獼猴桃AcbHLH137功能鑒定及對(duì)淀粉降解基因AcBAM3轉(zhuǎn)錄激活分析

劉 璐 王 康 韓一璐 楊民杰 陳 偉 曹士鋒 施麗愉

(浙江萬(wàn)里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100)

淀粉(C6H10O5)n是植物中最重要的多糖類物質(zhì)，由α-1，4糖苷鍵和α-1，6糖苷鍵連接形成的葡萄糖分子聚合而成，可依據(jù)所含葡萄糖分子的數(shù)目以及是否可溶分為直鏈淀粉和支鏈淀粉[1-2]。果實(shí)的細(xì)胞中充斥著大量的淀粉，可以起到維持細(xì)胞膨壓，保持果實(shí)硬度的作用[3-4]。未成熟的香蕉、蘋(píng)果、獼猴桃等果實(shí)含有大量淀粉[5-6]。淀粉酶在獼猴桃果實(shí)采后階段起著關(guān)鍵作用，此時(shí)淀粉會(huì)被降解，果實(shí)細(xì)胞的支持力減弱，果實(shí)硬度也急速下降[7-9]。獼猴桃果實(shí)富含大量淀粉，果實(shí)后熟軟化與淀粉降解存在密切的關(guān)系，且降解后的淀粉會(huì)轉(zhuǎn)化為可溶性糖，提高果實(shí)的口感[10-11]。

大量研究表明多種酶協(xié)同參與淀粉降解過(guò)程[12-13]。支鏈淀粉上的C6和C3鍵分別受到葡聚糖水合雙激酶(glucan water dikinase，GWD)、磷酸化葡聚糖水合雙激酶(phosphoglucan water dikinase，PWD)的催化，發(fā)生磷酸化反應(yīng)，導(dǎo)致淀粉粒結(jié)構(gòu)松散[14-15]。松散的淀粉粒在異淀粉酶(isoamylase，ISA)的催化下分解為可溶線性葡聚糖分子，再由β-淀粉酶(β-amylase， BAM)催化水解生成麥芽糖。BAM主要在果實(shí)發(fā)育后期及后熟過(guò)程中發(fā)揮功能。Maria等[16]發(fā)現(xiàn)在櫻桃番茄的后期發(fā)育和成熟過(guò)程中，BAM活性增強(qiáng)，該編碼基因的轉(zhuǎn)錄豐度增加，導(dǎo)致櫻桃番茄中淀粉消耗及可溶性固形物含量增加。在獼猴桃果實(shí)后熟過(guò)程中，淀粉迅速降解，BAM基因的表達(dá)量顯著上調(diào)[17]。在香蕉果實(shí)成熟的整個(gè)過(guò)程中BAM基因的表達(dá)增加[18]。此外，蕭允藝[19]研究發(fā)現(xiàn)香蕉果實(shí)中的MaBAM1、MaBAM2、MaBAM3、MaBAM4、MaBAM6、MaBAM8、MaBAM10受乙烯誘導(dǎo)表達(dá)量增加。因此，BAM在果實(shí)采后淀粉降解過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

研究發(fā)現(xiàn)，植物淀粉降解受到轉(zhuǎn)錄因子的直接調(diào)控[20-22]。Wang等[23]研究發(fā)現(xiàn)，microRNA可以介導(dǎo)獼猴桃果實(shí)中NAC轉(zhuǎn)錄因子(NAC domain transcription factor)調(diào)控下游靶基因并參與果實(shí)的后熟機(jī)制；乙烯響應(yīng)因子ERF(ethylene response factor)通過(guò)調(diào)控參與獼猴桃果實(shí)細(xì)胞壁降解基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控獼猴桃果實(shí)的成熟衰老[24]。bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族是植物第二大轉(zhuǎn)錄因子超家族，廣泛存在于動(dòng)植物及微生物中，得名于其保守的bHLH結(jié)構(gòu)域。bHLH結(jié)構(gòu)域由2個(gè)功能不同的區(qū)域組成，約含60個(gè)氨基酸，即長(zhǎng)度為15～17個(gè)氨基酸的堿性區(qū)(basic)和長(zhǎng)度約為40個(gè)氨基酸的螺旋-環(huán)-螺旋區(qū)(HLH)[25-26]。位于bHLH結(jié)構(gòu)域N端的堿性區(qū)具有結(jié)合目的DNA的功能；C端的HLH區(qū)含有2個(gè)相鄰的α螺旋。相同或不同bHLH轉(zhuǎn)錄因子的2個(gè)α螺旋可以相互作用形成同源或異源二聚體，該二聚體正是bHLH行使功能的關(guān)鍵[26-27]。蕭允藝[19]在香蕉果實(shí)中發(fā)現(xiàn)，MabHLH6轉(zhuǎn)錄因子可以激活MaBAM2、MaBAM8、MaBAM10的啟動(dòng)子活性，促進(jìn)這些BAM基因的表達(dá)，從而促進(jìn)淀粉的降解。

陳景丹等[28]研究發(fā)現(xiàn)，淀粉的降解是導(dǎo)致獼猴桃果實(shí)軟化的重要原因之一，而AcBAM3是獼猴桃果實(shí)采后淀粉降解的關(guān)鍵基因。有研究報(bào)道C2H2型鋅指蛋白AdDof3可顯著轉(zhuǎn)錄激活獼猴桃β-淀粉酶編碼基因AdBAM3啟動(dòng)子并促進(jìn)獼猴桃淀粉的降解[24,29]。但有關(guān)bHLH轉(zhuǎn)錄因子對(duì)獼猴桃果實(shí)淀粉降解的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究從獼猴桃中克隆獲得1個(gè)AcbHLH137基因，并對(duì)其進(jìn)行初步的生物信息學(xué)分析，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)分析AcbHLH137基因在獼猴桃果實(shí)不同組織和果實(shí)采后貯藏期間的表達(dá)水平，同時(shí)通過(guò)雙熒光素酶試驗(yàn)研究AcbHLH137轉(zhuǎn)錄因子對(duì)AcBAM3基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，最后利用AcbHLH137在煙草葉片瞬時(shí)過(guò)表達(dá)驗(yàn)證AcbHLH137轉(zhuǎn)錄因子對(duì)NbBAM3基因表達(dá)以及淀粉降解的調(diào)控作用，以期為揭示獼猴桃淀粉降解轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以寧波奉化佳恒農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司種植的6—7年生2倍體青皮紅香獼猴桃(ActinidiachinensisQingpihongxiang)及其不同組織樣品為供試材料。獼猴桃成熟果實(shí)于盛花期后130 d采收，其余組織于盛花期后30 d采集，包括根(直播苗)、莖(長(zhǎng)度約7～8 cm)、葉(嫩葉)、藤、幼果。將所有采集的樣品放入預(yù)冷的袋子中迅速運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室，液氮凍結(jié)取樣，置于 -80℃ 保存。其中，貯藏期間的樣品采后散去田間熱后，挑選大小均一、表面光滑無(wú)破損、相對(duì)成熟度一致(可溶性固形物含量約為7%)的果實(shí)，隨機(jī)選60個(gè)果實(shí)，貯藏于20℃，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。隨機(jī)選取外果肉液氮凍結(jié)，-80℃貯藏，每2 d取樣一次，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 植物組織總RNA的提取及cDNA的合成

選用Omega Plant RNA Kit(50)試劑盒(Omega公司，美國(guó))提取獼猴桃果實(shí)總RNA。由于獼猴桃根、莖、葉組織中富含多糖類物質(zhì)，選擇改進(jìn)的植物總RNA提取試劑盒HiPure Universal RNA Kit(美基公司，廣州)提取獼猴桃果實(shí)組織總RNA。利用NanoDrop2000核酸蛋白儀(Thermo，美國(guó))檢測(cè)總RNA的濃度，采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)總RNA質(zhì)量。利用HiFiScript cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(康為世紀(jì)，北京)將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈。

1.3 獼猴桃AcbHLH137基因克隆

參考本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)獼猴桃果實(shí)不同處理的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，從前期獲得的獼猴桃轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出1個(gè)bHLH家族候選基因CEY00_Acc22104，在NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中對(duì)該基因的氨基酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該序列與獼猴桃果實(shí)中bHLH137(登錄號(hào)：PSR95969.1)序列完全一致，因此將該基因命名為AcbHLH137。利用Oligo7軟件設(shè)計(jì)該基因的克隆引物(表1)。以獲得的獼猴桃cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系10 μL(3.2 μL ddH2O、0.4 μL上游引物、0.4 μL下游引物、1 μL cDNA、5 μL 2x Phanta Max Master Mix)。反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s，61℃退火15 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5 min。通過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證目的條帶大小后進(jìn)行割膠回收，割膠產(chǎn)物與載體PMD18-T連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(DHα105)感受態(tài)細(xì)胞，涂板，次日經(jīng)菌落PCR鑒定陽(yáng)性菌，搖菌提質(zhì)粒送杭州擎科生物測(cè)序。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

從獼猴桃基因組數(shù)據(jù)庫(kù)及NCBI下載并比對(duì)各基因全長(zhǎng)序列，使用Beacon 7軟件對(duì)基因編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)qRT-PCR引物(表1)，以1.2中得到的cDNA為模板，AcActin為內(nèi)參，使用FS Universal SYBR Green Master(Roche，德國(guó))試劑、Step DneplusTM熒光定量PCR儀(ABI，美國(guó))完成，采用2-ΔΔCT方法[30]分析AcbHLH137在獼猴桃不同組織樣品和不同貯藏時(shí)間中的表達(dá)水平，每個(gè)樣品設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.5 AcbHLH137生物信息學(xué)分析

根據(jù)已經(jīng)獲得的AcbHLH137序列，利用在線軟件(Expasy Translate Tool/ProtParam)得到該基因的氨基酸序列并分析該序列的氨基酸特性[31]。通過(guò)NCBI的保守結(jié)構(gòu)域分析程序(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure)進(jìn)行AcbHLH137的保守結(jié)構(gòu)域確定。通過(guò)NCBI-BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)檢索AcbHLH137的同源性物種，不同物種間同源基因的序列比對(duì)使用Clustal X1.83、Gendoc軟件進(jìn)行分析，用鄰接法(neighbor-joining，NJ)結(jié)合MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[32-33]。

1.6 AcbHLH137亞細(xì)胞定位分析

根據(jù)AcbHLH137的開(kāi)放閱讀框(open reading frame，ORF)序列設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的引物(表1)，利用同源重組方法將AcbHLH137基因的ORF序列插入pCAMBIA-1301-GFP載體的NcoⅠ和SpeⅠ區(qū)域，將獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落PCR篩選陽(yáng)性菌并提取質(zhì)粒，獲得綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)與目的基因的融合表達(dá)載體AcbHLH137-GFP[34-35]。

煙草葉片的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化及激光共聚焦顯微觀察：將構(gòu)建好的載體質(zhì)粒采用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài) EHA105，28℃培養(yǎng)2 d；將單菌落從固體培養(yǎng)基挑出接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)8 h，取菌液2 mL接種于20 mL LB液體培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)至OD600為1.0左右；注射煙草下表皮，培養(yǎng)3 d，取樣，在激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察熒光信號(hào)。

1.7 LUC/REN雙熒光素酶試驗(yàn)

將AcbHLH137基因的ORF序列插入到pGreenII 62-SK載體的BamH Ⅰ和HindⅢ兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，將AcBAM3的啟動(dòng)子序列插入到pGreenII 0800-LUC載體的NcoⅠ和Bam HI兩個(gè)酶切位點(diǎn)區(qū)域之間，擴(kuò)增引物見(jiàn)表1。將構(gòu)建好的重組載體CaMV35S-AcbHLH137和AcBAM3pro-LUC/CaMV35S-REN通過(guò)電擊轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(EHA105)感受態(tài)細(xì)胞中，CaMV35S-AcbHLH137作為該試驗(yàn)的效應(yīng)基因(Effector重組載體)，AcBAM3pro-LUC/CaMV35S-REN則作為報(bào)告基因(Reporter重組載體)，且將空載體CaMV35S-Empty作為陰性對(duì)照。效應(yīng)基因(Effector重組載體)與報(bào)告基因(Reporter重組載體)按照8∶1體積比混合注射于本氏煙草葉片背面，將注射后的煙草置于光照培養(yǎng)箱中3 d。取注射區(qū)域直徑1 cm圓片，采用Dual-Luciferase? Reporter Assay System試劑(Promega，美國(guó))和Luminoskan Ascent化學(xué)發(fā)光分析儀(Thermo，美國(guó)) 測(cè)定螢火蟲(chóng)熒光素酶(firefly luciferase，LUC)和海腎熒光素酶(renilla luciferase，REN)的比值(LUC/REN)，每組試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.8 CaMV35S-AcbHLH137瞬時(shí)過(guò)表達(dá)本氏煙草葉片

將1.7中構(gòu)建的CaMV35S-AcbHLH137載體瞬時(shí)注射本氏煙草葉片，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，以注射空載體CaMV35S-Empty作為對(duì)照。將注射的煙草葉片放入60℃的80%乙醇中溫浴脫色8 h，待綠色褪去后，用蒸餾水清洗，置于碘液中2 min，用蒸餾水沖洗直至碘液底色褪去，拍照。參照1.2中的方法提取注射煙草葉片的總RNA，合成cDNA，通過(guò)熒光定量PCR測(cè)定本氏煙草葉片中AcbHLH137和NbBAM3基因的表達(dá)水平。相關(guān)引物見(jiàn)表1。

參考苗紅霞等[36]的方法測(cè)定注射部位的淀粉含量，煙草葉片注射部位液氮凍結(jié)后研磨成粉末取0.05 g，5 mL 80%乙醇勻漿，10 000 r·min-1離心15 min，棄上清液；用5 mL ddH2O勻漿，洗滌沉淀，10 000 r·min-1離心15 min，棄上清液；用2.5 mL 80% Ca(NO3)2溶解，沸水浴10 min，4 000 r·min-1離心4 min，收集上清液。重復(fù)上述操作3次，定容至10 mL，取2 mL提取液加100 μL 0.01 mol·L-1I2-KI于600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。采用100 μg·mL-1可溶性淀粉標(biāo)準(zhǔn)液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)曲線得淀粉含量，設(shè)置3次重復(fù)，結(jié)果以mg·g-1FW表示。

1.9 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

采用GraphPad Prism 7軟件繪圖，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用非配對(duì)T檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 AcbHLH137基因序列與蛋白特征分析

以青皮紅香獼猴桃果實(shí)cDNA為模板，對(duì)AcbHLH137基因進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度約為1 000 bp 的擴(kuò)增片段。測(cè)序結(jié)果表明，AcbHLH137基因的ORF長(zhǎng)度為969 bp。BLAST結(jié)果顯示，該基因序列含有堿性區(qū)(basic)和螺旋-環(huán)-螺旋區(qū)(HLH)，其為bHLH轉(zhuǎn)錄因子特征結(jié)構(gòu)域(圖1)。AcbHLH137基因編碼323個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量為36.27 kDa，等電點(diǎn)(pI)為6.46，不穩(wěn)定系數(shù)為51.68，屬于不

表1 引物序列Table 1 Primers sequences

圖1 AcbHLH137蛋白中HLH結(jié)構(gòu)域分析Fig.1 Analysis of HLH domain in AcbHLH137 protein

穩(wěn)定蛋白質(zhì)。該蛋白的平均疏水系數(shù)為-0.611，屬于親水性蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)AcbHLH137蛋白定位在細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子的功能定位特征相一致。

2.2 AcbHLH137蛋白的氨基酸序列比對(duì)與進(jìn)化樹(shù)分析

對(duì)獼猴桃AcbHLH137基因的ORF序列進(jìn)行NCBI-BLAST分析，發(fā)現(xiàn)AcbHLH137編碼氨基酸序列與茶樹(shù)(CsbHLH137，XP_028125498.1)的氨基酸序列相似率較高，達(dá)到98%。利用Clustal X1.83和Genedoc軟件對(duì)AcbHLH137和其他9個(gè)物種的bHLH蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AcbHLH137蛋白的N端含有bHLH轉(zhuǎn)錄因子共有的堿性區(qū)(basic)和螺旋-環(huán)-螺旋區(qū)(HLH)保守結(jié)構(gòu)域(圖2)。為了研究不同物種之間bHLH137蛋白的進(jìn)化關(guān)系，利用MEGA7軟件通過(guò)NJ法分析中華獼猴桃AcbHLH137與茶、藍(lán)果樹(shù)、白樺、葡萄、杏、桃、枇杷、番木瓜、香蕉之間的進(jìn)化關(guān)系(圖3)，結(jié)果表明，AcbHLH137與茶樹(shù)(CsbHLH137，XP_028125498.1)聚類于同一分支，親緣性較好。

圖2 獼猴桃AcbHLH137蛋白與其他物種中bHLH137蛋白的氨基酸序列比對(duì)Fig.2 Comparison of amino acid sequence of kiwifruit AcbHLH137 protein with bHLH137 protein in other species

圖3 AcbHLH137基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic trees of AcbHLH137

2.3 AcbHLH137基因表達(dá)分析

對(duì)不同獼猴桃組織(根、莖、葉、藤、幼果、果實(shí))中AcbHLH137基因表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果表明，AcbHLH137基因在根、莖、葉、藤4個(gè)組織中均有表達(dá)，其中在莖中的表達(dá)量最高，其次是葉。對(duì)于果實(shí)組織，AcbHLH137在幼果中幾乎不表達(dá)，但在成熟果實(shí)中大量表達(dá)。在獼猴桃所有組織中，AcbHLH137在成熟果實(shí)和莖中表達(dá)量最高(圖4-A)。在獼猴桃果實(shí)采后貯藏期間，AcbHLH137基因表達(dá)量整體表現(xiàn)為上升趨勢(shì)，且表達(dá)量在貯藏后期(8～10 d)急劇升高(圖4-B)。

注：不同小寫(xiě)字母表示在 0.05 水平差異顯著。Note: Different lowercase letters mean significant difference at 0.05 level.圖4 AcbHLH137基因在獼猴桃不同組織(A)和不同貯藏時(shí)間(B)中的表達(dá)Fig.4 Expression of AcbHLH137 gene in different tissues(A) and different storage time(B) in kiwifruit

2.4 AcbHLH137亞細(xì)胞定位分析

將AcbHLH137-GFP重組載體轉(zhuǎn)化本生煙葉片中瞬時(shí)表達(dá)，葉片表皮細(xì)胞的熒光信號(hào)結(jié)果如圖5所示。對(duì)照GFP蛋白在整個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)都有分布，而AcbHLH137-GFP細(xì)胞中只有細(xì)胞核中能觀察到綠色熒光，表明該轉(zhuǎn)錄因子定位在細(xì)胞核中，這與轉(zhuǎn)錄因子的功能定位相一致。

2.5 AcbHLH137轉(zhuǎn)錄因子對(duì)AcBAM3基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控特性

前期研究發(fā)現(xiàn)β-淀粉酶基因AcBAM3是獼猴桃果實(shí)采后后熟過(guò)程中淀粉降解的關(guān)鍵基因，同時(shí)是轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控淀粉降解的關(guān)鍵靶基因[28]。為了明確AcbHLH137轉(zhuǎn)錄因子對(duì)獼猴桃淀粉降解的調(diào)控功能，采用LUC/REN雙熒光素酶試驗(yàn)研究AcbHLH137轉(zhuǎn)錄因子對(duì)AcBAM3基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控特性。重組載體構(gòu)建如圖6-A所示，利用同源重組法將AcBAM3基因插入pGreenII 0800-LUC構(gòu)建Reporter重組載體，將基因AcbHLH137 ORF序列插入pGreenII 62-SK構(gòu)建Effector重組載體。雙熒光素酶試驗(yàn)結(jié)果如圖6-B所示，與未含AcbHLH137基因的空載體相比，AcbHLH137轉(zhuǎn)錄因子與AcBAM3啟動(dòng)子的共同轉(zhuǎn)化使LUC/REN的比值顯著提高(P<0.001)。這說(shuō)明AcbHLH137轉(zhuǎn)錄因子對(duì)AcBAM3啟動(dòng)子具有轉(zhuǎn)錄激活功能。

2.6 AcbHLH137瞬時(shí)表達(dá)促進(jìn)本氏煙草淀粉降解

為了進(jìn)一步驗(yàn)證AcbHLH137轉(zhuǎn)錄因子對(duì)淀粉降解的調(diào)控功能，將上述已構(gòu)建的Effector重組載體注射本氏煙草葉片進(jìn)行AcbHLH137基因瞬時(shí)過(guò)量表達(dá)，圖7-A為AcbHLH137基因成功瞬時(shí)表達(dá)。如圖7-B所示，煙草葉片中未含AcbHLH137基因的空載體注射區(qū)域經(jīng)I2-KI染色后呈紫色，而AcbHLH137瞬時(shí)過(guò)表達(dá)區(qū)域經(jīng)I2-KI染色后未出現(xiàn)紫色。該現(xiàn)象與空載體注射的葉片區(qū)域中淀粉含量顯著高于AcbHLH137瞬時(shí)過(guò)表達(dá)區(qū)域的結(jié)果相一致圖7-C(P<0.001)。對(duì)過(guò)表達(dá)煙草葉片中NbBAM3基因的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果如圖7-D所示，AcbHLH137轉(zhuǎn)錄因子瞬時(shí)過(guò)表達(dá)顯著提高了葉片中NbBAM3基因的表達(dá)水平(P<0.05)。

3 討論

bHLH轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)成了植物中一類重要的轉(zhuǎn)錄因子家族。植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子是一個(gè)龐大的多基因家族，可以被分成6個(gè)類別[37]。bHLH轉(zhuǎn)錄因子因含有2個(gè)功能不同且保守的結(jié)構(gòu)域而得名，即堿性區(qū)(basic)和螺旋-環(huán)-螺旋區(qū)(HLH)[38]。本研究從獼猴桃果實(shí)中克隆獲得了AcbHLH137基因。生物信息學(xué)分析表明，AcbHLH137與其他物種bHLH轉(zhuǎn)錄因子高度同源，并且其氨基酸序列上含有bHLH轉(zhuǎn)錄因子共有的保守bHLH結(jié)構(gòu)域。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明AcbHLH137定位于細(xì)胞核，具有轉(zhuǎn)錄因子特征。上述結(jié)果表明AcbHLH137屬于bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子。

植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子在植物的許多生理途徑中起著重要的調(diào)控作用，如調(diào)控植物器官發(fā)育[39]、光敏色素途徑[40]、原花色素合成[41]、植物激素應(yīng)答[42]和花朵衰老[43]等。本研究中獼猴桃的根、莖、葉、藤、果實(shí)等組織中均檢測(cè)到AcbHLH137基因表達(dá)，表明該基因可能參與了獼猴桃的各生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。蕭允藝[19]發(fā)現(xiàn)MabHLH6轉(zhuǎn)錄因子參與了香蕉果實(shí)采后成熟進(jìn)程，MabHLH6轉(zhuǎn)錄因子能激活淀粉降解基因啟動(dòng)子活性，誘導(dǎo)該類基因的表達(dá)，從而促進(jìn)果實(shí)中淀粉的降解。本研究發(fā)現(xiàn)獼猴桃AcbHLH137與MabHLH6的保守結(jié)構(gòu)域序列高度相似并且在果實(shí)采后后熟期間都呈表達(dá)上調(diào)模式。在獼猴桃果實(shí)采后后熟期間，AcbHLH137表達(dá)水平的上升趨勢(shì)與該期間淀粉迅速降解的下降趨勢(shì)恰好相反。這些結(jié)果暗示著AcbHLH137可能具有與MabHLH6類似的功能，即可能也正向調(diào)控果實(shí)淀粉降解。在淀粉降解過(guò)程中，BAM是催化淀粉水解的重要酶之一[44]。陳景丹等[28]研究發(fā)現(xiàn)β-淀粉酶基因AcBAM3在獼猴桃果實(shí)淀粉降解中起關(guān)鍵作用，其在獼猴桃果實(shí)采后成熟進(jìn)程中表達(dá)模式與AcbHLH137相一致。本研究利用LUC/REN雙熒光素酶試驗(yàn)明確了AcbHLH137轉(zhuǎn)錄因子能激活A(yù)cBAM3啟動(dòng)子活性。同時(shí)，AcbHLH137基因在本氏煙草葉片中瞬時(shí)過(guò)表達(dá)降低了葉片的淀粉含量，并顯著提高了煙草β-淀粉酶基因NbBAM3的表達(dá)水平。綜上所述，AcbHLH137轉(zhuǎn)錄因子可能通過(guò)上調(diào)β-淀粉酶基因AcBAM3促進(jìn)獼猴桃果實(shí)淀粉降解，但具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

本研究從獼猴桃果實(shí)中克隆了1個(gè)bHLH基因AcbHLH137，其ORF序列長(zhǎng)度為969 bp，編碼323個(gè)氨基酸，含有bHLH特有的保守結(jié)構(gòu)域，定位于細(xì)胞核。在獼猴桃果實(shí)采后淀粉降解期間，AcbHLH137表達(dá)量呈上升趨勢(shì)。LUC/REN雙熒光素酶試驗(yàn)結(jié)果表明AcbHLH137能激活A(yù)cBAM3啟動(dòng)子活性。煙草瞬時(shí)過(guò)量表達(dá)AcbHLH137基因進(jìn)一步驗(yàn)證了AcbHLH137轉(zhuǎn)錄因子能促進(jìn)淀粉降解。