電解水對蕎麥芽酚酸含量及抗氧化能力的影響

劉 瑞 于章龍 孫元琳 王 慧 李云龍 周素梅

(1 運(yùn)城學(xué)院生命科學(xué)系/特色農(nóng)產(chǎn)品加工山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 運(yùn)城 044000；2 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花研究所，山西 運(yùn)城 044000；3 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)山西功能食品研究院，山西 太原 030031；4 北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院，北京 100048)

我國是蕎麥種植及生產(chǎn)大國，栽培品種主要有苦蕎和甜蕎，分別可稱為韃靼蕎麥和普通蕎麥[1]。蕎麥作為一種藥食同源植物，含有豐富的蛋白質(zhì)[2]、不飽和脂肪酸[3]、D-手性肌醇[4]、抗性淀粉[5]和多酚類[1]等活性成分。研究表明，可食性種子萌發(fā)后其營養(yǎng)價值和功能顯著提升[6-7]，因而發(fā)芽食品得到消費(fèi)者越來越多的關(guān)注和認(rèn)可。但種子在發(fā)芽過程中易受到微生物污染，嚴(yán)重影響發(fā)芽食品的產(chǎn)量和品質(zhì)。

電解水作為一種高效、安全、無污染無殘留且制取方便、價格低廉的殺菌劑，在解決芽苗菜生產(chǎn)中的保鮮問題方面，相比傳統(tǒng)殺菌劑具有很多優(yōu)勢。據(jù)報道，電解水不僅可以降低芽苗菜表面微生物數(shù)量，還可提升芽苗菜營養(yǎng)成分含量，如超聲波輔助酸性電解水處理綠豆芽可以顯著降低綠豆芽表面的微生物數(shù)量[8]；堿性電解水前處理可以顯著提高酸性電解水對黃豆、綠豆、苜蓿、蘿卜、糙米等種子的殺菌效果[9-10]。適宜理化指標(biāo)的電解水可表現(xiàn)出對發(fā)芽谷物的生長促進(jìn)作用，主要是由于電解水中含有活性氧成分，激發(fā)了種子內(nèi)部的抗氧化酶系活力，調(diào)控了植物激素水平[11-12]。微酸性電解水有利于發(fā)芽糙米[10]、發(fā)芽蕎麥[13]中γ-氨基丁酸的積累。使用微酸性電解水制備高活性成分發(fā)芽蕎麥有助于其還原糖含量和蘆丁含量的增加[9]。

目前，發(fā)芽蕎麥中酚酸富集技術(shù)缺乏相關(guān)研究，基于電解水在種子、芽苗消毒及活性成分富集方面的應(yīng)用研究，使用電解水制備高活性成分發(fā)芽蕎麥具有可行性。本研究采用電解水制備蕎麥芽，考察不同理化指標(biāo)電解水處理后，蕎麥發(fā)芽率、芽長、總酚含量、2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH)自由基清除能力、2,2-聯(lián)氮雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽[2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid ammonium salt)，ABTS]自由基清除能力和鐵離子還原力隨時間的動態(tài)變化情況。另外考慮到蔬菜中酚酸的測定多是通過傳統(tǒng)方法直接提取分析，只得到游離型酚酸含量的測定結(jié)果，而蔬菜中的酚酸多以結(jié)合形式存在，因此本研究進(jìn)一步對發(fā)芽7 d蕎麥芽的游離酚和結(jié)合酚的種類及含量進(jìn)行研究，以期更全面地解釋發(fā)芽蕎麥的營養(yǎng)價值，為電解水應(yīng)用于發(fā)芽蕎麥功能食品的制備提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.2 儀器與設(shè)備

XY-L-150電解水生成器，寶雞新宇光機(jī)電有限責(zé)任公司；pH/ORP計(jì)，杭州奧立龍儀器有限公司；HWS-160恒溫恒濕培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；KQ300DE超聲波清洗機(jī)，昆山舒美超聲儀器有限公司；TGL-16M冷凍高速離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；Scient2-ND真空冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；AcquityTM超高效液相色譜儀-TQS串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國Waters公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 電解水的制備 強(qiáng)酸性電解水和強(qiáng)堿性電解水通過在XY-L-150電解水生成器中電解16 g·L-1NaCl溶液，由機(jī)器出水口直接獲?。晃⑺嵝噪娊馑ㄟ^在自制電解槽中電解15 mmol·L-1HCl溶液獲得；弱堿性電解水是在強(qiáng)堿性電解水基礎(chǔ)上通過稀釋調(diào)節(jié)pH值得到試驗(yàn)用電解水均盛放于深色密閉容器中，并于制備后盡快用完。電解水的有效氯濃度用碘量法測定[14]。電解水理化指標(biāo)如表1所示。

表1 電解水理化指標(biāo)Table 1 Physicochemical parameters of electrolyzed water

1.3.2 蕎麥芽的制備 準(zhǔn)確稱取30 g蕎麥種子，用相應(yīng)處理液(表1)淋洗5遍，瀝干后將蕎麥種子在相應(yīng)處理液(表1)中以1∶6(g·mL-1)比例浸泡8 h。然后將浸泡好的種子置于底部有孔的發(fā)芽盒中于恒溫恒濕培養(yǎng)箱(25℃，濕度85%)中遮光發(fā)芽。發(fā)芽期間，每日用處理液(表1)淋澆蕎麥芽3次。分別于培養(yǎng)第1、第3、第5、第7天取樣進(jìn)行真空冷凍干燥，磨粉冷藏備用。

1.3.3 發(fā)芽率和芽長的測定 培養(yǎng)18～67 h(從蕎麥種子浸泡之后放進(jìn)培養(yǎng)箱起計(jì)時)，定期統(tǒng)計(jì)各處理組發(fā)芽率，冒有白尖的蕎麥種子即認(rèn)為已發(fā)芽。在培養(yǎng)蕎麥芽83～167 h內(nèi)，每日從各處理組隨機(jī)抽取30根蕎麥芽用直尺測量其芽長，統(tǒng)計(jì)其平均值。

1.3.4 蕎麥芽樣品總酚含量的測定 將蕎麥芽凍干粉與50%乙醇溶液以1∶50(w∶v)的比例混勻，于超聲波清洗器中60 kHz，25℃處理30 min，然后于4 800 r·min-1離心15 min，上清液用于總酚含量測定。蕎麥芽樣品中總酚含量采用Folin-Ciocalteu法[15]測定。用沒食子酸作標(biāo)準(zhǔn)曲線定量測定樣品中總酚含量。擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=0.719x-0.001 (R2=0.997 6)，y為吸光值，x為沒食子酸質(zhì)量濃度(mg·mL-1)。

1.3.5 蕎麥芽樣品DPPH自由基清除能力的測定 樣品前處理同1.3.4，蕎麥芽樣品DPPH自由基清除能力的測定參考文獻(xiàn)[16]。用Trolox溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線定量測定樣品DPPH自由基清除能力，即待測樣品DPPH自由基清除能力用Trolox當(dāng)量值來表示。擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=78.01x+13.16 (R2=0.996 2)，y為DPPH自由基清除率(%)，x為Trolox濃度(mmol·L-1)。

1.3.6 蕎麥芽樣品ABTS自由基清除能力的測定 樣品前處理同1.3.4，蕎麥芽樣品ABTS自由基清除能力的測定參考文獻(xiàn)[17]。用Trolox溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線定量測定樣品ABTS自由基清除能力，即待測樣品ABTS自由基清除能力用Trolox當(dāng)量值來表示。擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=44.91x-3.15 (R2=0.997 1)，y為ABTS自由基清除率(%)，x為Trolox濃度(mmol·L-1)。

1.3.7 蕎麥芽樣品鐵離子還原能力的測定 樣品前處理同1.3.4，蕎麥芽樣品鐵離子還原能力的測定參考文獻(xiàn)[18]。用Trolox溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線定量測定樣品鐵離子還原能力，即待測樣品鐵離子還原能力用Trolox當(dāng)量值來表示。擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.386 4x+0.247 3 (R2=0.998 2)，y為鐵離子還原能力(△A)，x為Trolox濃度(mmol·L-1)。

綜上所述，急性左心衰病人減少急診留置時間，盡早進(jìn)行?？埔?guī)范化治療，可顯著縮短病程，降低死亡率和減輕病人醫(yī)療負(fù)擔(dān)。

1.3.8 蕎麥芽樣品游離酚和結(jié)合酚含量的測定 蕎麥芽樣品游離態(tài)和結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)的提取與測定參照文獻(xiàn)[19-20]。色譜條件：Waters HSS T3色譜柱(150 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流動相A為0.1%甲酸，B相為乙腈(含0.1%甲酸)；梯度洗脫：0～0.5 min，95%A，5%B；0.5～5 min，95%A，5%B；5～9.5 min，70%A，30%B；9.5～9.75 min，10%A，90%B；9.75～12 min，95%A，5%B。流速0.3 mL·min-1；柱溫40℃；進(jìn)樣量5 μL。質(zhì)譜條件：電離源模式為電噴霧離子化，采用多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM)模式進(jìn)行檢測；負(fù)離子模式掃描；霧化氣為氮?dú)?；碰撞?高純氬氣)流速0.13 mL·min-1；離子源溫度150℃；脫溶劑氣溫度500℃；脫溶劑氣流量1 000 L·h-1。

1.4 數(shù)據(jù)分析

除芽長測定取30根蕎麥芽量取長度求平均以外，其余試驗(yàn)均重復(fù)3次，并用SPSS 22.0中的Duncan方差分析比較處理組間的差異顯著性，差異顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 電解水對蕎麥發(fā)芽率的影響

由圖1可知，在36～67 h的觀測時間內(nèi)，電解水對蕎麥種子發(fā)芽具有一定的促進(jìn)作用，且酸性電解水對蕎麥種子發(fā)芽的促進(jìn)作用優(yōu)于堿性電解水。pH值5.02時，有效氯濃度22.85 mg·L-1的酸性電解水處理組蕎麥種子在培養(yǎng)至67 h時發(fā)芽率達(dá)到98%，比自來水處理組發(fā)芽率提高16個百分點(diǎn)。

圖1 電解水對蕎麥發(fā)芽率的影響Fig.1 Effect of electrolyzed water on the germination rate of buckwheat seeds

前人研究表明，電解水(pH值2.5～6.0，有效氧濃度30 mg·L-1)相比自來水而言，能夠促進(jìn)蕎麥種子的萌發(fā)[21]。將蕎麥種子浸泡于pH值5.5、有效氯濃度為10～60 mg·L-1的微酸性電解水中也能促進(jìn)蕎麥種子萌發(fā)[22]。本研究結(jié)果表明，除酸性電解水外，堿性電解水也表現(xiàn)出對蕎麥種子萌發(fā)的促進(jìn)作用。這可能是由于酸性電解水的氧化還原電位較高，且含有HClO、ClO-和Cl2等有效氯成分[23]，而堿性電解水具有相對較低的氧化還原電位和較高的pH值，具有一定殺菌作用，從而為種子的萌發(fā)提供了良好的環(huán)境條件，且可以提高種子中淀粉酶、蛋白酶、植酸酶、脂肪酶等多種酶活性，促進(jìn)發(fā)芽[24]。

2.2 電解水對蕎麥芽長的影響

由圖2可知，在觀測期間內(nèi)，酸性電解水對蕎麥芽的生長表現(xiàn)出更為明顯的促進(jìn)作用，如pH值3.21和pH值5.02的酸性電解水處理組蕎麥芽在發(fā)芽167 h時，芽長分別為8.73和8.58 cm，比自來水對照組分別高出54.05和51.40個百分點(diǎn)(圖2)。

前人研究表明，相比自來水而言，無論是在浸泡階段還是淋澆階段使用微酸性電解水處理蕎麥種子，均能促進(jìn)蕎麥芽的生長[21]。同類研究也表明，微酸性電解水還可以促進(jìn)綠豆芽、黃豆芽和發(fā)芽糙米的生長[10,25-26]。且研究已證實(shí)微酸性電解水促進(jìn)綠豆芽的生長與電解水對于綠豆芽抗氧化酶系活性的調(diào)節(jié)有關(guān)，酸性電解水中所含有的活性氧成分有利于促進(jìn)芽苗的生長[11]。

圖2 電解水對蕎麥芽長的影響Fig.2 Effect of electrolyzed water on the length of buckwheat sprouts

圖3 各處理組蕎麥芽照片F(xiàn)ig.3 The photograph of buckwheat sprouts of each treatment

2.3 電解水對蕎麥發(fā)芽期間總酚含量的影響

由圖4可知，EW11堿性電解水處理組蕎麥芽在發(fā)芽第1天總酚含量達(dá)到較高水平，為31.99 mg·g-1， 后期該處理組蕎麥芽總酚含量有所降低，維持在穩(wěn)定水平。其余處理組蕎麥芽總酚含量均隨發(fā)芽時間延長而增加。酸性電解水處理組蕎麥在發(fā)芽3～7 d時，其總酚含量均高于自來水對照組。到發(fā)芽第7天，pH值5.02處理組蕎麥芽總酚含量為38.29 mg·g-1，顯著高于對照組(P<0.05)。

當(dāng)植物體處于逆境脅迫時，會激發(fā)體內(nèi)苯基丙酸類物質(zhì)代謝路徑的酶活性，包括苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonialyase，PAL)等，這會導(dǎo)致植物體內(nèi)酚類化合物的積累[27]。電解水與自來水的理化指標(biāo)不同，因此用電解水處理蕎麥芽，會使蕎麥芽體內(nèi)發(fā)生相應(yīng)的脅迫應(yīng)激反應(yīng)，從而產(chǎn)生更多的酚類物質(zhì)以抵御環(huán)境對機(jī)體造成的損傷[28]，因而電解水處理有利于蕎麥芽酚類物質(zhì)的積累。前人研究表明，相比自來水對照，有效氯濃度為10～30 mg·L-1的微酸性電解水促進(jìn)了發(fā)芽第7天蕎麥芽總酚的積累[1]。但目前缺少堿性電解水對蕎麥發(fā)芽期間總酚含量的影響研究。本研究結(jié)果表明，在1～7 d的觀測期內(nèi)，pH值11.13的強(qiáng)堿性電解水有利于發(fā)芽早期蕎麥芽總酚的積累，而在發(fā)芽后期，酸性電解水和弱堿性電解水均表現(xiàn)出對蕎麥芽總酚積累的促進(jìn)作用。

注：不同小寫字母表示同一時間不同處理間差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Different lowercase letters in the same day indicate significant differences among treatments at 0.05 level. The same as following.圖4 電解水對蕎麥芽總酚含量的影響Fig.4 Effect of electrolyzed water on the content of total phenols of buckwheat sprouts

2.4 電解水對蕎麥發(fā)芽期間DPPH自由基清除能力的影響

由圖5可知，pH值11.13的堿性電解水處理組蕎麥芽在發(fā)芽第1天，其DPPH自由基清除能力達(dá)到較高水平，為105.9 μmol Trolox·g-1，但后期有所降低，并維持穩(wěn)定。其余處理組蕎麥芽在發(fā)芽期間的DPPH自由基清除能力均隨發(fā)芽時間延長而增強(qiáng)。自發(fā)芽第3天始，酸性電解水處理組蕎麥芽的DPPH自由基清除能力均顯著高于對照組(P<0.05)。到發(fā)芽第7天，除了pH值11.13處理組之外，其余電解水處理組蕎麥芽的DPPH自由基清除能力均顯著高于對照組(P<0.05)。

圖5 電解水對蕎麥芽DPPH自由基清除能力的影響Fig.5 Effect of electrolyzed water on the DPPH free radical scavenging capacity of buckwheat sprouts

2.5 電解水對蕎麥發(fā)芽期間ABTS自由基清除能力的影響

由圖6可知，pH值11.13堿性電解水處理組蕎麥芽在發(fā)芽第1天ABTS自由基清除能力達(dá)到較高水平，為27.49 mmol Trolox·100g-1，但后期略有降低。其余各處理組蕎麥芽發(fā)芽期間ABTS自由基清除能力均隨發(fā)芽時間的延長而增強(qiáng)。到發(fā)芽第7天，pH值9.02、5.02、3.21電解水處理組蕎麥芽ABTS自由基清除能力分別為35.03、31.72和28.35 mmol Trolox·100g-1，均顯著高于對照組(P<0.05)。

圖6 電解水對蕎麥芽ABTS自由基清除能力的影響Fig.6 Effect of electrolyzed water on the ABTS free radical scavenging capacity of buckwheat sprouts

2.6 電解水對蕎麥發(fā)芽期間鐵離子還原能力的影響

由圖7可知，pH值11.13堿性電解水處理組蕎麥芽鐵離子還原力在發(fā)芽第1～第5天均顯著高于其余處理組(P<0.05)。除pH值11.13堿性電解水以外的處理組蕎麥芽隨發(fā)芽時間的延長，其鐵離子還原力呈上升趨勢。到發(fā)芽第7天，pH值9.02、5.02和3.21電解水處理組蕎麥芽鐵離子還原能力分別為27.56、27.34和28.45 mmol Trolox·100g-1，均顯著高于對照組(P<0.05)。

2.7 電解水對蕎麥芽結(jié)合酚和游離酚含量的影響

由表2可知，蕎麥芽中含量較多的游離酚為綠原酸和表兒茶素。自來水處理組蕎麥芽中對香豆酸含量顯著高于電解水處理組(P<0.05)，然而對于檢測到的其他主要游離酚，包括綠原酸、表兒茶素、咖啡酸、沒食子酸、原兒茶酸、2,5-二羥基苯甲酸和4-羥基苯甲酸，其含量均為自來水處理組顯著低于電解水處理組(P<0.05)。 綠原酸是蕎麥芽中含量最高的游離酚，各處理組蕎麥芽綠原酸含量由高到低排序依次為：pH值9.02堿性電解水處理組>pH值3.21酸性電解水處理組>pH值5.02酸性電解水處理組>pH值11.13堿性電解水處理組>自來水處理組。

圖7 電解水對蕎麥芽鐵離子還原能力的影響Fig.7 Effect of electrolyzed water on the ferric ion reducing antioxidant power of buckwheat sprouts

表2 電解水對蕎麥芽中游離酚含量的影響Table 2 Effect of electrolyzed water on the soluble phenolic compounds of buckwheat sprouts /(mg·kg-1)

由表3可知，自來水處理組與電解水處理組蕎麥芽含量最多的結(jié)合酚種類不同，即對香豆酸是自來水處理組蕎麥芽含量最多的結(jié)合酚且顯著高于電解水處理組(P<0.05)。而咖啡酸是電解水處理組蕎麥芽中含量最多的結(jié)合酚且顯著高于自來水處理組(P<0.05)，不同電解水處理組蕎麥芽咖啡酸含量由高到低排序依次為：pH值9.02堿性電解水處理組>pH值3.21酸性電解水處理組>pH值5.02酸性電解水處理組>pH值11.13堿性電解水處理組。對于檢測到的蕎麥芽中的主要結(jié)合酚，包括阿魏酸、咖啡酸、沒食子酸、香草酸、原兒茶酸、4-羥基苯甲酸和丁香酸，其含量均為pH值3.02和pH值 9.02電解水處理組顯著高于對照組(P<0.05)。

3 討論

本研究采用DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和鐵離子還原能力來評價不同處理組蕎麥發(fā)芽期間的抗氧化水平變化情況，這三種體外抗氧化活性評價方法大體呈現(xiàn)出一致的結(jié)果。這主要是由于抗氧化活性評價方法的化學(xué)本質(zhì)相同，即基于物質(zhì)的氧化還原特性[29]，另一方面，綜合圖4～7可知，蕎麥發(fā)芽期間的抗氧化水平與其總酚含量具有一致的變化規(guī)律。這是由于發(fā)芽期間抗氧化活性主要源于芽苗

表3 電解水對蕎麥芽中結(jié)合酚含量的影響Table 3 Effect of electrolyzed water on the bound phenolic compounds of buckwheat sprouts /(mg·kg-1)

中產(chǎn)生的還原性物質(zhì)，例如酚類等[30]。且前人研究表明，電解水處理組發(fā)芽第7天的苦蕎芽、甜蕎芽總酚含量與苦蕎芽DPPH自由基清除能力和鐵離子還原力等均比對照組顯著提升，且總酚含量與抗氧化活性呈正相關(guān)(P<0.01)[1，31]。

谷物作為膳食多酚的重要來源之一，其多酚含量與果蔬相當(dāng)。酚酸能夠提高植物的抗逆性，可在非生物脅迫條件下大量積累[32]。本研究中不同pH值的電解水處理組第7天蕎麥芽中含量最多的游離酚酸和結(jié)合酚酸分別為綠原酸和咖啡酸，其含量均顯著高于自來水對照組(P<0.05)。酚酸類物質(zhì)具有抗氧化、抗癌等多種生物活性。例如，咖啡酸具有較強(qiáng)的DPPH自由基、ABTS自由基清除能力和鐵離子還原能力，并極顯著高于食品抗氧化劑二丁基羥基甲苯(butylated hydroxy, BHT)[33]。綠原酸和咖啡酸可以調(diào)節(jié)脂類代謝，具有抗肥胖作用[33]。綠原酸可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，降低抗癌藥物不良反應(yīng)等作用[34]。因此，基于電解水技術(shù)富集蕎麥芽酚酸，可為相關(guān)功能食品研發(fā)提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

電解水對蕎麥種子發(fā)芽及生長均有一定的促進(jìn)作用。綜合本研究所采用的3種抗氧化能力評價方法，在1～7 d的發(fā)芽觀測期內(nèi)，pH值11.13電解水處理組發(fā)芽1～3 d蕎麥芽總酚含量和抗氧化能力均顯著高于對照組(P<0.05)，其余處理組蕎麥芽總酚含量及抗氧化能力均隨發(fā)芽時間延長而提升，且發(fā)芽5～7 d，pH值3.21、pH值5.02和pH值9.02電解水處理組蕎麥芽總酚含量和抗氧化能力均顯著高于對照組(P<0.05)。通過進(jìn)一步探究發(fā)芽第7天各處理組蕎麥芽中的結(jié)合酚酸和游離酚酸的種類和含量，發(fā)現(xiàn)綠原酸是各處理組蕎麥芽中含量最多的游離酚酸，自來水、電解水處理組蕎麥芽中含量最多的結(jié)合酚酸分別為對香豆酸和咖啡酸?？傮w而言，電解水處理有利于蕎麥芽中主要酚酸的富集。