形性狀的QTL被定位，并已克隆了包括GS3[12]、GW2[13]、GW8[14]、GL7/GW7[15-16]、GS9[17]等共60個粒形基因[18]。

鑒定和發(fā)掘不同遺傳資源中劍葉形態(tài)和粒形性狀QTL對提高水稻產(chǎn)量、改善稻米品質(zhì)具有重要作用。非洲栽培稻作為重要的水稻種質(zhì)資源，盡管有低產(chǎn)、易倒伏、易落粒等問題，但具有抗病蟲、耐干旱、耐高溫、耐鹽堿等優(yōu)良基因，對亞洲栽培稻品種改良具有重要意義[19-20]。非洲栽培稻基因滲入系可以為普通栽培稻遺傳背景提供新的有利基因，如果能將這些優(yōu)良基因引入普通栽培稻中，將為水稻高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)分子設計育種提供具有重要價值的基因資源。本研究以非洲栽培稻基因滲入系YIL60與輪回親本中9B(Z9B)雜交衍生的包含188個株系的F2和F2∶3群體為材料，對劍葉形態(tài)性狀包括劍葉長、劍葉寬，粒形性狀包括粒長、粒寬、籽粒長寬比、千粒重進行QTL定位，旨在為水稻粒形和劍葉形態(tài)性狀QTL的精細定位、克隆及分子標記輔助選擇育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從一套以非洲栽培稻Y4為供體親本、秈稻品種中9B(Z9B)為輪回親本構建的基因滲入系群體BC4F5中，篩選到一份劍葉變短變窄、籽粒變寬的基因滲入系YIL60(圖1)。以該滲入系YIL60為母本，與Z9B雜交得到F1，F(xiàn)1自交獲得包含188個株系的F2群體，F(xiàn)2單株收獲種子種植獲得F2∶3群體。

1.2 圖譜構建

利用均勻分布在水稻12條染色體上的512對SSR引物對Z9B和Y4進行多態(tài)性篩選，獲得兩親本間擴增條帶有差異的183對SSR標記，再利用這183對SSR標記對Z9B和YIL60進行多態(tài)性篩選，共篩選得到28對多態(tài)性標記，利用該28對SSR標記對F2群體各株系的DNA進行PCR擴增，構建染色體局部遺傳連鎖圖譜，用于QTL定位，染色體圖譜見圖2，圖中白色部分為Z9B的染色體圖，黑色部分為YIL60的滲入片段，該片段共有11個，分布于9條染色體上，總長度為209.3 cM。

1.3 田間種植與性狀調(diào)查

分別于2018年和2019年5—9月將Z9B、YIL60、F2和F2∶3群體種植在中國水稻研究所富陽實驗基地。F2、F2∶3群體單本插，F(xiàn)2∶3群體每個株系10行，每行6株，株行距為20 cm×25 cm，常規(guī)田間管理。抽穗10 d后，每個株系隨機選取中間兩行各4株，每株上取主莖劍葉1片，測定劍葉長、寬(劍葉最寬處的寬度)；取8片劍葉的平均值進行數(shù)據(jù)分析。群體植株成熟后，根據(jù)Zhang等[21]的方法挑選籽粒飽滿的種子，利用SC-G型萬深考種儀(杭州萬深檢測科技有限公司)測定粒長、粒寬、千粒重，每個株系重復3次，取平均值作為各株系的表型值。籽粒長寬比等于粒長除以粒寬。

1.4 QTL定位

利用Mapmarker/Exp3.0軟件[22]進行連鎖分析，采用Kosambi函數(shù)將標記間的重組率轉(zhuǎn)換成遺傳圖距(cM)。采用Windows QTL Cartographer 2.5軟件(http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/WQTLCart.htm)的復合區(qū)間作圖法對F2和F2∶3群體進行QTL檢測，確定每個QTL的位置、加性效應和表型貢獻率。QTL閾值設為2.5，檢測可能存在的QTL，QTL命名原則遵循McCouch等[23]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 F2、F2∶3群體及親本粒形和劍葉形態(tài)性狀的表型分析

Z9B、YIL60、F2和F2∶3群體的粒長、粒寬、籽粒長寬比、千粒重、劍葉長、劍葉寬的表型分布見表1、圖3。由表1可知，YIL60的粒長、粒寬、千粒重極顯著大于Z9B，而Z9B的籽粒長寬比、劍葉長、劍葉寬極顯著大于YIL60；雙親間的遺傳差異較大，有利于QTL定位。由表1和圖3可見，F(xiàn)2和F2∶3群體各表型值均表現(xiàn)為連續(xù)變異，且呈連續(xù)的正態(tài)分布，各性狀的偏度系數(shù)和峰度系數(shù)均小于1，呈數(shù)量性狀的遺傳特點，符合QTL區(qū)間作圖的要求。

注：a: bar=30 cm; b： 粒形, bar=1 cm； c：劍葉形態(tài)性狀，bar=4 cm。Note: a: bar=30 cm. b: Grain shape, bar=1 cm. c: Flag leaf morphology, bar=4 cm.圖1 親本中9B與YIL60株型Fig.1 Plant type of Z9B and YIL60

2.2 F2和F2∶3群體各性狀間的相關分析

對Z9B/YIL60的F2和F2∶3群體粒形和劍葉形態(tài)性狀間的相關分析表明，部分性狀間存在顯著或極顯著的相關性(表2)。其中粒長與粒寬、籽粒長寬比、千粒重在F2、F2∶3群體中均呈極顯著正相關；粒寬與千粒重在F2、F2∶3群體中呈極顯著正相關，而與籽粒長寬比在F2、F2∶3群體中呈極顯著負相關；籽粒長寬比與千

表1 親本、F2和F2∶3群體粒形和劍葉形態(tài)性狀的表型值Table 1 Phenotype values of grain shape and flag leaf traits in the F2 and F2∶3populations and their parents

表2 Z9B/YIL60 F2與F2∶3群體粒形和劍葉形態(tài)性狀的相關系數(shù)Table 2 Correlation coefficients among agronomic traits in F2 and F2∶3 population of Z9B/YIL60

注：實心符號表示F2群體；空心符號表示F2∶3群體；染色體上黑色為滲入片段。Note: Solid symbols indicated F2 population, hollow symbols indicated F2∶3 population, the black on the chromosome is the introgression fragment.圖2 F2、F2∶3群體中檢測到的控制水稻粒形和劍葉形態(tài)性狀的QTL在染色體上的分布Fig.2 Distribution of QTLs for grain shape and flag leaf traits detected in F2 and F2∶3 populations

圖3 Z9B/YIL60 F2與F2∶3群體粒形和劍葉形態(tài)性狀表型頻率分布Fig.3 Phenotypic frequency distribution of grain shape and flag leaf traits in F2 and F2∶3 populations of Z9B/YIL60

粒重、劍葉寬在F2∶3群體中呈顯著和極顯著負相關；F2群體中粒長與劍葉長之間呈極顯著正相關，與劍葉寬呈顯著正相關；千粒重與劍葉長、劍葉寬在F2群體中均呈極顯著正相關，千粒重與劍葉寬在F2∶3群體中呈顯著正相關；劍葉長與劍葉寬在F2、F2∶3群體中均呈極顯著正相關。

2.3 F2和F2∶3群體粒形和劍葉形態(tài)性狀的QTL定位

利用Win QTL cartographer 2.5軟件進行QTL符合區(qū)間作圖法分析，在Z9B/YIL60構建的F2和F2∶3群體中共檢測到16個控制粒形和劍葉形態(tài)性狀的QTL，分布于第1、第6、第7、第10和第11號染色體上(表3和圖2)，LOD值介于2.77～13.25，可解釋的表型貢獻率為2.25%～25.64%。共檢測到9個控制粒形性狀的QTL，分別位于第1、第6和第7染色體的4個染色體區(qū)域，可解釋的表型貢獻率介于2.25%～25.64%。其中控制粒長的QTL有2個(qGL6和qGL7)，分別在F2∶3和F2群體中被檢測到，位于第6和第7染色體的RM1369-RM6775和RM3859-RM3394區(qū)間，表型貢獻率分別為7.77%和5.75%，增效等位基因均來自YIL60。控制粒寬的QTL有3個(qGW1、qGW7-1、qGW7-2)，分別位于第1、第7和第7染色體的RM1329-RM8068、RM11-RM542和RM3859-RM3394區(qū)間，可解釋的表型貢獻率介于2.25%～18.70%，其中qGW7-1在F2和F2∶3群體中均被檢測到，除qGW1增效等位基因來自Z9B，其余2個QTL增效等位基因均來自YIL60?？刂谱蚜ｉL寬比的QTL有2個(qLWR1、qLWR7)，分別位于第1和第7染色體的RM1329-RM8068和RM3859-RM3394區(qū)間，可解釋的表型貢獻率為3.14%和11.33%，增效等位基因分別來自YIL60和Z9B?？刂魄ЯＶ氐腝TL有2個，為qTGW6、qTGW7，分別位于第6和第7染色體的RM1369-RM6775和RM3859-RM3394區(qū)間，表型貢獻率為7.40%～25.64%，增效等位基因均來自YIL60，其中qTGW7在F2和F2∶3群體中均被檢測到，可解釋的表型貢獻率為7.40%和17.10%。

控制劍葉形態(tài)性狀的QTL有7個，分別位于第1、第6、第10和第11號染色體上，貢獻率為2.56%～16.35%。其中檢測到1個劍葉長QTL，位于第10號染色體RM25366-RM216區(qū)間，在F2和F2∶3群體中均被檢測到，可解釋的表型貢獻率為7.35%和7.12%，加性效應均來自于Z9B。檢測到6個控制劍葉寬的QTL，分別位于第1、第6、第10和第11號染色體上，表型貢獻率介于2.56%～16.35%，其中qFLW10在F2和F2∶3群體中均被檢測到，可解釋的表型貢獻率為5.24%和10.40%，增效等位基因來自Z9B；qFLW6和qFLW11僅在F2群體中被檢測到，增效等位基因分別來自Z9B和YIL60；而qFLW1、qFLW11-1、qFLW11-2和qFLW11-3僅在F2∶3群體中被檢測到，除qFLW1增效等位基因來自Z9B，其余3個QTL增效等位基因均來自YIL60。

3 討論

水稻粒形和劍葉形態(tài)性狀是重要的農(nóng)藝性狀，也是育種的主要目標性狀，與水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)密切相關，探究水稻粒形和劍葉形態(tài)的遺傳基礎對提高水稻產(chǎn)量和改善稻米品質(zhì)具有重要意義。目前定位和克隆的粒形和劍葉QTL大部分都來源于亞洲栽培稻。獨立起源和馴化的非洲栽培稻含有大量可以用于改良亞洲栽培稻的優(yōu)良基因[24]。因此，本研究利用粒形和劍葉形態(tài)性狀差異明顯的秈稻Z9B和非洲栽培稻滲入系YIL60作為親本構建的F2和F2∶3群體為供試材料，對粒形和劍葉形態(tài)性狀進行QTL定位，共檢測到16個QTL，包括9個粒形性狀相關的QTL和7個劍葉形態(tài)性狀的QTL。其中粒寬QTL-qGW7-1、劍葉長QTL-qFLL10、劍葉寬QTL-qFLW10、千粒重QTL-qTGW7在F2和F2∶3群體中被重復檢測到。

目前已有許多關于水稻粒形和劍葉形態(tài)QTL的相關報道，與前人定位結(jié)果相比，本研究檢測到的部分QTL與前人定位的區(qū)間相近或者一致。如本研究在第7染色體RM3859-RM3394區(qū)間檢測到同時控制粒長、粒寬、籽粒長寬比和千粒重的QTL，對表型變異的貢獻率介于5.75%～17.10%之間，是一個主效QTL位點，其增效等位基因均來自非洲栽培稻基因滲入系

表3 Z9B/YIL60 F2與F2∶3群體檢測到的粒形和劍葉形態(tài)性狀QTL分布情況Table 3 QTL distributions of yield related traits detected in the F2 and F2∶3 population of Z9B/YIL60

YIL60。王小雷等[25]利用越光/昌恢121染色體片段置換系群體在相同區(qū)間檢測到一個控制粒長的QTL；鄒德堂等[26]利用東農(nóng)425/長白10衍生的F2∶3群體在相同區(qū)間也檢測到一個控制粒長的QTL；該區(qū)間尚未有粒形QTL或基因克隆的報道，值得進一步深入研究。本研究定位在第7號染色體上的qGL7-1與鄒德堂等[26]定位的qGL7-2區(qū)間重疊，與已克隆的GLW7[27]和GL7[14]/GW7[15]基因分別位于相同和相鄰區(qū)間。定位在第10號染色體上的qFLW10與李睿等[28]定位到的qFLW10-1位于相鄰區(qū)間。定位在第11號染色體上的qFLW11-1與周勇等[29]利用日本晴/廣陸矮4號染色體片段代換系群體定位到的qFLW11位于臨近區(qū)間，Cai等[30]也在相鄰區(qū)間檢測到控制葉寬的QTL。這些在不同研究中利用不同遺傳群體重復定位到的QTL，能穩(wěn)定遺傳且貢獻率較高，有必要進行進一步精細定位和圖位克隆。

粒形或劍葉形態(tài)性狀QTL定位在同一染色體的相同或相鄰區(qū)域，這可能是一因多效或者相關性狀QTL緊密連鎖的結(jié)果[31-33]。本研究在第7號染色體RM3859-RM3394區(qū)間檢測到同時控制粒長、粒寬、籽粒長寬比和千粒重的QTL；在第6號染色體RM1369-RM6775區(qū)間檢測到同時控制粒長和千粒重的QTL；在第10號染色體RM25366-RM216區(qū)間檢測到同時控制劍葉長和劍葉寬的QTL；表明劍葉長與寬、粒形性狀之間存在緊密的相關性，這與相關性分析結(jié)果相一致。另外，本研究在F2和F2∶3群體分別檢測一個劍葉寬QTL與RM202緊密連鎖，沈波等[34]檢測到同時控制劍葉長和劍葉長寬比的QTL與RM202緊密連鎖，這可能由相關性狀QTL緊密連鎖造成。

與亞洲栽培稻相比，非洲栽培稻具有許多優(yōu)良特性，如生物和非生物脅迫抗性強、適應性強、光合吸收利用效率高、耐高溫。本研究在F2和F2∶3群體中重復檢測到qGW7-1和qTGW7，可解釋的表型貢獻率高達18.70%和17.10%，增效等位基因均來自非洲栽培稻基因滲入系YIL60，為控制粒寬和千粒重的主效QTL位點。其中，qGW7-1所在染色體區(qū)域包含已克隆粒形基因GLW7，位于已克隆基因GL7/GW7相鄰區(qū)間；而qTGW7所在染色體區(qū)域尚未有粒形相關基因克隆的報道，為進一步精細定位、克隆該基因和應用于分子標記輔助育種奠定了基礎。

4 結(jié)論

本研究利用輪回親本Z9B與非洲栽培稻基因滲入系YIL60雜交構建的F2和F2∶3群體，對粒形和劍葉形態(tài)性狀進行QTL分析，共檢測到16個控制粒形和劍葉形態(tài)性狀的QTL，分布于第1、第6、第7、第10和第11號染色體上的7個染色體區(qū)域，LOD值介于2.77～13.25，可解釋的表型貢獻率介于2.25%～25.64%，其中qGW7-1、qFLL10、qFLW10和qTGW7在F2和F2∶3群體中被重復檢測到，qTGW7為新鑒定的QTL位點。這些結(jié)果可用于進一步開展粒形、劍葉形態(tài)性狀基因的精細定位、克隆和發(fā)掘非洲栽培稻有利基因等研究。