黃秋葵中黃酮類化合物提取方法優(yōu)化及總黃酮抑菌效果研究

陳曉琪 李瑤晨 李璐瑤 楊 靜 饒帥琦 祝 彪 臧運(yùn)祥 周 根

(浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311300)

黃秋葵(AbelmoschusesculentusL.)又名羊角豆、秋葵等，屬錦葵科秋葵屬植物，因適應(yīng)性廣、抗性強(qiáng)、產(chǎn)量高、栽培簡單、營養(yǎng)價(jià)值高而廣受歡迎[1]。據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO)統(tǒng)計(jì)，2020年全世界黃秋葵年產(chǎn)量近1 055萬噸，年生產(chǎn)面積達(dá)253萬公頃，約占世界蔬菜年生產(chǎn)面積的3.5%；主產(chǎn)地為非洲和亞洲，年生產(chǎn)面積分別達(dá)193萬和59萬公頃[2]。目前，有關(guān)黃秋葵的研究主要集中在黃酮類物質(zhì)、凝集素、多糖和果膠等重要植物化學(xué)成分的提取和功效方面[3]。黃秋葵具有抗疲勞[4-5]、降血糖、降血脂[6]、抗乙醇誘導(dǎo)的胃黏膜損傷[7]等多種保健功能。有研究發(fā)現(xiàn)，黃秋葵種子的水和甲醇提取物具有較好的抗氧化、抗應(yīng)激和益智作用[8]；黃秋葵花的水提物對大腸桿菌(Escherichiacoli)、單核球增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙門氏菌(Salmonella)均有明顯的抑制作用[9]，花中所含多糖可促進(jìn)大腸桿菌發(fā)酵液中乙酸和己酸的產(chǎn)生，具有維持機(jī)體內(nèi)腸道微生物水平穩(wěn)定、減輕炎癥等作用[10]；黃秋葵葉乙醇提取物對立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)和尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)的抑菌活性較強(qiáng)[11]。

黃酮類化合物是黃秋葵中含量豐富的主要生物活性物質(zhì)，其含量在不同部位存在差異，由高到低依次為嫩果>嫩葉>種子>果莢[12]。目前，黃秋葵中已鑒定出槲皮素-3-龍膽二糖苷、楊梅素-3-O-葡糖苷、槲皮素-3-O-木糖(1→2)-葡糖苷、蘆丁、異槲皮苷、異鼠李素戊糖苷、槲皮素-3-O-(6-O-丙二酰)-葡糖苷等多種黃酮類成分[13]。研究發(fā)現(xiàn)黃秋葵所含異槲皮苷、槲皮素-3-O-槐糖苷等黃酮類化合物均表現(xiàn)出良好的α-淀粉酶抑制活性[14]；槲皮素和蘆丁對處于地塞米松治療中的小鼠有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用[15]；同時(shí)，異槲皮苷可作為肥胖及相關(guān)代謝性疾病的潛在治療藥物[16]。

目前，黃秋葵中黃酮類物質(zhì)的常見提取方法眾多[17-21]，如王琰等[22]用乙醇超聲波輔助提取法從黃秋葵莢中分離鑒定了異槲皮苷和槲皮素-3-龍膽二糖苷；Senthamilselvi等[23]用乙醇與石油醚從黃秋葵花中提取得到黃酮醇-7-O-甲基棉花素-8-O-β-D-葡萄糖苷。同時(shí)，響應(yīng)面分析法被廣泛應(yīng)用于探究物質(zhì)最佳提取工藝參數(shù)[24-25]，如郭溆等[26]、林香信等[27]采用響應(yīng)面法對黃秋葵花總黃酮的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。但已有的研究主要圍繞黃秋葵總黃酮的提取工藝進(jìn)行，各具體黃酮類成分的提取工藝優(yōu)化仍鮮有報(bào)道。

本試驗(yàn)采用超聲輔助提取法和高效液相色譜法，通過單因素和響應(yīng)面法對料液比、乙醇濃度、提取溫度和提取時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，以期建立可以同時(shí)提取4種黃秋葵主要黃酮類化合物和總黃酮的工藝和方法，此外探究黃秋葵總黃酮對常見致病菌的抑菌活性，為黃秋葵資源的開發(fā)利用和黃秋葵中主要黃酮類物質(zhì)的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃秋葵購自浙江杭州臨安城北農(nóng)貿(mào)市場，槲皮素-3-龍膽二糖苷、槲皮素-3-O-木糖(1→2)-葡糖苷、異槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)購自上海源葉生物科技有限公司；槲皮素-3-O-(6-O-丙二酰)-葡糖苷標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥85%)購自美國Sigma公司；乙腈(色譜純)購自美國Tedia公司；胰化蛋白胨、酵母提取物購自英國Oxiod公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)購自中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司。

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、白假絲酵母(Canidiaalbicans)、黑曲霉(Aspergillusnigerniger)及黑根霉(Rhizopusnigricans)菌種均由浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院園藝實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Gamma 1-16 LSC真空冷凍干燥機(jī)，德國Martin Christ有限公司；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士Buchi公司；Aglient1200高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；DRP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海森信試驗(yàn)儀器有限公司；722S型可見分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理 將黃秋葵嫩果切塊，液氮預(yù)冷后用凍干機(jī)冷凍干燥72 h至恒重，粉碎過60目篩(顆粒直徑250 μm)，置-20℃冰箱備用。

1.3.2 黃秋葵中黃酮類化合物的提取 稱取0.5 g黃秋葵粉末于50 mL離心管中，加入一定量相應(yīng)濃度乙醇溶液，渦旋混勻后，設(shè)定相應(yīng)溫度和超聲波輔助提取時(shí)間，提取結(jié)束后，8 000 r·min-1離心10 min，收集上清液。重復(fù)上述提取步驟2次，過濾定容，將提取液旋轉(zhuǎn)蒸干后，加入2 mL相應(yīng)濃度的乙醇溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后得待測液。每個(gè)樣品重復(fù)3次。按照公式計(jì)算黃秋葵中黃酮類化合物的提取率(Y)

Y=CV/m

式中，m為黃秋葵粉末總質(zhì)量，g；C為提取液中黃酮類化合物質(zhì)量濃度，μg·mL-1；V為提取液體積，mL。

1.3.3 黃酮類化合物的含量測定 采用高效液相色譜法對黃秋葵中的黃酮類化合物進(jìn)行分析測定，用外標(biāo)法進(jìn)行定量。分別準(zhǔn)確稱量4種標(biāo)準(zhǔn)品，將其配置成800 μg·mL-1[槲皮素-3-龍膽二糖苷、槲皮素-3-O-木糖(1→2)-葡糖苷、異槲皮苷]和500 μg·mL-1[槲皮素-3-O-(6-O-丙二酰)-葡糖苷]的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，逐級稀釋成6個(gè)濃度梯度后分別進(jìn)樣，得到各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線。前期預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黃秋葵嫩果中黃酮類化合物主要是上述4種物質(zhì)，故以此4種黃酮類化合物含量之和作為黃秋葵中總黃酮含量進(jìn)行計(jì)算。

色譜柱：島津ODS-SP 5020-02746(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫：30℃；流速：0.8 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：256 nm；流動相A：1%冰醋酸水溶液，流動相B：乙腈。梯度洗脫程序如下：0～1 min，10% B；1.01～40 min，10～30% B；40.01～50 min，30% B。

1.3.4 單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選擇提取時(shí)間、提取溫度、料液比、乙醇濃度作為影響因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)?？疾靻未翁崛r(shí)間(5、10、15、20、25、30 min)對提取的影響，選擇提取溫度25℃、乙醇濃度70%、料液比1∶40 g·mL-1；考察提取溫度(25、30、35、40、45、50℃)對提取的影響，選擇單次提取時(shí)間10 min、乙醇濃度70%、料液比1∶40 g·mL-1；考察料液比(1∶10、1∶20、1∶30、 1∶40、1∶50、1∶60 g·mL-1)對提取的影響，選擇提取時(shí)間10 min、提取溫度40℃、乙醇濃度70%；考察乙醇濃度(50%、60%、70%、80%、90%)對提取的影響，選擇提取時(shí)間10 min、提取溫度40℃、料液比1∶40 g·mL-1。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理及Design-Expert 8.0.6.1分析軟件建立二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，以提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)、乙醇濃度(C)、料液比(D)為響應(yīng)變量，以黃秋葵中的4種主要黃酮類化合物和總黃酮含量為響應(yīng)值，采用四因素三水平響應(yīng)面中心組合法對黃秋葵中黃酮類物質(zhì)提取工藝的主要參數(shù)進(jìn)行分析優(yōu)化，各因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors of response surface test design

1.3.5 黃秋葵總黃酮抑菌活性及最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)的測定 采用牛津杯法，依據(jù)文獻(xiàn)[28]與預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，確定考察5個(gè)濃度(2.0、2.5、3.8、5.0、7.5 mg·mL-1)黃秋葵總黃酮對6種常見致病菌的抑菌活性。黃秋葵總黃酮濃度定量方法參照1.3.3部分。用移液槍移取菌懸液0.1 mL依次加入培養(yǎng)皿，用無菌涂布棒均勻涂抹，在每個(gè)培養(yǎng)皿中等距離放置無菌牛津杯，向牛津杯中加入0.1 mL不同濃度黃秋葵黃酮類化合物提取液和空白對照(無菌生理鹽水)，每個(gè)濃度重復(fù)3次。細(xì)菌在37℃恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)18 h并測量抑菌圈直徑；真菌在28℃恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)48 h，并測量抑菌圈直徑。采用十字交叉法用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈的直徑D，取平均值。最小抑菌圈所含最低黃秋葵黃酮類化合物濃度即為MIC。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析 每個(gè)處理3次重復(fù)，試驗(yàn)結(jié)果用Mean±SD表示。顯著性采用IBM SPSS Statistics 22分析。響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design-Expert 8.0.6.1分析。采用Excel 2010軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

以4種黃酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度(μg·mL-1) 為橫坐標(biāo)，256 nm波長處響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量計(jì)算。所得曲線的線性范圍分別為20～800 μg·mL-1[槲皮素-3-龍膽二糖苷、槲皮素-3-O-木糖(1→2)-葡糖苷、異槲皮苷]和15～500 μg·mL-1[槲皮素-3-O-(6-O-丙二酰)-葡糖苷]；R2均在0.999 以上。圖1為黃秋葵樣品黃酮類化合物的HPLC圖譜，各相鄰色譜峰之間的分離度均大于2.21，達(dá)到分離要求。

注：1:槲皮素-3-龍膽二糖苷；2:槲皮素-3-O-木糖(1→2)-葡糖苷；3:異槲皮苷；4:槲皮素-3-O-(6-O-丙二酰)-葡糖苷。Note: 1: Quercetin-3-gentiobioside. 2: Quercetin-3-O-[β-D-xylosyl-(1→2)-β-D-glucoside]. 3: Isoquercetin. 4: Quercetin-3-O-(6-O-malonyl)-β-D-glucoside.圖1 黃秋葵樣品黃酮類化合物HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of okra flavonoids

由圖2可知，4種黃酮類化合物的含量在不同單因素條件下的變化趨勢和總黃酮含量變化趨勢不完全相同。方差分析結(jié)果表明，提取溫度、料液比、乙醇濃度均對黃秋葵中黃酮類化合物含量有顯著影響(P<0.05)，而提取時(shí)間僅對槲皮素-3-龍膽二糖苷含量影響顯著(P<0.05)。

黃秋葵中黃酮類化合物的含量隨著提取溫度的升高總體呈先上升后下降趨勢，在45℃時(shí)達(dá)到最高(圖2-A)。槲皮素-3-龍膽二糖苷含量在單次提取時(shí)間為10 min時(shí)最高，顯著高于25、30 min時(shí)所測含量(P<0.05)；其余黃酮類化合物及總黃酮含量在不同提取時(shí)間下差異不顯著(圖2-B)。黃秋葵黃酮類化合物含量在料液比為1∶20 g·mL-1時(shí)顯著高于其余比例(圖2-C)。在乙醇濃度為60%時(shí)，槲皮素-3-O-木糖(1→2)-葡糖苷、異槲皮苷和黃秋葵總黃酮含量略高于乙醇濃度70%時(shí)各自含量(差異不顯著)，但顯著高于其余處理；在乙醇濃度大于60%時(shí)，槲皮素-3-龍膽二糖苷、槲皮素-3-O-(6-O-丙二酰)-葡糖苷及總黃酮含量呈明顯下降趨勢(圖2-D)。綜上所述，響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)所選4個(gè)單因素的候選最佳條件分別為提取溫度45℃、單次提取時(shí)間10 min(總計(jì)20 min)、料液比1∶20 g·mL-1、乙醇濃度60%。

注：圖中不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。Note: Different letters denote significant different at 0.05 level among treatment.圖2 各因素對黃秋葵中黃酮類化合物含量的影響Fig.2 Effects of various factors on flavonoids content in okra

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝試驗(yàn)結(jié)果

表2 Box-Behnken試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Arrangement and results of four-factors Box-Behnken design

表2(續(xù))

表3 提取工藝回歸模型擬合結(jié)果Table 3 Fitting results of extraction process regression model

對回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明各提取因素及其交互作用對5個(gè)響應(yīng)值存在不同影響(表4)。結(jié)合F值的大小，得出所選因素對槲皮素-3-龍膽二糖苷、異槲皮苷、槲皮素-3-O-(6-O-丙二酰)-葡糖苷及總黃酮含量影響強(qiáng)弱順序?yàn)椋禾崛r(shí)間<提取溫度<乙醇濃度<料液比；對槲皮素-3-O-木糖(1→2)-葡糖苷含量影響強(qiáng)弱順序?yàn)椋禾崛囟?提取時(shí)間<乙醇濃度<料液比。分別對各因素進(jìn)行顯著性分析，可知各回歸模型一次項(xiàng)中乙醇濃度C、料液比D回歸系數(shù)極顯著(P<0.000 1)，說明這2個(gè)單因素對黃秋葵黃酮類化合物含量影響較大；交互項(xiàng)中提取時(shí)間和乙醇濃度(BC)、提取時(shí)間和料液比(BD)對應(yīng)的P值小于0.05，說明存在顯著的交互作用；二次項(xiàng)的偏回歸系數(shù)均達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，說明該回歸方程擬合程度較好，模型具有很高的可靠性和準(zhǔn)確性。

圖3為以4種主要黃酮類化合物和總黃酮含量為響應(yīng)值，提取時(shí)間分別與乙醇濃度、料液比交互作用的三維響應(yīng)面分析圖。圖3-A～F中各響應(yīng)曲面的坡度較陡，說明提取時(shí)間分別與乙醇濃度、料液比的交互作用對槲皮素-3-龍膽二糖苷、異槲皮苷、槲皮素-3-O-(6-O-丙二酰)-葡糖苷含量的影響較大。在一定范圍內(nèi)，適當(dāng)提高提取時(shí)間和乙醇濃度，在交互作用下含量的變化趨勢均為先上升后下降(圖3-A、C、E、G)。當(dāng)料液比較高時(shí)，黃酮類化合物含量隨著提取時(shí)間增加有明顯上升，后趨于平緩；料液比較低時(shí)，含量隨著提取時(shí)間增加緩慢下降(圖3-B、D、F、H)。因此，要提高黃秋葵中總黃酮的含量，可以適當(dāng)增加料液比。黃酮類化合物含量受其他因素交互作用的影響相對較小，無顯著差異，故未列出。

響應(yīng)面分析模型和軟件分析可知各組分及總黃酮響應(yīng)值在極大值點(diǎn)所對應(yīng)的各因素編碼值，經(jīng)過換算后得出總黃酮及主要黃酮類化合物提取最佳條件實(shí)際值。其中，槲皮素-3-龍膽二糖苷最佳提取條件為提取溫度37.5℃、提取時(shí)間20.3 min、乙醇濃度69.3%、料液比1∶24.6 g·mL-1，此條件下槲皮素-3-龍膽二糖苷含量理論上可達(dá)2 493.20 μg·g-1；槲皮素-3-O-木糖(1→2)-葡糖苷最佳提取條件為提取溫度50℃、提取時(shí)間10 min、乙醇濃度70%、料液比1∶28.4 g·mL-1，此條件下槲皮素-3-O-木糖(1→2)-葡糖苷含量理論上可達(dá)563.43 μg·g-1；異槲皮苷最佳提取條件為提取溫度36.4℃、提取時(shí)間19.7 min、乙醇濃度70%、料液比1∶25.7 g·mL-1，此條件下異槲皮苷含量理論上可達(dá)1 180.40 μg·g-1； 槲皮素-3-O-(6-O-丙二酰)-葡糖苷最佳提取條件為提取溫度37.2℃、提取時(shí)間19.9 min、乙醇濃度67.5%、料液比1∶24.7 g·mL-1，此條件下槲皮素-3-O-(6-O-丙二酰)-葡糖苷含量理論上可達(dá)496.72 μg·g-1；總黃酮最佳提取條件為提取溫度37.1℃、提取時(shí)間20.1 min、乙醇濃度69.9%、料液比1∶25.1 g·mL-1，此條件下黃秋葵中總黃酮含量理論上可達(dá)4 666.8 μg·g-1。優(yōu)化后所得的總黃酮實(shí)際含量為4 576.1 μg·g-1，其中槲皮素-3-龍膽二糖苷為2 403.7 μg·g-1、槲皮素-3-O-木糖(1→2)-葡糖苷為516.5 μg·g-1、異槲皮苷為1 170.7 μg·g-1、槲皮素-3-O-(6-O-丙二酰)-葡糖苷為485.2 μg·g-1，接近預(yù)測值，表明該提取工藝具有可行性。

2.3 黃秋葵總黃酮抑菌活性研究

圖4為7.5 mg·mL-1總黃酮對6種致病菌的抑菌效果圖。由表5可知，5.0和7.5 mg·mL-1黃秋葵總黃酮對3種細(xì)菌均具有抑菌活性，抑菌活性均隨著總黃酮濃度上升而增強(qiáng)；7.5 mg·mL-1黃秋葵總黃酮對金黃色葡萄球菌培養(yǎng)皿中所形成的抑菌圈最大，其次為大腸桿菌和枯草芽孢桿菌；當(dāng)總黃酮濃度為 3.8 mg·mL-1時(shí)，僅金黃色葡萄球菌培養(yǎng)皿中出現(xiàn)明顯抑菌圈。黃秋葵總黃酮對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的MIC分別為5.0、3.8和5.0 mg·mL-1，可見對金黃色葡萄球菌的抑菌活性均強(qiáng)于大腸桿菌和枯草芽孢桿菌。

對3種真菌的抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，濃度不小于3.8 mg·mL-1的黃秋葵總黃酮對白假絲酵母抑菌活性隨濃度上升而增強(qiáng)；僅7.5 mg·mL-1的黃秋葵總黃酮對黑曲霉和黑根霉具有抑菌活性。黃秋葵總黃酮對白假絲酵母、黑曲霉和黑根霉的MIC分別為3.8、7.5和7.5 mg·mL-1，可見提取物對白假絲酵母的抑菌活性強(qiáng)于黑曲霉和黑根霉。

3 討論

目前，有關(guān)黃秋葵中黃酮類化合物提取的研究主要集中在總黃酮，鮮有針對單個(gè)成分的提取工藝優(yōu)化的研究。鄧浩等[29]采用微波輔助提取法提取黃秋葵總黃酮，確定最佳條件為乙醇濃度70%時(shí)所測相應(yīng)含量，提取溫度70℃、料液比1∶40 g·mL-1、提取時(shí)間40 min。李加興等[30]通過響應(yīng)面法優(yōu)化黃秋葵中總黃酮的超聲輔助最佳提取工藝為料液比1∶25 g·mL-1、提取時(shí)間21 min、提取溫度75℃、乙醇濃度50%。其料液比、乙醇濃度和提取溫度最佳工藝條件與本研究結(jié)果存在部分差異，這可能與本研究綜合考慮了黃秋葵中各黃酮類化合物的提取率以及使用的HPLC檢測方法

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

不同有關(guān)。本研究中當(dāng)料液比為1∶10 g·mL-1時(shí)，總黃酮含量與其他處理相比偏低的原因可能是樣品在有機(jī)溶劑中溶解不夠充分；隨著料液比的提高，有機(jī)溶劑含量增加，黃酮類化合物含量顯著上升，當(dāng)料液比為1∶20 g·mL-1時(shí)達(dá)到最大值；當(dāng)料液比高于1∶20 g·mL-1時(shí)，黃秋葵中某些醇溶性物質(zhì)與溶劑間可能存在相似相溶競爭，影響黃酮類化合物的浸出，導(dǎo)致其含量下降[31]。在單因素試驗(yàn)中，乙醇濃度為60%時(shí)所得槲皮素-3-O-木糖(1→2)-葡糖苷、異槲皮苷和黃秋葵總黃酮含量略高于乙醇濃度70%時(shí)所測相應(yīng)含量，而槲皮素-3-龍膽二糖苷、槲皮素-3-O-(6-O-丙二酰)-葡糖苷含量相近，這可能是由于乙醇濃度升高，黃秋葵中其他醇溶性物質(zhì)含量有所上升，使得部分黃酮類化合物含量下降[32]。在提取過程中，適當(dāng)升高提取溫度可提高黃酮類化合物的溶解度和擴(kuò)散系數(shù)[33]，但為了避免可能存在的降解和聚合，提取溫度定在40℃左右較合適，有助于保持黃酮類化合物的穩(wěn)定性[34]，這與本研究中槲皮素-3-龍膽二糖苷、異槲皮苷、槲皮素-3-O-(6-O-丙二酰)-葡糖苷與總黃酮的最佳提取工藝條件提取溫度37℃相符。Beatriz等[35]對落地生根葉中黃酮類化合物槲皮素阿拉伯糖基鼠李糖苷、槲皮苷的提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)槲皮素阿拉伯糖基鼠李糖苷提取的最佳溫度范圍在40～50℃，提取時(shí)間18 min，這與本研究槲皮素-3-O-木糖(1→2)-葡糖苷最佳提取溫度50℃、提取時(shí)間20 min(總時(shí)間)結(jié)果基本一致。槲皮素-3-O-木糖(1→2)-葡糖苷與其余3種黃酮化合物的最佳提取溫度不同可能與不同黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)特性有關(guān)。

注：A:枯草芽孢菌；B:金黃色葡萄球菌；C:大腸桿菌；D:白假絲酵母 E:黑曲霉；F:黑根霉；1、2、3:總黃酮；4:生理鹽水。Note: A: Bacillus subtilis. B: Staphylococcus aureus. C: Escherichia coli. D: Canidia albicans. E: Aspergillusniger niger. F: Rhizopus nigricans.1、2、3: Total flavonoids. 4: Normal saline.圖4 7.5 mg·mL-1總黃酮抑菌效果圖Fig.4 Antimicrobial effect of 7.5 mg·mL-1 total flavonoids

本研究結(jié)果表明，黃秋葵黃酮類化合物對6種供試菌種均有抑菌活性，且對細(xì)菌的抑菌活性強(qiáng)于除白假絲酵母外其他真菌的抑菌活性，這與前人在多年生藤本豆[36]、玉米苞葉[37]等植物中提取的黃酮類化合物抑菌活性試驗(yàn)結(jié)果基本一致。MIC是衡量物質(zhì)抑制病原菌生長活性的重要參數(shù)，值越小表示抑菌活性越大。通過與不同植物黃酮類化合物的抑菌活性MIC的比較發(fā)現(xiàn)，黃秋葵總黃酮對細(xì)菌的抑菌活性弱于桑葚(2倍)[38]、荔枝皮(1.5～2倍)[39]，強(qiáng)于魚腥草(5%)[40]；對真菌的抑菌活性弱于桑葚(2.5倍)[38]，強(qiáng)于荔枝皮(67%)[39]。說明抑菌活性大小還可能與黃酮類物質(zhì)的具體成分有關(guān)。將黃秋葵總黃酮與5種常見的中藥材乙醇提取物的抑菌活性進(jìn)行比較，可知黃秋葵總黃酮對細(xì)菌的抑菌活性弱于黃芩，但強(qiáng)于薄荷、知母、甘草、金銀花等，而黃秋葵總黃酮對黑根霉的MIC為薄荷的10%，亦表明該物質(zhì)有較強(qiáng)的抑菌活性[40]。綜上所述，黃秋葵黃酮類化合物在開發(fā)天然抗菌劑方面具有良好的應(yīng)用前景，其抑菌具體作用機(jī)制與抗菌活性成分有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，黃秋葵中主要黃酮類化合物槲皮素-3-O-木糖(1→2)-葡糖苷最佳提取條件為提取溫度50℃、提取時(shí)間10 min、乙醇濃度70%、料液比1∶28.4 g·mL-1；槲皮素-3-龍膽二糖苷、異槲皮苷、槲皮素-3-O-(6-O-丙二酰)-葡糖苷在不同提取條件下的含量變化趨勢和總黃酮相同，確定最佳提取條件為提取溫度37℃、提取時(shí)間20 min、乙醇濃度70%、料液比1∶25 g·mL-1。在后者條件下，黃秋葵中總黃酮含量為4 576.1 μg·g-1；槲皮素-3-龍膽二糖苷、槲皮素-3-O-木糖(1→2)-葡糖苷、異槲皮苷和槲皮素-3-O-(6-O-丙二酰)-葡糖苷含量分別為2 403.7、516.5、1 170.7 和485.2 μg·g-1。體外抑菌試驗(yàn)表明，一定濃度的黃秋葵總黃酮對6種供試菌種均具有一定的抑菌活性，抑菌效果由大到小依次為：白假絲酵母>金黃色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌>大腸桿菌>黑根霉>黑曲霉。