過表達野生大豆S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因GsSAMS提高水稻耐鹽堿性

才曉溪 沈 陽 胡冰霜 王 研 陳 悅 孫明哲 賈博為 孫曉麗

(黑龍江八一農(nóng)墾大學農(nóng)學院作物逆境分子生物學實驗室，黑龍江 大慶 163319)

土壤鹽堿化嚴重制約了作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，高鹽與高pH環(huán)境會破壞植物細胞和組織內(nèi)外的離子穩(wěn)態(tài)與滲透平衡，從而抑制植物生長發(fā)育。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國共有鹽堿地9 913萬公頃，占我國土地總面積的10%，其中，東北地區(qū)鹽堿地總面積達766萬公頃[1]。開發(fā)利用鹽堿地等中低產(chǎn)田，是保證我國農(nóng)業(yè)持續(xù)高效發(fā)展和糧食安全的重要舉措。其中，利用分子標記輔助育種、基因編輯等分子育種技術(shù)培育耐鹽堿作物新品種，是鹽堿地資源開發(fā)利用的重要途徑[2]。

S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosyl-L-methionine synthetase，SAMS)以L-甲硫氨酸為底物，ATP提供能量，催化S-腺苷甲硫氨酸合成[3]。S-腺苷甲硫氨酸是甲硫氨酸的活性形式，在動植物體內(nèi)廣泛存在，是生物體內(nèi)各種生理生化反應(yīng)過程中主要的甲基供體[4]。研究表明SAMS在植物響應(yīng)逆境中具有非常重要的作用[5-7]，其中鹽脅迫會誘導番茄幼苗[8]和人參[9]SAMS基因的表達；黃瓜CsSAMs[10]和鹽地堿蓬SsSAMS2[11]在煙草中過表達，可提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性。但目前關(guān)于SAMS基因的研究多集中于鹽脅迫下的表達檢測和模式植物煙草中的耐鹽功能驗證，對SAMS基因調(diào)控作物耐鹽堿性的相關(guān)研究較少。

野生大豆(GlycinesojaL.)在我國分布廣、種類多，具有極強的耐鹽堿能力，是應(yīng)用于耐鹽堿基因挖掘的重要資源。本研究前期已從野生大豆中克隆出多個耐鹽堿作用顯著的功能基因[12]，其中包括S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因GsSAMS，利用過表達技術(shù)確定GsSAMS可通過提高抗氧化物酶活性提高豆科植物的鹽堿脅迫耐受性[13-14]。鑒于GsSAMS優(yōu)異的耐鹽堿功能，本研究將其在單子葉植物水稻中過量表達，通過對比野生型和轉(zhuǎn)基因水稻在鹽堿處理下的表型、形態(tài)、生理指標以及相關(guān)基因表達，分析GsSAMS對水稻耐鹽堿脅迫耐受性的作用。探究GsSAMS在不同物種中的耐鹽堿普適性，同時培育耐鹽堿水稻新材料，對鹽堿地的開發(fā)利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗選用的水稻品種為農(nóng)豐1701，由黑龍江八一農(nóng)墾大學水稻中心自主培育，轉(zhuǎn)基因水稻使用T2代純合株系，于2019年進行鹽堿脅迫表型分析。大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌EHA105菌株和植物載體pCAMBIA130035SU由黑龍江八一農(nóng)墾大學作物逆境分子生物學實驗室保存。

1.2 GsSAMS基因的植物超量表達載體構(gòu)建

采用USER克隆[15]引物5′-GGC TT AA U GGCAGAGACATTCCT-3′和5′-GGTTT AA U T AGGCCTTC TCC CA-CT-3′擴增GsSAMS基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)(coding sequence, CDS)序列。PCR總反應(yīng)體系15 μL，包括2× Easy Taq PCR Super Mix 7.5 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.3 μL，ddH2O 4.9 μL以及野生大豆cDNA 2 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；72℃終延伸10 min。擴增產(chǎn)物與PacⅠ及Nt.BbvcⅠ消化的pCAMBIA130035SU片段連接構(gòu)建栽體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，PCR鑒定陽性菌落并送交Thermo公司(北京)測序。

1.3 GsSAMS對水稻的遺傳轉(zhuǎn)化

將構(gòu)建的GsSAMS過表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，并利用農(nóng)桿菌介導法對水稻愈傷組織進行遺傳轉(zhuǎn)化[16]。將飽滿的、無菌斑的成熟水稻種子消毒后平鋪于水稻愈傷誘導培養(yǎng)基上(營養(yǎng)瓊脂，nutrient broth, NB, pH值5.8)，28℃條件下暗培養(yǎng)，誘導愈傷組織。挑選黃色顆粒狀愈傷組織依次轉(zhuǎn)接入繼代培養(yǎng)基(NB，pH值5.8)、共培養(yǎng)培養(yǎng)基(NB+20 mg·L-1乙酰丁香酮，pH值5.2)、篩選培養(yǎng)基(NB+15 mg·L-1固殺草+100 mg·L-1阿莫西林克拉維酸鉀，pH值5.8)中，篩選獲得的抗性苗轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基(Murashige and skoog, MS+100 mg·L-1阿莫西林克拉維酸鉀，pH值5.8)中，得到T0代植株。繁種后收獲T1代種子，本研究使用的是T3代純合轉(zhuǎn)基因水稻種子。

1.4 抗性植株分子生物學檢測

PCR檢測：水稻葉片基因組DNA的試劑盒提取方法參照AxyPrepTMGenomic DNA purification(Axygen，杭州)說明。使用與35S啟動子匹配的上游引物F(5′-AT AAGGA-AGTTCATT TCATTTGGA-3′)和GsSAMS基因特異的下游引物R(5′-AGCACC-CCATCCTCCAT AAGT-3′)作為PCR檢測引物。以基因組DNA為模板，進行PCR擴增(同時設(shè)置水對照、陽性對照和野生型對照)，然后進行瓊脂糖凝膠電泳觀察擴增結(jié)果。

半定量PCR(reverse transcription polymerose chain reaction, RT-PCR)檢測：PCR陽性植株總RNA采用Trizol (Thermo，北京)試劑法提取，經(jīng)gDNA wiper (Vazyme，南京)清除基因組DNA。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA利用唯贊公司(南京)試劑盒HiScript Ⅲ RT SuperMix完成。設(shè)計基因特異上游引物5′-CAATGGTGCC-AGGGTTCCT ATTC-3′和下游引物5′-AGCACC CCATCCTCCAT AAGT-3′，其中內(nèi)參基因Osa-Elf1-α的引物為5′-GCACGCTCTTCTTGCTTTCAC-3′和5′-TC TTGT-CAGGGTTGT AGCCGAC-3′。PCR擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.5 水稻幼苗期耐鹽堿性分析

將野生型和純合轉(zhuǎn)基因株系水稻種子浸泡發(fā)芽至破胸露白，將種子移植到營養(yǎng)土中，于人工氣候室(25℃、相對濕度70%、光照14 h/黑暗10 h)培養(yǎng)至三葉期。選取長勢一致的水稻幼苗，分別用含有0(對照組)和200 mmol·L-1NaHCO3(pH值8.4)(試驗組)的溶液澆灌進行鹽堿脅迫處理15 d，每個處理設(shè)置3個獨立的生物學重復，每個生物學重復中每個株系不少于60株水稻苗。持續(xù)觀察植株生長狀態(tài)，并在第15天測定存活率和相對含水量，存活率=存活株數(shù)/總株數(shù)×100%，相對含水量=(鮮重-干重)/鮮重×100%。

1.6 鹽堿脅迫下抗氧化酶活性測定

將野生型和純合轉(zhuǎn)基因株系水稻種子浸泡發(fā)芽，待地上部分約2 cm時移至含有Yoshida營養(yǎng)液(pH值5.5～5.8)的96孔水培盒里，于人工氣候室培養(yǎng)，其間每2 d換1次營養(yǎng)液。挑選長勢一致的三葉期幼苗每組各30株，轉(zhuǎn)移至含有0(對照)和40 mmol·L-1NaHCO3的溶液中進行鹽堿脅迫處理。分別在處理前和處理3 h后，取水稻幼苗相同部位的葉片，采用紫外分光光度法測定過氧化氫酶(catalase, CAT)[17]和過氧化物酶(peroxidase, POD)[18]活性。每個指標均測定全部樣本。

1.7 鹽堿脅迫相關(guān)基因表達水平檢測

挑選長勢一致的三葉期轉(zhuǎn)基因和野生型水稻幼苗，用0(對照)、40 mmol·L-1NaHCO3溶液處理3和12 h，取相同部位相同長度水稻葉片，迅速置于液氮速凍，于-80℃保存?zhèn)溆?。提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用試劑盒TransStart?Top Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech，北京)于實時熒光定量PCR儀CFX96 Touch (BioRad，英國)上進行實時熒光定量PCR (quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測。所用基因特異引物序列如下：OsM6PR1-sense：5′-TTGG GATCGTGTGAAC TTGA-3′，anti-sense：5′-CAGAAGCGCAAAT ACACGAA-3′；OsNAC5-sense：5′-ACAACGCCCTCAGGTTGGATGA-3′，anti-sense：5′-TCGT ACCTC TCGATCAC TCCCTTC-3′；OsPOX1-sense：5′-CATCC CAGC TCC-CAACAA-3′，anti-sense：5′-AGACATGCCAATGGTGTGG-3′。

2 結(jié)果與分析

2.1 GsSAMS基因植物超量表達載體構(gòu)建

采用pCAMBIA130035SU作為GsSAMS植物超量表達載體，該載體含有潮霉素(Hygromycin, Hyg)植物選擇標記基因，以組成型啟動子CaMV35s驅(qū)動GsSAMS基因表達(圖1-A)。采用基因特異引物PCR擴增獲得長度為1 178 bp 的目的條帶(圖1-B)，PCR產(chǎn)物經(jīng)USER酶切后，與經(jīng)PacⅠ及Nt.Bbvc Ⅰ線性化處理的pCAMBIA130035SU連接，經(jīng)菌落PCR鑒定獲得陽性克隆pC35SU-GsSAMS(圖1-C)，用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化。

注：A：GsSAMS 植物超量表達載體示意圖；B：GsSAMS基因的克??；M：DNA Marker；1～4：GsSAMS PCR產(chǎn)物；C：pC35SU-GsSAMS植 物表達載體的菌落PCR鑒定；M：DNA Marker；-：陰性 H2O 對照；+：陽性質(zhì)粒對照；5: pC35SU-GsSAMS。Note: A: Representation of the GsSAMS overexpression vector. B: Gene clone of GsSAMS. M: DNA Marker. 1-4: PCR product of GsSAMS. C: PCR identification of recombinant E.coli clones harborinGThe pC35SU-GsSAMS construct. M: DNA Marker. -: Negative H2O control. +: Positive plasmid control. 1: PCR products of the pC35SU-GsSAMS clone.圖1 GsSAMS植物超量表達載體的構(gòu)建Fig.1 Construction of the GsSAMS overexpression vector

2.2 水稻遺傳轉(zhuǎn)化及抗性植株分子生物學檢測

采用分農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化粳稻農(nóng)豐1701，獲得Hyg抗性苗21株，隨機選擇10株(#1～#10)進行PCR檢測。結(jié)果顯示，抗性植株均能擴增出1 178 bp的特異性條帶，而在野生型對照(WT)中未檢測到條帶(圖2)。對PCR陽性植株(#1～#4)進行半定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過23個循環(huán)，內(nèi)參基因均擴增出條帶；經(jīng)過30個循環(huán)，野生型未能擴增出條帶，而GsSAMS轉(zhuǎn)基因水稻中可檢出目的條帶(圖3)，表明GsSAMS基因已整合到水稻基因組中，并可以正常轉(zhuǎn)錄。

注：M：DNA標記；+：陽性質(zhì)粒對照； -：陰性 H2O 對照； WT：野 生型對照；#1～#10：獨立株系。下同。Note: M: DNA Marker. -: Negative H2O control. +: Positive plasmid control. WT: Wild type control. #1～#10: Hyg resistant seedlings. The same as following.圖2 轉(zhuǎn)GsSAMS基因抗性植株P(guān)CR檢測Fig.2 PCR detection of resistant plants transformed with GsSAMS

圖3 轉(zhuǎn)GsSAMS基因植株RT-PCR檢測Fig.3 RT-PCR analysis of GsSAMS transgenic rice

2.3 GsSAMS轉(zhuǎn)基因水稻耐鹽堿性分析

為確定GsSAMS基因是否影響水稻耐鹽堿性，將三葉期的野生型和GsSAMS表達水平相近的兩個株系(#2和#4)進行200 mmol·L-1NaHCO3處理。對照組(0 mmol·L-1)中GsSAMS-OX轉(zhuǎn)基因水稻長勢與野生型無明顯差異，說明GsSAMS基因的插入并未影響水稻正常生長。而經(jīng)200 mmol·L-1NaHCO3處理后，GsSAMS-OX株系生長狀況明顯優(yōu)于野生型(圖4-A)，具體表現(xiàn)為野生型植株葉片和莖部嚴重萎蔫、黃化，而GsSAMS-OX株系葉尖和莖部失水程度較低。存活率統(tǒng)計結(jié)果顯示，經(jīng)200 mmol·L-1NaHCO3處理后，兩個GsSAMS-OX株系的存活率分別為90%和94%，顯著高于野生型(18%)(圖4-B)，同時轉(zhuǎn)基因水稻地上部分相對含水量(65%、67%)也顯著高于野生型(50%)(圖4-C)。說明GsSAMS基因過表達提高了轉(zhuǎn)基因水稻的耐鹽堿性。

2.4 GsSAMS轉(zhuǎn)基因水稻抗氧化物酶活性分析

注：A：NaHCO3處理后各株系生長狀態(tài)；B：NaHCO3處理后存活率；C：NaHCO3處理后相對含水量；*表示同處理條件下不同株系在 P<0.05水平上差異顯著; **表示在P<0.01水平上差異顯著；***表示在P<0.001水平上差異顯著(n=20)。下同。Note: A: Phenotype of WT and transgenic rice seedlings treated with NaHCO3. B: Survival rates of WT and transgenic rice seedlings treated with NaHCO3. C: Relative water contents of WT and transgenic rice seedlings treated with NaHCO3. * significantly different among different lines under same treatment at 0.05 level. ** significantly different at 0.01 level. *** significantly different at 0.001 level (n=20). The same as following.圖4 GsSAMS轉(zhuǎn)基因水稻幼苗期耐鹽堿性分析Fig.4 Analysis of salt-alkaline tolerance in the seedling stage of GsSAMS transgenic rice

對野生型和GsSAMS-OX轉(zhuǎn)基因水稻進行NaHCO3處理，測定處理前后POD和CAT的活性。圖5結(jié)果顯示，對照組中GsSAMS-OX與野生型植株的POD、CAT活性無顯著差異，脅迫處理后POD、CAT活性均有不同程度的提高，但轉(zhuǎn)基因株系酶活性顯著高于野生型。

2.5 GsSAMS轉(zhuǎn)基因水稻鹽堿脅迫相關(guān)基因表達分析

為進一步探究GsSAMS基因調(diào)控水稻耐鹽堿性的作用方式，利用qRT-PCR分析了野生型和GsSAMS-OX轉(zhuǎn)基因水稻處理前后相關(guān)基因的表達水平，如圖6所示。對照組中，OsPOX1和OsNAC5在野生型和轉(zhuǎn)基因株系中的表達量無明顯差異。經(jīng)40 mmol·L-1NaHCO3處理后，OsPOX1、和OsM6PR1在野生型和GsSAMS-OX轉(zhuǎn)基因株系中表達均上調(diào)，但GsSAMS-OX株系中的表達量顯著高于野生型；而OsNAC5的表達量雖然也發(fā)生上調(diào)，但只在#4轉(zhuǎn)基因株系中顯著高于野生型，#2較野生型不顯著，可能由于#4株系的GsSAMS表達量高于#2株系。

圖6 鹽堿處理相關(guān)基因在WT和GsSAMS-OX轉(zhuǎn)基因株系中的相對表達量Fig.6 The relative expression of salt-alkaline responsive genes in WT and GsSAMS-OX transgenic lines

3 討論

鹽堿逆境嚴重影響了我國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，因此發(fā)掘耐鹽堿作物對鹽堿地資源開發(fā)有重要意義。目前有研究表明，植物可通過提高抗氧化酶活性、選擇性吸收離子以及誘導抗鹽堿相關(guān)基因的表達來應(yīng)對脅迫傷害[19-21]。S-腺苷甲硫氨酸合成酶SAMS是合成生化反應(yīng)中甲基供體的關(guān)鍵酶，在植物逆境響應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。前期研究中發(fā)現(xiàn)，野生大豆GsSAMS基因表達受鹽堿脅迫誘導，從中克隆出GsSAMS基因，并對苜蓿和大豆進行了遺傳轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)該基因過表達提高了雙子葉豆科植物的鹽堿脅迫耐受性[14,22]。但對GsSAMS基因能否調(diào)控單子葉植物的鹽堿脅迫耐受性卻鮮見報道。Ma等[23]發(fā)現(xiàn)，甜菜BvM14-SAMS2超量表達的轉(zhuǎn)基因擬南芥可通過提高抗氧化物酶的活性，幫助清除植物體內(nèi)積累的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，從而應(yīng)對鹽脅迫。本研究結(jié)果表明，GsSAMS轉(zhuǎn)基因水稻經(jīng)NaHCO3處理后存活率明顯優(yōu)于野生型，POD和SOD酶活性也顯著提高。研究發(fā)現(xiàn)，水稻抗氧化酶基因OsPOX1在干旱和鹽脅迫下表達顯著上調(diào)，可增強ROS清除能力[24]。本研究分析發(fā)現(xiàn)，GsSAMS超量表達同樣可以提高鹽堿脅迫下OsPOX1基因的表達，表明GsSAMS基因可能通過提高過氧化物酶(peroxidase stain，POX)活性，參與水稻ROS清除途徑。OsM6PR1是參與甘露醇代謝的關(guān)鍵基因，其表達受干旱和鹽脅迫的誘導[25]。本研究結(jié)果表明鹽堿脅迫處理后GsSAMS-OX轉(zhuǎn)基因水稻株系中OsM6PR1基因的表達顯著高于野生型，說明GsSAMS基因還可能參與鹽堿脅迫下植物體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)過程。SAMS基因被證明是脫落酸(abscisiCAcid, ABA)脅迫的正調(diào)控因子，其在擬南芥中的超量表達可增強ABA耐性，并提高ABA誘導的逆境相關(guān)基因的表達[26]。大量研究表明，OsNAC5轉(zhuǎn)錄因子是ABA依賴的逆境信號應(yīng)答途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[27-28]，本研究發(fā)現(xiàn)鹽堿脅迫處理后GsSAMS-OX轉(zhuǎn)基因水稻株系中OsNAC5基因的表達顯著上調(diào)(圖6-C)。這些結(jié)果暗示GsSAMS可能影響水稻堿脅迫下ABA信號通路關(guān)鍵基因的表達。本研究通過分析GsSAMS基因提高水稻的耐鹽堿性，為揭示該基因調(diào)控鹽堿脅迫應(yīng)答機制奠定了重要基礎(chǔ)，同時也為通過種植耐鹽堿水稻以及開發(fā)利用鹽堿地提供了新材料。

4 結(jié)論

本研究獲得的GsSAMS轉(zhuǎn)基因水稻經(jīng)鹽堿脅迫處理后，存活率、相對含水量顯著高于野生型，表明GsSAMS基因過表達提高了轉(zhuǎn)基因水稻的耐鹽堿性；轉(zhuǎn)基因水稻POD和CAT酶活性顯著高于野生型，表明可能通過抗氧化系統(tǒng)提高水稻耐鹽堿性；OsPOX1、OsNAC5和OsM6PR1的表達量在轉(zhuǎn)基因水稻中上調(diào)，表明GsSAMS可能影響堿脅迫下水稻ABA信號轉(zhuǎn)導、氧化還原、離子滲透等通路中相關(guān)基因的表達。本研究后續(xù)將展開農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量性狀調(diào)查，以全面評估GsSAMS在提高水稻耐鹽堿性中的應(yīng)用潛力。