食管癌患者根治手術(shù)前后外周血中GATA3、Foxp3 mRNA的表達(dá)及其意義

姬宇宙 薛 霞 范文強(qiáng)

食管癌指食管鱗狀上皮或腺上皮異常增生導(dǎo)致的惡性消化道腫瘤，發(fā)病率、死亡率均較高[1]。如今，食管癌的治療方式主要通過外科切除術(shù)和放療，放療雖能清除腫瘤細(xì)胞，但也會消滅部分正常細(xì)胞，導(dǎo)致患者免疫功能下降[2]。細(xì)胞免疫是抗腫瘤免疫里重要的一部分，外周血Th1、Th2兩類細(xì)胞因子中，機(jī)體抗腫瘤效應(yīng)以Th1為主，而腫瘤患者大多呈現(xiàn)Th2漂移。因此，逆轉(zhuǎn)Th2漂移是當(dāng)前的研究熱點。GATA結(jié)合蛋白3(GATA-binding protein-3,GATA3)是Th2轉(zhuǎn)錄因子，特異性表達(dá)于Th2細(xì)胞；叉頭蛋白p3(Forkhead box protein p3,Foxp3)屬于轉(zhuǎn)錄因子Fox家族，通過與DNA特定位點結(jié)合，調(diào)節(jié)目的基因表達(dá)。有研究報道[3-4]，F(xiàn)oxp3在肺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌等癌癥中高表達(dá)，然而其與食管癌的相關(guān)研究較為少見。因此，本研究對比食管癌根治手術(shù)前后患者外周血GATA3、Foxp3 mRNA表達(dá)，分析其意義，為食管癌的腫瘤免疫治療提供較新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2016年3月至2019年7月本院收治的196例食管癌患者為病例組，另選同期的60例體檢健康者作為正常組。病例組男性126例、女性70例，平均年齡(55.64±12.08)歲，體質(zhì)量(23.07±1.45)kg/m2，手術(shù)方式：經(jīng)右胸、上腹切口食管切除79例、經(jīng)左胸食管切除50例、腹腔鏡游離食管+胃食管左經(jīng)部吻合32例、腹腔鏡游離胃+右側(cè)開胸游離食管35例。正常組男性39例、女性21例，平均年齡(55.07±14.11)歲，體質(zhì)量(22.68±1.12)kg/m2。2組年齡、性別、體質(zhì)量一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合臨床上食管癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；經(jīng)病理檢查確診。②均在本院接受手術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②手術(shù)不耐受；③曾有放、化療手術(shù)史；④臨床病歷資料不全。

1.2 方法

1.2.1 流式細(xì)胞儀檢測 分別于手術(shù)前抽取所有入組者、手術(shù)后1周抽取患者外周血5 ml送至本院檢驗科，加入5 ml外周血淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)(上海索寶生物科技公司)于15 ml離心管，將5 ml外周血用肝素抗凝后緩慢加至離心管，使用低速離心機(jī)(中科中佳,SC-3616)于室溫中1500 r/min離心20 min，將單核細(xì)胞層吸出移至新的15 ml離心管，即為外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。用3支流式細(xì)胞儀試管分別按CD3、CD4標(biāo)記，再用1 ml 重懸細(xì)胞(PBS)清洗已獲得的PBMC細(xì)胞2～3次，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/ml，將其分為3組，每組100 μl，加入鼠抗人CD3-FITC抗體、鼠抗人CD4-FITC抗體(美國Biolegend公司)各5 μl混勻，室溫下避光孵育20 min，加入200 μl紅細(xì)胞裂解液(美國Beckman Couter公司)，加入2 ml PBS，1500 r/min離心5 min，舍棄上清液，加入0.5 ml PBS，通過流式細(xì)胞儀(美國BD,BD Verse型)檢測CD3+、CD4+T細(xì)胞比例。

1.2.2 定量PCR檢測[6]依據(jù)GeneBank提供的目的基因GATA3、Foxp3 mRNA序列和內(nèi)參基因β-actin序列設(shè)計引物，術(shù)前取所有入組者、術(shù)后1周抽取患者的抗凝靜脈血3～4 ml，加入2 ml淋巴細(xì)胞分離液混勻，使用離心機(jī)于室溫中1500 r/min離心20 min，將分離出的淋巴細(xì)胞層用吸管吸出，置入離心管，生理鹽水清洗使其裂解，提取RNA，行逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后，由系統(tǒng)將擴(kuò)增曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，結(jié)合內(nèi)參基因計算樣本GATA3、Foxp3基因表達(dá)拷貝數(shù)，全部標(biāo)本均重復(fù)檢測3次，取其平均值，結(jié)果換算為拷貝數(shù)/μgRNA。

1.2.3 臨床病理資料 病理組織標(biāo)本為患者行根治術(shù)術(shù)中切取的食管癌組織，經(jīng)液氮冷凍保存。通過查閱病例，收集并整理食管癌患者的臨床病理資料，包括患者年齡、臨床分期[7]、病理分級、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。

1.3 預(yù)后隨訪分析

隨訪時間為1年，通過門診方式隨訪，術(shù)后1個月隨訪1次，全部食管癌患者定期隨訪至2020年7月或至疾病進(jìn)展。統(tǒng)計分析中位生存期及1年生存率，生存期為入組至末次隨訪日或死亡，以月為單位，已死亡者當(dāng)作完全數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 2組GATA3、Foxp3 mRNA以及CD3+、CD4+T細(xì)胞水平比較

病例組手術(shù)前、手術(shù)后和正常組的GATA3、Foxp3 mRNA及CD3+、CD4+T細(xì)胞水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中病例組手術(shù)前的GATA3、Foxp3 mRNA水平高于手術(shù)后1周和正常組，CD3+、CD4+T細(xì)胞水平低于手術(shù)后1周和正常組(P<0.05)，病例組手術(shù)后1周與正常組的GATA3、Foxp3 mRNA、CD3+、CD4+T細(xì)胞水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 2組GATA3、Foxp3 mRNA以及CD3+、CD4+T細(xì)胞水平比較

2.2 食管癌患者術(shù)前外周血中GATA3 mRNA、Foxp3

mRNA的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

結(jié)果顯示，不同TNM分期、病理分級、腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管癌患者術(shù)前GATA3 mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；不同年齡、性別、CD3+、CD4+T細(xì)胞表達(dá)水平的食管癌患者術(shù)前GATA3 mRNA表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。不同TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管癌患者術(shù)前Foxp3 mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；不同年齡、性別、病理分級、腫瘤大小、CD3+、CD4+T細(xì)胞表達(dá)水平的食管癌患者術(shù)前Foxp3 mRNA表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 食管癌患者術(shù)前外周血中GATA3 mRNA、Foxp3 mRNA表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 食管癌患者預(yù)后單因素分析

196例患者全部隨訪，死亡29例，存活167例，1年生存率為85.20%，中位生存期為8.21個月(95%CI：5.727～11.335)。不同TNM分期、病理分級、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、GATA3、Foxp3 mRNA表達(dá)的食管癌患者1年生存率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；不同年齡、性別、CD3+、CD4+T細(xì)胞表達(dá)水平的食管癌患者1年生存率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 食管癌患者預(yù)后單因素分析

2.4 食管癌患者預(yù)后多因素分析

利用Cox回歸模型對篩選出的6個因素(TNM分期、病理分級、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、GATA3、Foxp3 mRNA表達(dá))進(jìn)行多因素分析。以影響食管癌患者1年疾病進(jìn)展為自變量，上述6個因素為因變量，賦值情況：TNM分期(Ⅰ期=0，Ⅱ期=1，Ⅲ期=2)，病理分級(高分化=0，中分化=1，低分化=2)，腫瘤大小(<4 cm=0，≥4 cm=1)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(無=0，有=1)，GATA3表達(dá)(低表達(dá)=0，高表達(dá)=1)、Foxp3表達(dá)(低表達(dá)=0，高表達(dá)=1)。結(jié)果表明，TNM分期(RR=1.610)、Foxp3高表達(dá)(RR=1.473)是影響食管癌患者1年疾病進(jìn)展的獨立因素，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 食管癌患者預(yù)后多因素分析

3 討論

食管癌在我國屬于高發(fā)的惡性疾病，且大多數(shù)是鱗癌[8]，而研究基本一致認(rèn)為食管癌的病情發(fā)展是一個多因子影響的過程[9-10]。雖然食管癌的治療方式較多，如切除術(shù)、放療、化療、內(nèi)鏡治療等，然而目前的生存率一直不高[11]。最近幾年，腫瘤免疫成為食管癌治療的一個新突破口，其在食管癌的應(yīng)用受到國內(nèi)外學(xué)者的重視。由于腫瘤細(xì)胞表面存在腫瘤抗原，機(jī)體免疫系統(tǒng)可識別并產(chǎn)生免疫反應(yīng)，然后排斥腫瘤。而機(jī)體免疫功能在腫瘤前期并未表現(xiàn)出明顯的下降，因為局部腫瘤在前期由于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制機(jī)體的免疫效應(yīng)，進(jìn)而腫瘤逃逸機(jī)體的免疫監(jiān)視。而有報道發(fā)現(xiàn)[12]，在腫瘤逃避免疫效應(yīng)的過程中，除了正性刺激信號外，另外存在負(fù)性刺激信號，其中包括免疫球蛋白超家族成員，能與T細(xì)胞表面的細(xì)胞弱化因子結(jié)合，傳遞負(fù)性刺激信號，抑制T細(xì)胞活化、增殖。目前關(guān)于食管癌中GATA3、Foxp3基因表達(dá)的相關(guān)報道較少見，研究尚未成熟，本研究通過測定食管癌患者GATA3、Foxp3 mRNA表達(dá)水平，分析其臨床意義，為食管癌腫瘤免疫治療提供新的思路。

一項較早的食管癌臨床研究顯示[13]，食管鱗癌的GATA3、Foxp3 mRNA表達(dá)水平顯著高于正常對照組，同樣紀(jì)勇等[14]在報道中指出，GATA3在食管鱗癌組織中表達(dá)較對照組織有顯著增高。本次研究結(jié)果表明，病例組的GATA3、Foxp3 mRNA表達(dá)水平均明顯高于正常組，與研究結(jié)果一致。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，病例組的CD3+、CD4+T細(xì)胞要低于正常組，推測原因可能是CD3可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，增強(qiáng)T細(xì)胞殺傷腫瘤作用，CD4則分化Th1、Th2細(xì)胞，介導(dǎo)細(xì)胞免疫，調(diào)節(jié)免疫功能，CD3+、CD4+T細(xì)胞的下降標(biāo)志著患者細(xì)胞免疫處于免疫抑制狀態(tài)。另一方面，本研究在觀察患者手術(shù)前后的GATA3、Foxp3 mRNA表達(dá)水平和CD3+、CD4+T細(xì)胞水平發(fā)現(xiàn)，食管癌患者根治術(shù)后1周GATA3、Foxp3 mRNA水平低于術(shù)前，CD3+、CD4+T細(xì)胞水平均高于術(shù)前，同時術(shù)后1周與正常組的GATA3、Foxp3表達(dá)、CD3+、CD4+T細(xì)胞水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明食管癌根治術(shù)可較好改善患者細(xì)胞免疫功能，解除細(xì)胞免疫抑制狀態(tài)。

郭利民等[15]在研究中指出Foxp3陽性表達(dá)與食管癌患者的TNM分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理特征存在關(guān)聯(lián)，同樣，在對食管癌患者外周血GATA3、Foxp3 mRNA表達(dá)與臨床病理特征的研究中發(fā)現(xiàn)，不同TNM分期、病理分級、腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管癌患者術(shù)前GATA3 mRNA表達(dá)水平有差異，不同TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管癌患者術(shù)前Foxp3 mRNA表達(dá)水平有差異，而在食管癌的預(yù)后多因素分析中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNM分期、Foxp3表達(dá)是影響食管癌患者1年生存率的危險因素，提示TNM分期Ⅲ期、Foxp3高表達(dá)的食管癌患者術(shù)后具有高風(fēng)險出現(xiàn)疾病進(jìn)展，Witt等[16]的報道認(rèn)為食管癌患者腫瘤內(nèi)部Foxp3的高表達(dá)預(yù)后惡化，與本研究結(jié)果一致。因而臨床中應(yīng)重視食管癌TNM分期Ⅲ期患者，同時監(jiān)測患者術(shù)后Foxp3表達(dá)水平，同時制定有效方案，以期改善食管癌患者預(yù)后。

綜上所述，食管癌患者的GATA3、Foxp3 mRNA呈現(xiàn)高表達(dá)，行根治術(shù)后有所下調(diào)，臨床應(yīng)對食管癌TNM分期Ⅲ期患者、Foxp3高表達(dá)患者加以重視，以期改善患者預(yù)后，進(jìn)而為食管癌的腫瘤免疫和臨床治療提供有效的建議。