miR-21、miR-125b與舌鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后生存的關(guān)系

孫 昕 李 宏 馮 琦 劉 晶

舌鱗狀細(xì)胞癌為常見口腔惡性腫瘤，近年來發(fā)病率逐年上升。由于舌癌發(fā)展速度快、侵襲力較強(qiáng)，大多患者在確診時(shí)病灶已發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。臨床首選手術(shù)治療舌鱗狀細(xì)胞癌，但由于該腫瘤惡性程度與侵襲性較高，頸部淋巴結(jié)存在遷移風(fēng)險(xiǎn)，多數(shù)患者需輔助陽性切緣和神經(jīng)浸潤測定，且術(shù)后需進(jìn)行放化療干預(yù)[1-2]。因舌體組織具有特殊生理結(jié)構(gòu)和功能，血液循環(huán)和淋巴豐富，舌體活動性高，舌鱗狀細(xì)胞癌易發(fā)生遷移，局部有復(fù)發(fā)可能性，導(dǎo)致患者術(shù)后生存率低。miRNA為內(nèi)源性非編碼RNA，分布于真核細(xì)胞體內(nèi)，調(diào)控活性較大。大多miRNA分布于宿主因子introns中，與其因子共用啟動子和轉(zhuǎn)錄原件，待mRNA生成后將內(nèi)含因子剪切而產(chǎn)生pri-miRNA。成熟的miRNA產(chǎn)生多核酸酶剪切加工長初級轉(zhuǎn)錄物質(zhì)，后裝配至RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物中，經(jīng)堿基互補(bǔ)配對以識別靶向mRNA，并將其降解或抑制其翻譯[3-4]。為此，本研究通過對86例舌鱗狀細(xì)胞癌患者癌組織與癌旁正常組織的 miR-21、miR-125b表達(dá)情況進(jìn)行對比，并經(jīng)Kaplan-Meier分析生存曲線，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年7月至2020年6月我院收治的86例舌鱗狀細(xì)胞癌患者手術(shù)切除的癌組織與對應(yīng)的癌旁正常組織，其中男性47例，女性39例；年齡為45～78歲，平均(61.58±15.86)歲；組織分化程度：低分化26例、中分化31例、高分化29例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況：未發(fā)生轉(zhuǎn)移54例、發(fā)生轉(zhuǎn)移32例；臨床分期：Ⅰ期18例、Ⅱ期23例、Ⅲ期26例、Ⅳ期19例。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《口腔頜面部惡性腫瘤治療指南》標(biāo)準(zhǔn)[5]，且經(jīng)手術(shù)后病理檢查確診為舌鱗狀細(xì)胞癌；術(shù)前無放化療治療；簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤患者；無手術(shù)指征患者；術(shù)后病情復(fù)雜再次治療患者；長期使用非甾體抗炎藥患者；術(shù)前接受放化療或免疫治療患者；感染性疾病患者；精神疾病及意識障礙患者。

1.2 方法

RNA提?。孩偃∩圜[狀細(xì)胞癌組織與對應(yīng)癌旁正常組織，于液氮下研成粉末，刮入EP管中；②管內(nèi)分別加入裂解液充分混勻，于室溫下靜置；③管內(nèi)加入氯仿，EP管上下顛倒數(shù)次，當(dāng)其溶液變?yōu)槿榘咨螅o置10 min；④使用離心機(jī)進(jìn)行例行，靜置，EP管內(nèi)分成3層，上層液相中含有RNA；⑤將上清液移到新的EP管內(nèi)，加入異丙醇，于低溫下沉淀，后離心5 min；⑥加入預(yù)冷乙醇，上下顛倒后離心；⑦棄除上清液干燥的RNA沉淀，加入DEPC水混勻，于室溫下溶解。采用分光光度儀檢測RNA的純度，良好RNA的OD260/OD280位于1.8～2.0，該數(shù)值表明RNA純度合格。

逆轉(zhuǎn)錄：①于PCR管內(nèi)配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系；②配置PCR體系，振蕩混勻后離心，在低溫冰盒上操作，管內(nèi)先后加入DNA模板與引物，加入MIX體系，待無氣泡產(chǎn)生后將PCR管放入PCR儀器中，逆轉(zhuǎn)錄體系中于37 ℃中保溫使其完全反應(yīng)后放置85 ℃中終止反應(yīng)。③向體系中加入ddH2O進(jìn)行稀釋，放置冰箱內(nèi)保存待用。

PCR檢測：①配置反應(yīng)體系；②配置PCR反應(yīng)條件：95 ℃進(jìn)行15 min預(yù)變，進(jìn)入循環(huán)后，于94 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，對熒光進(jìn)行采集，共40循環(huán)；于60～95 ℃下融解，內(nèi)參設(shè)為U6，重復(fù)進(jìn)行3次試驗(yàn)，采用2-△△CT，△△CT=(Ct目標(biāo)基因-Ct管家基因)研究組-(Ct目標(biāo)基因-Ct管家基因)對照組，計(jì)算相對定量法檢測miR-21、miR125b表達(dá)量。

1.3 隨訪

對患者進(jìn)行半年時(shí)間隨訪，包括門診、電話等形式，隨訪截止時(shí)間為2020年12月31日。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 癌組織與癌旁組織中miR-21、miR125b表達(dá)量比較

舌鱗狀細(xì)胞癌組織中miR-21、miR125b表達(dá)量顯著高于癌旁正常組織(P<0.05)。見表1。

表1 癌組織與癌旁組織中miR-21、miR125b表達(dá)量比較

2.2 舌鱗狀細(xì)胞癌患者臨床參數(shù)與miR-21、miR125b表達(dá)量的關(guān)系

舌鱗狀細(xì)胞癌組織中miR-21、miR125b表達(dá)與患者性別、年齡無關(guān)(P>0.05)，與組織分化程度、頸淋巴轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)(P<0.05)。見表2。

表2 舌鱗狀細(xì)胞癌患者臨床參數(shù)與miR-21、miR125b表達(dá)量的關(guān)系

2.3 舌鱗狀細(xì)胞癌中miR-21、miR125b表達(dá)對預(yù)后生存影響

半年隨訪中，共17例患者死亡，69例存活。舌鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的單因素分析，存活與死亡患者在頸淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移、臨床分期、miR-21與miR125b表達(dá)量方面比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。經(jīng)miR-21與miR125b表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān)性分析，miR-21與miR125b表達(dá)量越高患者生存率越低。見圖1。

圖1 舌鱗狀細(xì)胞癌Kaplan-Meier生存分析

表3 舌鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的單因素分析

2.4 舌鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后影響因素分析

經(jīng)Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析顯示，miR-21與miR125b高表達(dá)、發(fā)生頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期在Ⅲ～Ⅳ期為舌鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的影響因素(P<0.05)。見表4。

表4 舌鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后影響因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型

3 討論

舌鱗狀細(xì)胞癌為口腔常見惡性腫瘤，發(fā)病率占口腔惡性腫瘤的一半[6-7]，惡性程度與侵襲性均較高，易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。舌鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病原因與機(jī)制較復(fù)雜，治療的首選方式為手術(shù)，且該腫瘤病灶侵襲力強(qiáng)、生長速度快且惡性程度高，易使患者舌肌運(yùn)動受到限制，進(jìn)而影響其吞咽進(jìn)食和語言等功能，且患者大多預(yù)后不良[8-9]。

微小核糖核酸(miRNA)為非編碼單核小核糖核酸分子，約22個(gè)核苷酸長度，常與靶mRNA非翻譯區(qū)域進(jìn)行互補(bǔ)配對，使其降解或轉(zhuǎn)錄后阻礙翻譯過程，于轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶向基因的表達(dá)。miRNA可參與機(jī)體多數(shù)病理生理過程，與腫瘤發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。miR-21為發(fā)現(xiàn)較早的有致癌基因的人類miRNAs，位于17q23.2染色體脆性區(qū)域，具有自主轉(zhuǎn)錄單位，能調(diào)節(jié)ERK/RAS/MEK通路以抑制基因凋亡表達(dá)[10-12]。miR-21靶基因PTEN能抑制P13K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，活化Akt經(jīng)磷酸化激活或抑制下游靶蛋白表達(dá)，可調(diào)控細(xì)胞增殖分化及凋亡。 研究顯示，舌鱗狀細(xì)胞癌患者體內(nèi)血漿miR-21表達(dá)水平上升，可能與腫瘤侵襲及術(shù)后病灶復(fù)發(fā)有關(guān)。miR-21在多種腫瘤組織中表達(dá)水平上升，能調(diào)控PTEN、p53或mTOR/PI3K/AKT基因或通路以發(fā)揮癌基因作用[13-14]。本研究中舌鱗狀細(xì)胞癌組織中miR-21表達(dá)水平上升，臨床分期晚，且具有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者miR-21表達(dá)水平更高，miR-21高表達(dá)患者生存率低于低表達(dá)患者，miR-21高表達(dá)為影響患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素，表明miR-21高表達(dá)與舌鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系[15]。

miR-125b在頭頸部位惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用較為突出，可在轉(zhuǎn)錄水平對基因表達(dá)能有效調(diào)控，miR-125b多通過作用于細(xì)胞增殖、分化、凋亡等干擾腫瘤發(fā)生發(fā)展，為抑癌特性的基因，在口腔、皮膚等鱗狀細(xì)胞癌與肝癌等體內(nèi)表達(dá)下降[16]。肖丙秀等[17]指出miR-125b在卵巢組織中處于低表達(dá)，但在卵巢癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，阻礙腫瘤誘導(dǎo)血管生成，可能與HER2、HER3表達(dá)具有緊密關(guān)聯(lián)。陳筱雪等[18]通過PCR實(shí)驗(yàn)檢測膀胱癌組織及癌旁組織中miR-125b 表達(dá)情況，結(jié)果顯示相對于正常組織，miR-125b在腫瘤組織中呈低表達(dá)。侯志偉等[19-20]報(bào)道顯示舌鱗狀細(xì)胞癌衍生細(xì)胞與樣品中miR-125b表達(dá)下調(diào)，能降低舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖率，且能增強(qiáng)放射敏感性并減少ICAM2-mRNA表達(dá)，且miR-125b表達(dá)與腫瘤分期與患者生存率有關(guān)。

綜上所述，舌鱗狀細(xì)胞癌組織中miR-21、miR-125b呈高表達(dá)狀態(tài)，且與患者組織分化程度、頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)，為影響預(yù)后的危險(xiǎn)因素，可作為臨床預(yù)測患者預(yù)后生存的標(biāo)志物。