長三角地區(qū)粳稻種質(zhì)的稻瘟病抗性基因鑒定及其抗性評價

閆 影 王 凱 周鋒利 張麗霞 胡澤軍 曹黎明,2 吳書俊,2,*

(1 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種栽培研究所，上海 201403；2 上海農(nóng)產(chǎn)品保鮮加工工程技術(shù)研究中心， 上海 201403；3 上海市嘉定區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，上海 201800)

稻瘟病是由子囊真菌(Magnaportheoryzae)引起的一種水稻真菌病害，是水稻生產(chǎn)中流行最廣、危害最大的世界性水稻三大病害之一，素有“水稻癌癥”之稱[1-2]。依據(jù)稻瘟病感染發(fā)病部位的不同可將其分為苗瘟、葉瘟、節(jié)瘟、穗頸瘟、谷粒瘟等，其中穗頸瘟的危害最大，發(fā)病嚴重時會造成水稻減產(chǎn)40%～50%，甚至顆粒無收[3-4]。近年來我國稻瘟病年均發(fā)生面積在470萬hm2次左右；2013年以后，發(fā)病情況更呈現(xiàn)上升趨勢[3]。

當前全國各地在新品種審定時已實施對稻瘟病表現(xiàn)感病的“一票否決制”，對育成品種的稻瘟病抗性提出了更高要求[5]。研究表明，選育推廣具有持久和廣譜抗性的水稻新品種是防治稻瘟病最有效的方法之一，而抗病基因的發(fā)掘與利用是抗病育種的基礎(chǔ)和核心[6]。20世紀60年代中期，日本率先開展了水稻品種抗稻瘟病基因分析的研究工作，鑒定出最初8個抗性位點上的14個基因，并建立了一套抗稻瘟病基因分析用的鑒別體系(japanse differential cultivars，JDCs)，隨后，國際水稻研究所和中國等產(chǎn)稻國也逐漸開展了水稻稻瘟病抗性遺傳的系統(tǒng)性研究[7]。截至目前，已鑒定的抗稻瘟病質(zhì)量性狀基因有100多個，數(shù)量性狀位點500多個[8]，Pib[9]、Bsrd-1[10]、pi-21[11]、Pi2[12]、Pi9[13]、Piz-t[12]、Pigm[14]、Pi5/Pi3/Pii[15]、Pikh/Pi54[16]、Pikm[17]、Pik[18]和Pita[19]等37個抗稻瘟病基因獲得克隆。其中，Piz-t、Pi9、Pi2和Pigm互為Piz位點上的等位基因[14]；Pi-1、Pikh/Pi-54、Pik-p和Pikm互為Pik位點上的等位基因[18]；Pi-25和Pid-3互為等位基因[20]；PiCO39和Pia互為等位基因[21]。部分已克隆的抗病基因已在育種中廣泛應(yīng)用[22]，例如李瑩[23]利用分子標記輔助技術(shù)，將廣譜、高抗的稻瘟病基因Pid2和Pid3導(dǎo)入到空育131的遺傳背景中，以培育新的寒區(qū)水稻品系空育131(Pid2/Pid3)；馬作斌等[24]利用分子標記輔助選育出聚合基因Pi5和Pita的抗稻瘟病水稻新品系。

本研究利用8個抗稻瘟病基因功能標記對長三角地區(qū)52份粳稻資源進行抗稻瘟病基因檢測，結(jié)合田間抗病評價，分析其對稻瘟病的抗性貢獻，鑒定篩選出今后可以作為改良長三角地區(qū)優(yōu)質(zhì)粳稻稻瘟病抗性的主要基因，以便利用分子標記輔助選擇技術(shù)，進一步有針對性地進行抗病基因聚合，提高育成材料對稻瘟病的持久抗性，并為同類研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以52份長三角地區(qū)育種科研單位選育的粳稻種質(zhì)作為試驗材料，均為本研究前期選育優(yōu)質(zhì)抗稻瘟病粳稻品種的骨干親本(表1)，對照品種為蘇御糯。于2019年夏季種植于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院莊行綜合試驗站，常規(guī)水肥管理。

表1 供試水稻種質(zhì)Table 1 Rice germplasms used in this experiment

用于稻瘟病抗性鑒定的供試菌株由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所提供，為2019年分離得到的江蘇省及周邊地區(qū)稻瘟病菌優(yōu)勢代表菌株2019-746、2019-587、2019-924、2019-16-3、2019-522和2019-863的孢子混合液。

1.2 穗頸瘟人工鑒定和發(fā)病調(diào)查

在水稻孕穗初期向幼穗穗苞內(nèi)注射接種上述稻瘟病菌菌株孢子混合液，每株選1個穗苞注射1 mL，每個種質(zhì)注射10株。在水稻成熟期按國家標準GB/T 15790-2009稻瘟病測報調(diào)查規(guī)范[25]調(diào)查水稻穗頸瘟的發(fā)病情況，分級記載。

1.3 水稻基因組DNA提取

在水稻分蘗盛期采集幼嫩葉片，經(jīng)液氮研磨，利用CTAB法提取水稻全基因組DNA[26]。

1.4 抗稻瘟病基因的檢測

本研究檢測Pi9、Pib、Pi5、Pita、Pi2、Pikh、Pikm和Pigm共8個抗稻瘟病基因的分子標記特異性引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，具體分子標記的引物序列及擴增多態(tài)性差異見表2。反應(yīng)體系20 μL：DNA模版2 μL，2×Hieff PCR Master Mix(with dye)10 μL，引物等體積混合液1.6 μL，ddH2O 6.4 μL。所用試劑購自上海翊圣生物科技有限公司。反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55～60℃退火30 s，72℃復(fù)性30 s，共33個循環(huán)；72℃延伸10 min，10℃保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)含有核酸染料的2%瓊脂糖凝膠電泳分離，在紫外凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)觀察多態(tài)性差異。

表2 抗稻瘟病基因相關(guān)分子標記信息Table 2 Molecular markers related to rice blast resistance genes

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

根據(jù)8個抗稻瘟病基因在52份粳稻種質(zhì)中的分布情況，對檢測結(jié)果賦值，檢出稻瘟病抗性等位基因記為1，檢出感病等位基因記為0。利用軟件NTsys 2.1計算52個種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)，并用非加權(quán)類平均法(unweighted pair-group method with arithmetic mean，UPGMA)對遺傳相似性系數(shù)進行聚類分析，得到聚類樹形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 8個抗稻瘟病基因在52份長三角地區(qū)粳稻種質(zhì)中的分布

本研究檢測了52份長三角地區(qū)粳稻種質(zhì)中Pi9、Pib、Pi5、Pita、Pi2、Pikh、Pikm和Pigm共8個抗稻瘟病基因的分布情況(部分檢測結(jié)果見圖1，具體結(jié)果見表3)。

注：基因Pi9檢測圖中，泳道從左至右依次為分子量標記、淮稻5號、丙11-107、揚粳50226、秀水121、滬軟2123、秀水114、嘉07-34、嘉33、WDR129、寧9103、WDR35；等位基因Pib和pib檢測圖中，泳道從左至右依次為分子量標記、WDR48、滬香12-268、WDR56、空白泳道、光明糯1號、滬11-12、滬12-285、滬12-383、滬粳144、鎮(zhèn)稻99、滬香12-258；基因Pi5檢測圖中，泳道從左至右依次為分子量標記、秀水121、WDR35、滬軟2123、WDR48、WDR56、武3338、光明糯1號、滬11-12、滬12-285、滬12-383、滬粳144；基因Pi2檢測圖中，泳道從左至右依次為分子量標記、WDR56、嘉花1號、滬軟12-386、滬香12-273、滬香粳106、滬香軟386、寧9103、蘇香粳100、蘇12-838、秀水110、秀水123；等位基因Pita和pita檢測圖中，泳道從左至右依次為分子量標記、蘇12-838、武香粳19、武運粳21、滬香12-268、秀水110、秀水123、秀水134、秀水519、滬香12-211、南粳5055、秀水994；基因Pikh檢測圖中，泳道從左至右依次為分子量標記、ZHG-1、南粳9108、滬12-380、銀香38、鎮(zhèn)稻99、南粳46、滬香12-258、蘇御糯、滬10-139、滬香12-540；基因Pikm檢測圖中，泳道從左至右依次為分子量標記、滬軟12-386、滬香 12-273、滬香粳106、滬香軟386、嘉花1號、武香粳19、寧9103、空白泳道、蘇香粳100、蘇12-838、武運粳21、秀水123Note: In the picture of gene Pi9 genotype detection the lines from lefTTo right is DNA Marker (DL2000), Huaidao5, Bing11-107, Yanggeng50226, Xiushui121, Huruan2123, Xiushui114, Jia07-34, Jia33, WDR129, Ning9103 and WDR35. In the picture of gene Pib and pib genotype detection the lines from lefTTo right is DNA Marker (DL2000), WDR48, Huxiang12-268, WDR56, blank, Guangmingnuo1, Hu11-12, Hu12-258, Hu12-383, Hugeng144, Zhendao99 and Huxiang12-258. In the picture of gene Pi5 genotype detection the lines from lefTTo right is DNA Marker (DL2000), Xiushui121, WDR35, Huruan2123, WDR48, WDR56, Wu3338, Guangmingnuo1, Hu11-12, Hu12-258, Hu12-383 and Hugeng144. In the picture of gene Pi2 genotype detection the lines from lefTTo right is DNA Marker (DL2000), WDR56, Jiahua1, Huruan12-386, Huxiang12-273, Huxianggeng106, Huxiangruan386, Ning9103, Suxianggeng100, Su12-838, Xiushui110 and Xiushui123. In the picture of gene Pita and pita genotype detection the lines from lefTTo right is DNA Marker (DL2000), Su12-838, Wuxianggeng19, Wuyungeng21, Huxiang12-268, Xiushui110, Xiushui123, Xiushui134, Xiushui519, Huxiang12-211, Nangeng5055 and Xiushui994. In the picture of gene Pikh genotype detection the lines from lefTTo right is DNA Marker (DL2000), ZHG-1, Nangeng9108, Hu12-380, Yinxiang38, Zhendao99, Nangeng46, Huxiang12-258, Suyunuo, Hu10-139 and Huxiang12-540. In the picture of gene Pikm genotype detection the lines from lefTTo right is DNA Marker (DL2000), Huruan12-386, Huxiang12-273, Huxianggeng106, Huxiangruan386, Jiahua1, Wuxianggeng19, Ning9103, blank, Suxianggeng100, Su12-838, Wuyungeng21 and Xiushui123.圖1 部分種質(zhì)中7個抗稻瘟病基因檢測Fig.1 Detection of 7 blast resistance genes in some rice germplasms

除基因Pigm以外，其他抗病基因在52份粳稻種質(zhì)中均有不同分布頻率。其中分布頻率最高的是Pib，達到78.85%，其次是Pita，達到50.00%；其余基因分布頻率依次為38.46%(Pikh)，34.62%(Pi9)，23.08%(Pikm)，21.15%(Pi2)，5.77%(Pi5)(圖2)。除對照品種蘇御糯外，其余種質(zhì)均有抗稻瘟病基因分布。同時攜帶2個抗病基因的最多，占供試種質(zhì)的38.46%(圖3)，有12個種質(zhì)同時攜帶抗病基因達4個，分別是秀水121、秀水114、嘉07-34、丙11-107、嘉33、2123軟、武香粳19、武運粳21、秀水123、秀水134、秀水519和常農(nóng)粳5號，其中8個為浙江省嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院選育的品種。

2.2 聚類分析

為了進一步明確供試水稻種質(zhì)稻瘟病抗性的遺傳差異，利用8個抗稻瘟病基因的功能標記對52份水稻種質(zhì)進行聚類分析。結(jié)果表明，檢測水稻種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)變化范圍在0～1之間，在相似系數(shù)大于0.5的水平上，將52份水稻種質(zhì)分為6類。第1類包括6個；第2類包括3個；第3類有1個；第4類包括29個；第5類包括12個；第6類有1個(圖4)。

表3 52份粳稻種質(zhì)中8個稻瘟病抗性基因分子檢測結(jié)果Table 3 Molecular detection of 8 blast resistance genes in 52 japonica rice germplasms

2.3 52份長三角地區(qū)粳稻種質(zhì)稻瘟病抗性接種鑒定

本研究利用2019-746、2019-587、2019-924、2019-16-3、2019-522和2019-863的菌株孢子混合液對52份供試粳稻種質(zhì)進行田間接種鑒定，依照國家標準《GB/T 15790-2009稻瘟病測報調(diào)查規(guī)范》中穗頸瘟抗性分級指標[25]對各種質(zhì)進行抗性評價。結(jié)果表明，52份粳稻種質(zhì)中大部分表現(xiàn)抗病，達到61.5%；中抗材料占比9.6%；中感材料占比3.8%，感病及高感病材料占比25.0%(表4)。

2.4 長三角地區(qū)粳稻主要抗稻瘟病基因的分析

分析發(fā)現(xiàn)(表5)，抗病種質(zhì)中攜帶基因Pib的最多，達55.8%，其次為攜帶基因Pita的種質(zhì)，占比46.2%，其余依次為Pikm、Pi2、Pikh、Pi9和Pi5。其中攜帶基因Pikm的種質(zhì)田間全部表現(xiàn)抗病，未發(fā)現(xiàn)感病種質(zhì)；攜帶Pita、Pi5和Pi2的種質(zhì)分別只發(fā)現(xiàn)1株感病，其余種質(zhì)均表現(xiàn)抗或中抗稻瘟病。雖然抗病種質(zhì)中攜帶基因Pib的最多，但感病種質(zhì)比例達15.4%；攜帶Pi9和Pikh的種質(zhì)感病比例分別有17.2%和15.3%。因此，可以將Pita、Pi5、Pi2和Pikm作為首選抗稻瘟病基因，通過高效分子聚合育種技術(shù)選育出適合長三角地區(qū)種植推廣的優(yōu)質(zhì)粳稻新品種。攜帶Pib、Pi9和Pikh的水稻種質(zhì)感病比例相對較高，因此這3個抗稻瘟病基因不適宜應(yīng)用于長三角地區(qū)優(yōu)質(zhì)抗稻瘟病新品種的選育。

表4 52份水稻種質(zhì)稻瘟病抗性評價Table 4 Evaluation of blast resistance of 52 tested rice germplasms

圖2 8個抗稻瘟病基因在供試種質(zhì)的 分布情況Fig.2 The distribution of 8 blast resistance genes in the tested japonica rice germplasms

圖3 攜帶不同數(shù)目抗稻瘟病基因的種質(zhì)在 52份供試種質(zhì)中的占比Fig.3 The proportion of germplasms with different number of blast resistance genes in 52 tested germplasms

注：材料編號與表1一致。Note: The numbers are consistent with Table 1.圖4 52份供試水稻種質(zhì)的遺傳差異聚類分析Fig.4 ClusterinGAnalysis of genetic differences in 52 tested germplasms

表5 抗稻瘟病基因在供試水稻種質(zhì)中的抗性分布Table 5 Resistance distribution of blast resistance genes in tested rice germplasms /%

3 討論

生產(chǎn)實踐表明，通過抗稻瘟病基因分子聚合育種對防治稻瘟病效果顯著，但由于稻瘟病菌生理小種在我國不同稻區(qū)的分布具有多樣性，即使在同一稻區(qū)，不同年度間生理小種也存在差異；另一方面，稻瘟病菌的變異與分化速度快，新的生理小種層出不窮；隨著新的生理小種的產(chǎn)生，只攜帶1個抗病基因的品種將會逐漸喪失抗病性，因此稻瘟病的危害持續(xù)發(fā)生。準確掌握本稻區(qū)稻瘟病菌群體組成及生理小種變化的動態(tài)趨勢，有利于開展針對性的抗稻瘟病育種工作。研究發(fā)現(xiàn)，生理小種ZG1是江蘇省的絕對優(yōu)勢小種，其次為ZB，并且年度間較為穩(wěn)定[34-35]。近兩年，江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保所在全省采集的樣品中發(fā)現(xiàn)，ACE1、PWL1和Avr-Pita等共10個稻瘟病菌無毒基因在江蘇省均有分布，頻率最高的為Avr-Pib，連續(xù)5年擴增頻率較高且穩(wěn)定遺傳的有Avr-Pib、Avr-Pik、Avr-Pizt[36]。 本研究利用該研究所2019年分離的6個代表性優(yōu)勢病菌小種對52份水稻種質(zhì)資源進行穗頸瘟接種鑒定，結(jié)合分子標記檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基因Pita對這6個小種表現(xiàn)的抗性最好，其次為Pikm、Pi2和Pi5。說明在這6個代表性小種流行的長三角地區(qū)，Pita、Pikm、Pi2和Pi5這4個抗稻瘟病基因發(fā)揮著主要作用，尤其Pita基因在供試種質(zhì)資源中占50%，攜帶該基因的抗病種質(zhì)資源占比達46.2%，充分說明了該基因?qū)@6個小種的抗病優(yōu)勢。

Pigm是一個廣譜且持久的稻瘟病抗性基因，來自秈稻品種谷梅4號，該基因含有2個典型的R基因，其中PigmR可導(dǎo)致水稻千粒重降低，產(chǎn)量下降，PigmS可提高水稻結(jié)實率，從而抵消PigmR對水稻產(chǎn)量的影響[37]。目前Pigm相關(guān)功能標記的開發(fā)及育種應(yīng)用工作已逐步開展，陳濤等[38]開發(fā)了可以檢測到該基因的特異性分子標記T-Pigm和K-pigm，并應(yīng)用于育種實踐；曾生元等[39]開發(fā)了該基因的特異分子標記Pigm-4， 并應(yīng)用于粳稻穗頸瘟抗性育種；賴怡帆等[40]利用分子標記選擇Pigm基因改良湘晚秈13號的稻瘟病抗性。Pigm基因來源于秈稻品種，長三角地區(qū)粳稻材料普遍不攜帶此基因，因此在本研究的供試種質(zhì)中尚未鑒定出攜帶Pigm基因的材料，但是該基因具有廣譜持久抗稻瘟病的特性，因此在今后長三角優(yōu)質(zhì)抗稻瘟病育種研究中，也需重點利用該基因。

利用8個抗稻瘟病基因功能標記對52份水稻種質(zhì)進行聚類分析的結(jié)果表明，第4類中第Ⅰ小類的12份種質(zhì)均含有3～4個抗病基因，接種抗性鑒定均達到R級；該類中8個種質(zhì)均為浙江省嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院在長期通過稻瘟病菌高壓篩選策略下培育成功的粳稻品種或衍生品系，試驗結(jié)果與該類品種在生產(chǎn)上表現(xiàn)高抗稻瘟病的實際相吻合。由此可見，在今后抗稻瘟病育種的雜交親本選擇配置的過程中，可根據(jù)本研究中抗稻瘟病基因鑒定和聚類分析的結(jié)果，并按照抗稻瘟病基因互補的原則進行；此外還應(yīng)注重開展Pita、Pi5、Pi2、Pikm和Pigm這5個基因中的雙基因或三基因間的聚合育種研究，使育成材料具有廣譜持久的稻瘟病抗性。

水稻與稻瘟病菌互作系統(tǒng)是植物-微生物互作研究的模式系統(tǒng)之一，植物抗病基因與無毒基因的互作關(guān)系符合經(jīng)典的基因?qū)驅(qū)W說。目前在稻瘟病病原菌中鑒定了與抗病基因?qū)?yīng)的24個無毒基因，其中已克隆12個[41]。但由于稻瘟病病原菌的遺傳背景復(fù)雜，易發(fā)生變異[42]，特別是在近兩年長三角地區(qū)連續(xù)出現(xiàn)稻瘟病流行大發(fā)生的形勢下，今后需要進一步根據(jù)長三角地區(qū)稻瘟病菌優(yōu)勢小種的鑒定結(jié)果，利用優(yōu)勢小種菌株持續(xù)對長三角地區(qū)育成的各類新種質(zhì)進行接種鑒定并評價其抗性，針對病原菌的變化及時調(diào)整利用與其無毒基因互作的抗病基因，可在較大程度上避免因病原菌生理小種變化導(dǎo)致的水稻品種原有抗性的喪失。

4 結(jié)論

培育和推廣種植抗病品種是控制水稻稻瘟病危害最經(jīng)濟、環(huán)保、有效的措施。本研究結(jié)果表明，抗稻瘟病基因Pita、Pi5、Pi2、Pikm和Pigm在長三角地區(qū)抗稻瘟病粳稻的育種中具有重要應(yīng)用價值。后續(xù)需要從上述5個抗病基因中選擇2～3個互作效果好的抗病基因進行聚合育種，不斷增加接種稻瘟病生理小種的數(shù)量，及時調(diào)整接種鑒定的優(yōu)勢生理小種，從而進一步考察其抗病廣譜性和持久性，以期為長三角地區(qū)優(yōu)質(zhì)粳稻的安全生產(chǎn)提供有力保障。