E-cadherin、PDPN、TLR4在舌鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究

王 婧 李海婷

目前我國(guó)頭頸部惡性腫瘤的發(fā)病率約15/10萬(wàn)，而頭頸部惡性腫瘤中的舌鱗狀細(xì)胞癌更是排在惡性腫瘤的第6位[1]。由于舌鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病部位特殊，舌內(nèi)血管較為豐富，且運(yùn)動(dòng)頻繁，導(dǎo)致容易出現(xiàn)早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，并且治療后也容易復(fù)發(fā)[2]。粘附分子E(epithelial-cadherin，E-cadherin)是一種粘附分子，在胚胎的形成、組織結(jié)構(gòu)的維持中發(fā)揮著重要意義，并參與到腫瘤的增生、分化和轉(zhuǎn)移當(dāng)中[3]。平足蛋白(podoplanin，PDPN)能夠促進(jìn)淋巴管祖母細(xì)胞自胚胎靜脈發(fā)育生成淋巴內(nèi)皮細(xì)胞，是腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的必要條件[4]。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4 TLR4)是Toll樣受體的一種，在調(diào)劑免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用，近年來(lái)已被證實(shí)參與腫瘤的分化和轉(zhuǎn)移當(dāng)中[5]。本研究選取我院收治82例舌鱗狀細(xì)胞癌患者臨產(chǎn)資料，以研究E-cadherin、PDPN、TLR4在舌鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月～2020年1月我院收治82例舌鱗狀細(xì)胞癌患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者符合《口腔頜面腫瘤病理學(xué)》[6]中舌鱗狀細(xì)胞癌診斷標(biāo)準(zhǔn)；②患者通過(guò)病理學(xué)證實(shí)為舌鱗狀細(xì)胞癌；③患者無(wú)第二原發(fā)腫瘤；④患者術(shù)前未接受抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者存在嚴(yán)重肝腎功能不全；②患者合并其他部位惡性腫瘤；③患者存在嚴(yán)重凝血功能障礙；④患者為妊娠期女性。82例舌鱗狀細(xì)胞癌患者，男性40例， 女性42例，年齡30～84歲，平均年齡(55.65±20.51)歲，根據(jù)TMN分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期31例，Ⅱ期25例，Ⅲ期26例，分化程度：低分化34例，中分化36例，高分化12例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移44例。

1.2 方法

E-cadherin表達(dá)水平檢測(cè)方法：手術(shù)中切取患者癌組織和周圍健康組織，標(biāo)本連續(xù)切片2張，分別采用HE和免疫組化染色法，嚴(yán)格按照SPTM法進(jìn)行檢測(cè)，其中對(duì)于抗原的修復(fù)采用高溫高壓抗原組織修復(fù)法，送往鏡檢，在光鏡下進(jìn)行觀察，胞膜內(nèi)可觀察出棕黃色顆粒則可判斷為陽(yáng)性，參考Shimzu標(biāo)準(zhǔn)，使用半計(jì)量法，分別對(duì)染色的細(xì)胞進(jìn)行分部和染色分?jǐn)?shù)計(jì)算：染色細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)著色細(xì)胞為0分，著色細(xì)胞低于組織細(xì)胞的三分之一為1分，著色細(xì)胞高于組織細(xì)胞的三分之一但不高于二分之三為2分，著色細(xì)胞高于二分之三為3分；染色細(xì)胞深度標(biāo)準(zhǔn)：不著色為0分，色淺為1分，色深為2分。將染色細(xì)胞和染色細(xì)胞深度分?jǐn)?shù)相加，0分為-，2分為+，3分為++，4分為+++，5分為++++。

PDPN表達(dá)水平檢測(cè)方法：手術(shù)中切取患者癌組織和周圍健康組織，制成石蠟標(biāo)本。采用二甲苯脫蠟，乙醇脫水，隨后以3%過(guò)氧化氫溶液去除標(biāo)本內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，以pH 6.0的檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行微波抗原修復(fù)，分別在兩個(gè)組織內(nèi)滴加1∶2000稀釋的CellSignaling Technology公司的濃縮型兔抗人PDPN單克隆抗體，以4 ℃孵育，并隨后進(jìn)行顯色、復(fù)染、脫色等操作送往鏡檢，在光鏡下進(jìn)行觀察，染色細(xì)胞深度標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)著色為0分，輕度著色或者淺黃色為1分，中度著色或者深黃色為2分，重度著色或者棕色為3分；在光鏡下隨機(jī)視野內(nèi)500個(gè)細(xì)胞，1分為≤10%，2分為11%～50%，3分為51%～80%，4分為>80%。將染色細(xì)胞和染色細(xì)胞深度分?jǐn)?shù)相加，0分為-，2分為+，3分為++，4分為+++，5分為++++。

TLR4表達(dá)水平檢測(cè)方法：手術(shù)中切取患者癌組織和周圍健康組織，制成石蠟標(biāo)本放于60 ℃烤箱內(nèi)，隨后進(jìn)行復(fù)水、清洗，采用檸檬酸鈉微波抗原修復(fù)，滴入Santa Cruz公司的兔抗人TLR4多克隆抗體，以4 ℃孵育，并隨后進(jìn)行顯色、復(fù)染、脫色等操作送往鏡檢，在光鏡下進(jìn)行觀察，400倍光鏡下進(jìn)行技計(jì)數(shù)，光鏡下可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞膜表現(xiàn)為棕黃色則可判定為陽(yáng)性，切片隨機(jī)收集10個(gè)高倍視野內(nèi)的細(xì)胞，每個(gè)切片內(nèi)所含的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量為陽(yáng)性細(xì)胞率，≥10%則判定為+，≥75%則為++，≤10%則為-。

1.3 觀察指標(biāo)

檢測(cè)患者舌鱗狀細(xì)胞癌組織以及癌旁正常組織內(nèi)E-cadherin、PDPN、TLR4的表達(dá)，同時(shí)與患者臨床特征進(jìn)行分析。

1.4 方法

2 結(jié)果

2.1 舌鱗狀細(xì)胞癌組織以及癌旁正常組織內(nèi)E-cadherin表達(dá)對(duì)比

舌鱗狀細(xì)胞癌組織中E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率[41.46%(34/82)]顯著低于癌旁組織[85.36%(70/82)]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 舌鱗狀細(xì)胞癌組織以及癌旁組織中E-cadherin表達(dá)對(duì)比(例，%)

2.2 舌鱗狀細(xì)胞癌組織以及癌旁組織內(nèi)PDPN表達(dá)水平對(duì)比

PDPN在舌鱗狀細(xì)胞癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率[86.58%(71/82)]顯著高于癌旁組織[24.39%(20/82)]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表2 舌鱗狀細(xì)胞癌組織以及癌旁組織內(nèi)PDPN表達(dá)對(duì)比(例，%)

2.3 舌鱗狀細(xì)胞癌組織以及癌旁組織內(nèi)TLR4表達(dá)對(duì)比

TLR4在舌鱗狀細(xì)胞癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率[87.80%(72/82)]顯著高于癌旁組織[13.41%(11/82)]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 舌鱗狀細(xì)胞癌組織以及癌旁組織內(nèi)TLR4表達(dá)對(duì)比(例，%)

2.4 E-cadherin表達(dá)與患者臨床特征分析

E-cadherin表達(dá)與患者性別、年齡無(wú)相關(guān)性(P>0.05)；TMNⅢ～Ⅳ期E-cadherin表達(dá)明顯低于TNMⅠ～Ⅱ期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者E-cadherin表達(dá)水平明顯低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 E-cadherin表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系/例

2.5 PDPN表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系

PDPN表達(dá)與患者性別、年齡無(wú)相關(guān)性(P>0.05)；TMNⅢ～Ⅳ期PDPN表達(dá)明顯高于TNMⅠ～Ⅱ期，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者PDPN表達(dá)水平明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表5。

表5 PDPN表達(dá)與其臨床特征的關(guān)系/例

2.6 TLR4表達(dá)與其臨床特征的關(guān)系

TLR4表達(dá)與患者性別、年齡無(wú)相關(guān)性(P>0.05)；TMNⅢ～Ⅳ期TLR4表達(dá)明顯高于TNMⅠ～Ⅱ期，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者TLR4表達(dá)水平明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表6。

表6 TLR4表達(dá)與其臨床特征的關(guān)系/例

3 討論

由于舌部的血管豐富，并且經(jīng)常運(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致舌鱗狀細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移率明顯更高，患者的生存率約在60%，患者死亡的主要原因是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或者復(fù)發(fā)[7-8]。隨著生物分子學(xué)的不斷進(jìn)步，多項(xiàng)研究認(rèn)為腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與生物學(xué)分子密切相關(guān)[9-10]。目前臨床上對(duì)于E-cadherin、PDPN、TLR4在舌鱗狀細(xì)胞癌表達(dá)的研究仍較少，本次研究在此基礎(chǔ)上對(duì)于其與患者臨床特征相關(guān)性進(jìn)行分析，以為臨床診斷與治療提供指導(dǎo)。

E-cadherin是一種具有較高鈣依賴性的粘附因子，可以在人體的上皮組織內(nèi)檢測(cè)到，分別由胞外區(qū)、跨膜區(qū)以及胞內(nèi)區(qū)構(gòu)成[11]。E-cadherin能夠作為受體也能夠充當(dāng)配體。負(fù)責(zé)細(xì)胞間黏附反應(yīng)的介導(dǎo)，當(dāng)E-cadherin發(fā)揮作用時(shí)，其余粘附系統(tǒng)會(huì)失去作用.有研究發(fā)現(xiàn)，E-cadherin結(jié)構(gòu)功能出現(xiàn)異常時(shí)，上皮結(jié)構(gòu)的生成會(huì)出現(xiàn)障礙，將E-cadherin的基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，能夠?qū)δ[瘤的侵襲和轉(zhuǎn)錄行為進(jìn)行抑制，說(shuō)明，E-cadherin是一種腫瘤抑制基因[12]。本研究表示：E-cadherin在患者舌鱗狀細(xì)胞癌組織的表達(dá)顯著低于癌旁組織(P<0.05)。Sgaramella等[13]發(fā)現(xiàn)：舌鱗狀細(xì)胞癌患者隨著癌組織內(nèi)E-cadherin表達(dá)的升高，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的存在一定的降低趨勢(shì)。這與本研究結(jié)果TMNⅢ～Ⅳ期E-cadherin表達(dá)明顯低于TNMⅠ～Ⅱ期，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者E-cadherin表達(dá)明顯低于不存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(P<0.05)一致。分析因?yàn)镋-cadherin對(duì)癌細(xì)胞的同嗜性粘附急性介導(dǎo)，組織癌細(xì)胞的脫落，從而限制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[14]。PDPN在人體的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中具有較高的表達(dá)，同時(shí)在侵襲性腫瘤內(nèi)同樣具有一定的表達(dá)[15]。本研究表示：PDPN在患者舌鱗狀細(xì)胞癌組織的表達(dá)顯著高于癌旁組織(P<0.05)。有研究表示：PDPN在舌鱗狀細(xì)胞癌組織的表達(dá)明顯高于癌旁組織，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性[16]，這與本研究結(jié)果TMNⅢ～Ⅳ期的患者癌組織內(nèi)PDPN表達(dá)明顯高于TNMⅠ～Ⅱ期，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者癌組織內(nèi)PDPN、表達(dá)明顯高于不存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(P<0.05)一致。我們推測(cè)可能因?yàn)镻DPN能夠造成E-cadherin的低表達(dá)，進(jìn)而使細(xì)胞的接觸抑制，引起上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和增生[17]。TLR4屬于TLRs 的一種，在多種腫瘤細(xì)胞內(nèi)均有一定的表達(dá)。TLR4雖然能夠加強(qiáng)人體對(duì)于腫瘤的免疫反應(yīng)，但也能為腫瘤細(xì)胞的增殖發(fā)育提供環(huán)境，促進(jìn)腫瘤的增殖分化[18-19]。本次研究發(fā)現(xiàn)：TLR4在患者舌鱗狀細(xì)胞癌組織的表達(dá)顯著高于癌旁組織(P<0.05)。有研究認(rèn)為TLR4能夠促進(jìn)腫瘤壞死因子-α的分泌，進(jìn)而促進(jìn)樹突細(xì)胞的成熟，加強(qiáng)T細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞的合成，殺死腫瘤細(xì)胞。Anna等[20]研究得出，TLR4在患者舌鱗狀細(xì)胞癌組織的表達(dá)明顯升高，但與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)相關(guān)性。這與本研究結(jié)果不一致，分析可能由于病例收集較少所引起。本次研究E-cadherin、PDPN、TLR4在舌鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)的基礎(chǔ)上對(duì)其與淋巴結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移進(jìn)行相關(guān)性研究，為舌鱗狀細(xì)胞癌的診斷與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)提供幫助，但是本次研究仍存在一定的局限性，主要因?yàn)椴±占^少，且均來(lái)自同一省份，可能造成一定的偏差，所以以后應(yīng)當(dāng)加大病例的采集。

綜上所述，舌鱗狀細(xì)胞癌患者體內(nèi)E-cadherin存在明顯的降低，PDPN、TLR4明顯升高，并且研究發(fā)現(xiàn)存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及分期較高的患者體E-cadherin顯著更低，PDPN、TLR4顯著更高。