脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；苌飳?duì)Raw264.7細(xì)胞的聯(lián)合毒性效應(yīng)研究

董燕婕 范麗霞 苑學(xué)霞 邵陽(yáng)陽(yáng) 王 磊 趙善倉(cāng)

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所/山東省食品質(zhì)量與安全檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 濟(jì)南 250100)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)是目前世界上分布最廣泛、影響較大的真菌毒素之一。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇屬B族單端孢霉烯族化合物，俗稱(chēng)嘔吐毒素，主要由禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)和黃色鐮刀菌(Fusariumculmorum)侵染小麥、大麥、玉米等糧食作物產(chǎn)生[1-2]。DON可引起頭暈、嘔吐、腹瀉等癥狀，長(zhǎng)期攝入會(huì)破壞免疫系統(tǒng)；DON還具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，可抑制蛋白質(zhì)的合成，造成DNA損傷[3-4]。DON經(jīng)植物或微生物代謝轉(zhuǎn)化后可形成隱蔽型毒素(mask mycotoxin)[1,5]，包括乙?；苌?如3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(3a-DON)、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(15a-DON)等。在某些情況下，農(nóng)產(chǎn)品或食品中隱蔽型毒素的含量可能超過(guò)原型的含量水平，而且一些隱蔽型毒素會(huì)在體內(nèi)代謝過(guò)程中重新轉(zhuǎn)化為DON，對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物健康造成潛在風(fēng)險(xiǎn)。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO)/世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)食品添加劑聯(lián)合專(zhuān)家委員會(huì)(Joint FAO/WHO ExperTCommittee on Food Additives，JECFA)認(rèn)為DON乙?；苌锏亩拘耘cDON相當(dāng)[6]。因此，JECFA將DON的每日耐受量(permissible tolerable daily intake, PMTDI)(1 μg·kg-1BW)更改為DON及其乙?；苌锏腜MTDI(1 μg·kg-1BW)。 我國(guó)也規(guī)定食品及飼料中DON、3a-DON和15a-DON的總量不得超過(guò)1 mg·kg-1[7]。研究表明，DON與其衍生型3a-DON、15a-DON共存于小麥、大麥、玉米等糧食作物及其副產(chǎn)品中[8-10]。因此，3a-DON和15a-DON的毒性和污染程度均需要重視。

目前已有大量關(guān)于DON毒性及其作用機(jī)理的研究報(bào)道，但針對(duì)DON以及其乙酰化衍生物的聯(lián)合毒性及其機(jī)理尚鮮見(jiàn)報(bào)道。不同毒素間的相互作用會(huì)直接影響其混合物對(duì)生物體毒性的強(qiáng)弱，從而產(chǎn)生不同的毒性作用反應(yīng)。研究表明，Raw264.7細(xì)胞與機(jī)體免疫功能相關(guān)，是評(píng)價(jià)DON暴露毒性的較為敏感的細(xì)胞模型；同時(shí)，DON具有抑制蛋白質(zhì)合成，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和趨化因子基因表達(dá)的能力[11]。因此，本研究以Raw264.7細(xì)胞為體外試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，探究DON、3a-DON、15a-DON的二元和三元混合對(duì)細(xì)胞存活率、活性氧(reactive oxygen species，ROS)和凋亡率的影響，采用復(fù)合指數(shù)法(combination index, CI)探討二元、三元的聯(lián)合作用效應(yīng)，以期為多種毒素混合污染的提供一定的借鑒與參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所；DMEM(dulbecco′s modified eagle medium)高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、無(wú)酚紅HBSS，購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；DON、3a-DON和15a-DON標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，CCK-8試劑盒、2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2′,7′-Dichlorofluorescent yellow diacetate,DCFH-DA)試劑盒、羅丹明123購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

CCL-170B-8 CO2培養(yǎng)箱，藝斯高(上海)貿(mào)易有限公司；Synergy HTX多功能微孔板酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek公司；VD-650-U超凈工作臺(tái)，美國(guó)Airtech公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與染毒

Raw264.7細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1.0%青霉素-鏈霉素)中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培育至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。用超純水溶解DON、3a-DON和15a-DON制成母液，使用前再用DMEM培養(yǎng)基稀釋至所需濃度的工作液。

1.4 細(xì)胞毒性測(cè)定方法

1.4.1 細(xì)胞存活率的測(cè)定 采用CCK-8法分別測(cè)定毒素單獨(dú)或混合處理對(duì)Raw264.7細(xì)胞活性的影響[12]，調(diào)整對(duì)數(shù)期細(xì)胞密度為3×104個(gè)·mL-1，每孔接種200 μL于96孔板中孵育24 h后，棄去培養(yǎng)液，加入含不同濃度DON、3a-DON、15a-DON的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，控制DON、3a-DON、15a-DON終濃度分別為0.090、0.180、0.375、0.750、1.500、3.000 μg·mL-1。 每孔中加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)在96孔板中孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定其在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。

根據(jù)細(xì)胞存活率試驗(yàn)結(jié)果確定單獨(dú)染毒的半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)，再根據(jù)IC50篩選出合適的DON、3a-DON、15a-DON單獨(dú)染毒及其聯(lián)合染毒的濃度。

1.4.2 細(xì)胞活性氧含量的測(cè)定 用氧化敏感熒光探針DCFH-DA(Beyotime)測(cè)定ROS的產(chǎn)生[13]。調(diào)整對(duì)數(shù)期細(xì)胞密度為5×105個(gè)/孔，接種于6孔板中，隨后用DON、3a-DON、15a-DON(0、0.18、1.50、3.00 μg·mL-1)單獨(dú)和聯(lián)合處理48 h。用無(wú)血清培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞，在10 μmol·L-1DCFH-DA中37℃孵育30 min。然后收集細(xì)胞用酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)二氯熒光黃(disperse fluorescent yellow，DCF)的熒光值(激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)521 nm)。

1.4.3 細(xì)胞線粒體膜透性的測(cè)定 調(diào)整對(duì)數(shù)期細(xì)胞密度為1×104個(gè)/孔，接種于96孔板，用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入5 μg·mL-1羅丹明123工作液，孵育30 min后，1 000 r·min-1離心10 min，用培養(yǎng)基洗一遍，1 000 r·min-1離心10 min后加入各濃度組的毒素作用24 h，測(cè)定熒光值，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算加藥組細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到的羅丹明123含量，判斷細(xì)胞內(nèi)線粒體通透性的變化[13]。

1.5 統(tǒng)計(jì)與分析

各種毒素的IC50值采用Graphpad Prism 6.01計(jì)算，DON、3a-DON和15a-DON間的相互作用類(lèi)型采用Chou-Talaly數(shù)學(xué)模型分析獲得?；旌衔锏穆?lián)合毒性類(lèi)型由CompuSyn(Chou and Martin, 2005, Compusyn Inc, USA)[14]軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DON、3a-DON和15a-DON單獨(dú)和聯(lián)合對(duì)Raw264.7細(xì)胞存活率的影響

圖1 DON、3a-DON和15a-DON單獨(dú)對(duì)Raw264.7存活率的影響Fig.1 Individual effect of DON, 3a-DON and 15a-DON on viability of Raw264.7 cell

在暴露24、48、72 h時(shí)，DON、3a-DON和15a-DON對(duì)Raw264.7細(xì)胞的毒性作用均呈現(xiàn)劑量依賴(lài)關(guān)系(圖1)。暴露24 h后，DON組細(xì)胞存活率由100%下降至9.94%，3a-DON組存活率由100%下降至24.11%，15a-DON組由100%下降到10.97%。根據(jù)濃度抑制率曲線可得DON、3a-DON、15a-DON作用細(xì)胞24、48、72 h后的IC50值(表1)。DON、3a-DON、15a-DON分別作用Raw264.7細(xì)胞24 h時(shí)，IC50依次為15a-DON(0.267 μg·mL-1)>DON(0.275 μg·mL-1)>3a-DON(1.806 μg·mL-1)；作用48和72 h時(shí)，不同毒素毒性作用差異與24 h類(lèi)似，且IC50值隨著培育時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)效應(yīng)。因此，對(duì)Raw264.7細(xì)胞的毒性效應(yīng)大小依次為15a-DON≈DON>3a-DON?；贑I指數(shù)法，CI>1表示拮抗作用；CI=1表示加和作用；CI<1表示協(xié)同作用。由此判斷，DON、3a-DON、15a-DON二元或三元聯(lián)合后的毒性效應(yīng)發(fā)現(xiàn)，二元或三元聯(lián)合后對(duì)Raw264.7細(xì)胞存活率的影響均高于單一毒素(表2)，相比于單一毒素組IC50的毒素劑量，二元或三元聯(lián)合作用在本試驗(yàn)濃度設(shè)置疊加范圍內(nèi)，表現(xiàn)出一定的協(xié)同作用。

表1 DON、3a-DON和15a-DON對(duì) Raw264.7的IC50值Table 1 Individual IC determinations of DON, 3a-DON and 15a-DON in Raw264.7 /(μg·mL-1)

表2 DON、3a-DON和15a-DON二元、三元混合對(duì) Raw264.7的IC50和CI值Table 2 Binary and ternary combined IC50 determinations and CI values of DON, 3a-DON and 15a-DON in Raw264.7

2.2 DON、3a-DON和15a-DON單獨(dú)和聯(lián)合對(duì)Raw264.7細(xì)胞活性氧的影響

由圖2可知，ROS濃度均隨著其毒素濃度的增加而增加，存在劑量依賴(lài)性。除0.18 μg·mL-1低濃度組外，各毒素刺激作用組的ROS濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。DON和15a-DON單獨(dú)作用對(duì)細(xì)胞ROS濃度的影響差異不顯著，但顯著高于3a-DON處理組(P<0.05)。DON、3a-DON和15a-DON誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生ROS的趨勢(shì)基本一致。DON、3a-DON和15a-DON二元或三元聯(lián)合的ROS濃度均分別大于相應(yīng)的單獨(dú)作用組，說(shuō)明多毒素同時(shí)存在時(shí)毒性作用增強(qiáng)。

注：不同小寫(xiě)字母表示同處理組不同濃度間在0.05水平差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Different lowercase letters aTThe top of the same treatment in differenTConcentration of mycotoxin indicated significant difference at 0.05 level . The same as following.圖2 DON、3a-DON和15a-DON單獨(dú)(A)和聯(lián)合(B)對(duì)Raw264.7活性氧的影響Fig.2 Individual (A) and combined (B) effects of DON, 3a-DON and 15a-DON on ROS content of Raw264.7 cell

2.3 DON、3a-DON和15a-DON單獨(dú)和聯(lián)合對(duì)Raw264.7細(xì)胞線粒體膜透性的影響

圖3反映了不同濃度的DON、3a-DON和15a-DON單獨(dú)以及聯(lián)合處理Raw264.7細(xì)胞24 h后線粒體膜透性的變化。與對(duì)照組相比，毒素處理組細(xì)胞線粒體膜透性增加，且隨著毒素濃度的增加而不斷增加，呈現(xiàn)出劑量依賴(lài)性(圖3-A)。引發(fā)細(xì)胞內(nèi)線粒體膜通透性轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)為15a-DON>DON>3a-DON。DON、3a-DON和15a-DON二元、三元聯(lián)合作用Raw264.7細(xì)胞24 h后(圖3-B)，細(xì)胞內(nèi)線粒體膜透性轉(zhuǎn)化組間差異不顯著(P>0.05)，但都大于相對(duì)應(yīng)的單獨(dú)染毒組。

圖3 真菌毒素DON DON、3a-DON和15a-DON對(duì)Raw264.7細(xì)胞線粒體膜通透性的影響Fig.3 Individual (A) and combined (B) effects of DON, 3a-DON and 15a-DON on Raw264.7 cell

3 討論

本研究探究了DON、3a-DON、15a-DON三種毒素單獨(dú)和聯(lián)合對(duì)Raw264.7細(xì)胞的毒性作用。結(jié)果表明，DON、3a-DON、15a-DON單獨(dú)或聯(lián)合作用均呈劑量、時(shí)間依賴(lài)關(guān)系，除低濃度外，均顯著降低了細(xì)胞活性。采用IC50值比較這3種毒素的毒性強(qiáng)弱，表現(xiàn)為15a-DON≈DON>3a-DON。DON、15a-DON和3a-DON對(duì)不同細(xì)胞模型的作用均呈現(xiàn)出劑量和時(shí)間關(guān)系，但I(xiàn)C50值略有不同。Juan-Garcia等[15]研究發(fā)現(xiàn)3a-DON和15a-DON作用于人肝癌細(xì)胞系HepG2時(shí)，毒性效應(yīng)為15a-DON>3a-DON。Pinton等[16]研究發(fā)現(xiàn)DON及其乙酰化衍生物對(duì)豬腸上皮細(xì)胞的毒性大小為15a-DON>DON>3a-DON。Yang等[17]評(píng)估了脫氧雪腐鐮刀菌醇家族真菌毒素DON、3a-DON、15a-DON對(duì)人胃上皮細(xì)胞GES-1細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果表明單一毒素對(duì)細(xì)胞的毒性作用為3a-DON<15a-DON

本研究發(fā)現(xiàn)，DON、15a-DON和3a-DON二元或三元聯(lián)合后在設(shè)置的濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)一定的協(xié)同作用。而Yang等[18]研究表明，DON+15a-DON僅在低和/或中度抑制濃度水平(IC10-IC70，IC10-IC80和IC10-IC40)對(duì)GES-1細(xì)胞表現(xiàn)為協(xié)同細(xì)胞毒性，在高濃度下呈現(xiàn)拮抗作用；Alassane-Kpembi等[19]研究表明，DON+15a-DON和15a-DON+3a-DON共同處理IPEC-1細(xì)胞時(shí)呈協(xié)同效應(yīng)，DON+3a-DON在高濃度時(shí)呈協(xié)同效應(yīng)。這可能是由于不同物種的細(xì)胞對(duì)不同毒素的代謝和受體/通路存在差異。

當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ROS濃度超過(guò)其抗氧化能力時(shí)，易產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)[20]。DON、15a-DON和3a-DON單一或組合作用后均提高了細(xì)胞活性氧濃度和細(xì)胞線粒體膜通透性[21]，這與本研究結(jié)果相似。研究表明，在多種體外模型試驗(yàn)中氧化應(yīng)激在DON誘導(dǎo)的毒性中起主要作用[22-25]。這可能是由于毒素刺激引發(fā)ROS的大量產(chǎn)生，細(xì)胞發(fā)生氧化損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，線粒體膜完整性被損壞，使得線粒體膜通透性增加[26]。該結(jié)果再一次印證了DON誘導(dǎo)的毒性作用可能是由ROS和線粒體應(yīng)激反應(yīng)信號(hào)共同作用、相互影響的結(jié)果[27-28]。

4 結(jié)論

本研究表明，DON及其乙?；苌锞档土薘aw264.7細(xì)胞的活性，提高了細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量和細(xì)胞膜的通透性，且DON和15a-DON的毒性相當(dāng)，均高于3a-DON。DON及其衍生物二元、三元聯(lián)合后呈協(xié)同作用，毒性顯著增強(qiáng)，因此在評(píng)價(jià)DON與其乙酰化衍生物混合污染的風(fēng)險(xiǎn)時(shí)需考慮其協(xié)同效應(yīng)。但是目前DON及其乙?；苌锫?lián)合作用的毒性機(jī)制尚不清楚，仍需進(jìn)一步探究其作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路，為評(píng)估DON及其乙酰化衍生物的多殘留聯(lián)合毒性機(jī)制和制定限量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。