miR-374、miR-451、miR-150在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達及其臨床意義

杜 佳 劉真真 朱慧琪

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，是近年發(fā)病率升高最快的惡性腫瘤；甲狀腺癌起源于不同來源的甲狀腺細胞，根據(jù)病理類型可分為乳頭狀癌、濾泡狀癌、未分化癌和髓樣癌，其中乳頭狀癌具有典型的乳頭狀結(jié)構(gòu)，常轉(zhuǎn)移到局部淋巴結(jié)[1,2]。微小RNA(MicroRNA，miRNA)作為一種新型的小分子標記物，受到了廣泛的關(guān)注，許多證據(jù)表明miRNA參與了人類惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3]。研究[4-6]指出，miR-150、miR-374通過抑制細胞增殖參與腫瘤發(fā)生；miR-451與腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移等過程聯(lián)系緊密。目前尚未有研究將三者在甲狀腺乳頭狀癌中的表達情況進行對比，本研究測定miR-150、miR-451和miR-374在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達情況，評估其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，希望為患者治療方案的選擇、甲狀腺癌的發(fā)展機制提供數(shù)據(jù)參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年12月至2020年12月甲狀腺癌根治術(shù)中留取的存檔蠟塊和癌旁正常組織(距病變部位>5 cm處，且證實為無癌浸潤)石蠟標本104例，男性19例，女性85例，年齡38～63歲，平均(50.94±5.23)歲；術(shù)前血清促甲狀腺激素水平(2.37±0.98)μIU/ml；腫瘤直徑(1.03±0.33)cm；TNM分期：Ⅱ期51例、Ⅲ期39例、Ⅳ期14例；病灶數(shù)量：單病灶68例、多病灶52例；頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例。

1.2 納入、排除標準

納入標準：①行甲狀腺癌根治手術(shù)；②經(jīng)細胞學及組織學病理確診為甲狀腺乳頭狀癌患者；③有完整的臨床檢查資料；④經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批，患者自愿參與本研究。排除標準：①患有其他惡性腫瘤者；②合并嚴重感染及出血者；③合并血液系統(tǒng)疾病或傳染病等；④合并肝臟轉(zhuǎn)移、病毒性肝炎者；⑤孕婦或妊娠患者；⑥合并精神障礙；⑦合并嚴重心肝腎功能障礙者。

1.3 qPCR檢測[7]

收集全部研究對象存檔蠟塊中的甲狀腺組織100 mg，在液氮保護下研磨，與1 ml TRIzoI、200 μl氯仿混合后進行離心，通常RNA分布于上層無色水相中；取上層液進行RNA沉淀，管底出現(xiàn)白色沉淀，將獲得的白色沉淀進行洗滌和溶解，DU800型分光光度計測定RNA的濃度及純度；隨即進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將獲得的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于-20 ℃的冰箱中。qPCR技術(shù)檢測中miR-150、miR-451和miR-374水平，Real-time qPCR引物合成由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司提供，PCR引物序列中miR-150、miR-451和miR-374引物分別為：上游引物5'-ACACTCCAGGTGGGTCTCCCAATTCAGTTGAGGACTGG-3',5'-ATTGCACTTGTCTCGGTCTG-3',5'-CTCCAGAGTTATAATACAAC-3'；下游引物5'-TGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCACTGG-3',5'-CTCAACTGGTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTTACAG-3',5'-CACTTATCAGGGCACAGA-3'。內(nèi)參照基因為U6 RNA。嚴格按照Access RT-PCR System試劑盒說明書進行操作。由SDS軟件計算每個樣品和內(nèi)參的Ct值，△Ct=Ct目標基因-Ct內(nèi)參基因，受試者miRNA的相對表達水平=2-△△Ct。

1.4 觀察指標

①miR-150、miR-451和miR-374在甲狀腺癌組織和癌旁正常組織中的表達；②收集104例甲狀腺乳頭狀癌患者臨床資料，包括年齡、性別、病灶數(shù)量、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、被膜侵犯及腫瘤直徑情況，分析miR-150、miR-451和miR-37表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系；③miR-150、miR-451和miR-37的相關(guān)性分析。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 miR-150、miR-451及miR-374在甲狀腺乳頭狀癌組織和癌旁正常組織中的表達

miR-150、miR-451及miR-374在甲狀腺乳頭狀癌組織中的相對表達量均顯著低于癌旁組織(P<0.05)，見表1。

表1 miR-150、miR-451及miR-374在甲狀腺乳頭狀癌組織和癌旁正常組織中的表達

2.2 miR-150、miR-451及miR-374表達與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

TNM分期為T3～4期、合并被膜侵犯的甲狀腺乳頭狀癌組織miR-150、miR-451及miR-374表達均顯著低于T2期、未合并被膜侵犯的癌組織，合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺乳頭狀癌組織中miR-451表達均顯著低于未合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織(P<0.05)；甲狀腺乳頭狀癌組織中miR-150、miR-451及miR-374表達與性別、年齡、病灶數(shù)量、腫瘤直徑未見明顯相關(guān)性(P>0.05)，如表2。

表2 miR-150、miR-451及miR-374表達與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 miR-150、miR-451及miR-374的相關(guān)性分析

甲狀腺乳頭狀癌組織中miR-150的表達與miR-451、miR-374表達均呈顯著正相關(guān)，miR-451與miR-374相對表達量呈顯著正相關(guān)性(P<0.05)，見表3。

表3 miR-150、miR-451及miR-374的相關(guān)性分析

3 討論

甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)病機制尚不清楚，主流觀點認為[8-9]該病是一個多階段、多基因調(diào)控的過程，如基因調(diào)控、機體免疫、淋巴和腫瘤血管生成等。mi-RNA是一類非編碼單鏈小分子，參與多種疾病過程，同時調(diào)控細胞分化、免疫應(yīng)答等多種過程，存在于易提取的外周血循環(huán)系統(tǒng)中，對于疾病的無創(chuàng)診斷、評估患者預后的應(yīng)用中有很大潛力[10-12]。

有研究稱[13]miR-150一般作為抑癌基因調(diào)控腫瘤細胞增殖，大腸癌患者血清中miR-150表達明顯下調(diào)，可靶向調(diào)控膠質(zhì)細胞弱化大腸癌的細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力。本研究中，miR-150在甲狀腺乳頭狀癌組織中的相對表達量顯著低于癌旁組織，且與甲狀腺乳頭狀癌被膜侵犯、TNM分期密切相關(guān)，甲狀腺被膜的侵犯與甲狀腺細胞外基質(zhì)抑制甲狀腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的作用減弱，腫瘤侵襲甲狀腺包膜致密淋巴結(jié)網(wǎng)有關(guān)，將提升腫瘤的侵襲性，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵步驟，以上結(jié)果提示miR-150參與調(diào)節(jié)甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)展。李霞等[14]的研究對在乳腺癌組織中發(fā)現(xiàn)miR-374呈高表達，且能調(diào)控乳腺癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲。這與本研機結(jié)論不一致，本研究中，與癌旁組織相較，miR-374在甲狀腺乳頭狀癌組織中下調(diào)，與患者被膜侵犯、TNM分期密切相關(guān)，提示miR-374參與了甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)展，考慮是因為miR-374在不同腫瘤細胞中的作用不相同，導致在乳腺癌細胞、甲狀腺乳頭狀癌組織中呈現(xiàn)相反的變化趨勢。

無頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌惡性程度較低，但合并頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌侵襲性更強，可顯著影響患者的預后和術(shù)后生存率，目前常規(guī)的超聲和CT檢查對判定是否合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在局限性，如果能從血液中提取出穩(wěn)定、特異、靈敏的生物學指標，有助于能準確預測頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，對于甲狀腺癌患者手術(shù)方式的選擇而言，具有重要的臨床意義。miR-451位于第17號染色體著絲粒附近，其序列完全保守，形成過程中直接由AGO蛋白質(zhì)剪切成熟而不經(jīng)過核糖核酸內(nèi)切酶，被證實在多種惡性腫瘤中呈負表達[15]。本研究表明，miR-451在甲狀腺乳頭狀癌組織中的相對表達量顯著低于癌旁組織，且與甲狀腺乳頭狀癌被膜侵犯、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)，提示miR-451在判斷甲狀腺乳頭狀癌患者是否合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中具有一定的應(yīng)用潛力，考慮原因：miR-451可能通過下調(diào)靶基因MIF、MMP-9，或抑制AMPK通路，實現(xiàn)對甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖、生長的調(diào)控，促進疾病進展。值得注意的是，miR-150、miR-451及miR-374在癌組織中的表達水平呈正相關(guān)，考慮與三者對甲狀腺乳頭狀癌增殖、生長的調(diào)控作用相關(guān)，但目前miR-150、miR-451及miR-374的內(nèi)在聯(lián)系尚未明確，有待基礎(chǔ)性研究進行闡明。

綜上所述，miR-150、miR-451及miR-374在甲狀腺乳頭狀癌組織中的異常表達，三者均與臨床分期密切相關(guān)，其中miR-451的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有顯著相關(guān)性，由此推測，三者與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生過程相關(guān)，miR-451可以用于預測患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。但本研究屬于回顧性研究，樣本容量有限，有待開展大樣本、前瞻性研究，探究甲狀腺乳頭狀癌患者體內(nèi)miR-150、miR-451及miR-374表達情況。