YBX3通過MAPK途徑促進鼻咽癌增殖和生長的實驗研究

楊 明 鄧婷婷 王雨潔 聶國輝 范小琴

在中國，鼻咽癌的發(fā)生率和死亡率居世界之首，是我國重點防治的惡性腫瘤之一[1]。鼻咽癌發(fā)病位置隱匿，臨床確診時多為中晚期[2]。在臨床，對中晚期患者的治療效果不佳，5年生存率低[3]。因此，深入研究鼻咽癌發(fā)生和發(fā)展的分子機制，尋找有效的潛在治療靶點對提高鼻咽癌患者生存率具有非常重要的意義。核酸結(jié)合蛋白3(Y-box protein 3，YBX3)，又稱DNA結(jié)合蛋白A(DNA binding protein A，DBPA)、冷休克蛋白A(cold shock domain protein A,CSDA)，是核酸結(jié)合蛋白家族重要成員之一[4]。研究顯示YBX3具有多種生物學(xué)功能，在肝癌、結(jié)直腸癌、腎癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[5,6]。如在肝癌中，YBX3的表達與肝癌分期顯著相關(guān)，可作為炎癥誘導(dǎo)肝癌發(fā)生的候選蛋白標(biāo)準(zhǔn)物[7]。在個體發(fā)育中，YBX3 作為重要轉(zhuǎn)錄因子，通過Myc21和E2F促進cyclinD1和PCNA的表達促進細胞增殖[8]。然而，YBX3參與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的功能和作用目前尚不完全清楚。本研究通過Q-PCR 和Western Blot實驗檢測YBX3在多種鼻咽癌細胞系中的表達情況，并結(jié)合體外分子實驗和體內(nèi)動物實驗探索YBX3對鼻咽癌細胞增殖和腫瘤生長的作用；并進一步探索其對鼻咽癌細胞增殖的分子機制，以期為臨床鼻咽癌治療提供新的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

正常鼻咽上皮細胞NP460受贈于香港大學(xué)李嘉誠醫(yī)學(xué)院曹世華教授，鼻咽癌細胞SUNE1，CNE1，CNE2，5-8F本實驗室保存。DKSF培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國Gibco公司，RPMI-1640培養(yǎng)基、雙抗、0.25%胰酶購買于美國Hyclone公司。CFSE試劑盒、Trizol試劑購于美國Life公司；CCK8試劑盒購于日本Dojindo公司；YBX3，p38，p-p38，PCNA，GAPDH，兔二抗，鼠二抗購買于CST公司；逆轉(zhuǎn)錄和SYBR熒光定量試劑盒購買于美國Roche公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

正常鼻咽上皮NP460細胞用DKSF培養(yǎng)基培養(yǎng)；鼻咽癌細胞SUNE1，CNE1，CNE2，5-8F用加1%青鏈霉素雙抗和10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)；培養(yǎng)箱條件37 ℃，5%CO2，細胞培養(yǎng)到融合率達90%以上時，加胰酶消化傳代或?qū)嶒灐?/p>

1.3 細胞瞬轉(zhuǎn)/穩(wěn)轉(zhuǎn)干擾試驗

YBX3 SiRNA瞬轉(zhuǎn)干擾試劑盒和慢病毒ShRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)試劑盒購買于中國吉瑪公司和上海吉凱基因。瞬轉(zhuǎn)時，5-8F細胞用轉(zhuǎn)染試劑lip2000按試劑盒說明書操作，24小時后繼續(xù)后續(xù)實驗。穩(wěn)轉(zhuǎn)時，5-8F細胞按試慢病毒劑盒說明書操作，48小時后用1 μg/ml嘌呤霉素篩選穩(wěn)定敲除YBX3的細胞并驗證后用于后續(xù)實驗。

1.4 CFSE細胞增殖實驗

瞬轉(zhuǎn)YBX3 SiRNA的5-8F細胞消化、重懸、計數(shù)后，制備1×106/100 μl 濃度的細胞懸液，加入CFSE染料至終濃度為5 μM，置于室溫避光孵育10 min，加完全培養(yǎng)基終止離心，鋪板，48 h后，消化上流式檢查，實驗重復(fù)3次。

1.5 CCK8細胞增殖實驗

穩(wěn)轉(zhuǎn)YBX3 ShRNA的5-8F細胞消化、重懸、計數(shù)后，鋪于96孔板每孔2000個細胞，每組每個時間點做3個復(fù)孔，分別在24 h、48 h、72 h后棄培養(yǎng)基，加入100 μl含有10 μl CCK8試劑，37 ℃孵育3 h后，上酶標(biāo)儀檢測吸收波長為OD 450 nm，實驗重復(fù)3次。

1.6 克隆形成細胞增殖實驗

穩(wěn)轉(zhuǎn)YBX3 ShRNA的5-8F細胞消化、重懸、計數(shù)后，鋪于6孔板每孔400個細胞，每組做3個復(fù)孔，1周后棄培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，實驗重復(fù)3次，計數(shù)并統(tǒng)計克隆個數(shù)。

1.7 Western blot 實驗

細胞和組織總蛋白用RIPA ( 加入1×蛋白酶抑制劑和1×磷酸酶抑制劑) 裂解液裂解提取?？偟鞍诐舛扔肂CA蛋白定量法提取。總蛋白10 μg用10%的SDS-PAGE跑膠分離后，轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗(1∶1000)4 ℃孵育過夜、二抗(1∶2000)室溫孵育2 h、ECL顯影。

1.8 Q-PCR實驗

細胞總RNA通過Trizol試劑常規(guī)提取方法，總RNA濃度用酶標(biāo)儀定量后，取1μg總RNA按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作逆轉(zhuǎn)成cDNA，相對熒光定量檢測目的基因RNA表達情況。實驗所用引物如下：YBX3上游引物：5'-ACCGGCGTCCCTACAATTAC-3'，下游引物：5'-GGTTCTCAGTTGGTGCTTCAC-3' ； GAPDH上游引物：5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'， 下游引物：5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。

1.9 動物實驗

所有動物實驗均按照深圳大學(xué)動物倫理要求實驗。5～6周雌性裸鼠購于北京華富康動物有限公司，動物許可證批號：SCXK(京)2019-0008。鼻咽癌荷瘤形成實驗，5-8F YBX3-Control組和5-8F YBX3-ShRNA組細胞2×106個細胞用30 μl PBS重懸，注射器打于小鼠背部皮下，10天后開始測量腫瘤，間隔4天測量一次，30天后安樂處死小鼠，收集腫瘤，稱腫瘤重量，拍照后，取腫瘤組織保存用于后續(xù)實驗。

1.10 統(tǒng)計方法

所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析均用Graphpad Prism 7.0 軟件分析。所有計量資料均用均數(shù)(mean)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，不同組間比較用t檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 YBX3在鼻咽癌細胞中高表達

Western blot結(jié)果顯示與正常鼻咽上皮細胞NP460相比，YBX3在鼻咽癌細胞中的蛋白水平表達顯著升高，且在惡性程度比較高的5-8F細胞中表達最高(圖1A)。進一步Q-PCR實驗結(jié)果顯示YBX3在鼻咽癌細胞RNA水平也得到相似得結(jié)論，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖1B)。綜合考慮，選取5-8F細胞用于后續(xù)功能和分子機制的研究。

注：A為Western blot 檢測YBX3在正常鼻咽上皮和鼻咽癌細胞中的蛋白表達情況；B為Q-PCR 檢查YBX3在正常鼻咽上皮和鼻咽癌細胞中的mRNA表達情況。

2.2 YBX3干擾效率檢測

采用SiRNA 瞬轉(zhuǎn)和慢病毒ShRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)干擾5-8F細胞YBX3的表達。Western blot 結(jié)果顯示與YBX3-Control 組比較，三條SiRNA瞬轉(zhuǎn)干擾YBX3的蛋白水平表達情況，其中第二和第三條SiRNA效果顯著(圖2A)；而三條慢病毒ShRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)干擾YBX3的蛋白水平表達情況，三條ShRNA的敲除效果都很顯著(圖2C)。進一步Q-PCR實驗結(jié)果顯示SiRNA和ShRNA干擾YBX3表達在RNA水平也得到與Western blot相似得結(jié)果，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖2B和2D)。綜合考慮，分別選擇了SiRNA和ShRNA干擾效果最顯著的第二條和第三條用于后續(xù)體內(nèi)外功能和分子機制的研究。

2.3 YBX3促進鼻咽癌細胞增殖

將上述瞬時干擾YBX3表達后的5-8F細胞進行CFSE細胞流式增殖實驗，結(jié)果顯示在CFSE染色48小時后，YBX3-SiRNA 組細胞熒光強度遞減顯著減慢，提示細胞增殖減慢(圖3A)。之后再利用穩(wěn)轉(zhuǎn)干擾YBX3表達的5-8F細胞進行CCK8和克隆形成實驗。在CCK8實驗中，結(jié)果顯示與YBX3-Control組相比，YBX3-ShRNA組細胞增殖活性顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖3B)。在克隆形成實驗中，結(jié)果顯示與YBX3-Control組相比，YBX3-ShRNA組細胞單克隆形成數(shù)目也顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖3C、3D)?？傊?，以上細胞增殖相關(guān)實驗結(jié)果數(shù)據(jù)表明YBX3能促進鼻咽癌細胞的增殖。

2.4 YBX3促進鼻咽癌腫瘤生長

將YBX3-Control和YBX3-ShRNA的5-8F細胞注射裸鼠皮下荷瘤實驗，實驗結(jié)果顯示與YBX3-Control組比較，YBX3-ShRNA組顯著抑制鼻咽癌腫瘤生長的重量和大小，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖4A-4C)。以上在體實驗結(jié)果證實敲除YBX3的表達顯著抑制鼻咽癌腫瘤生長。

注：A為Western blot 檢測5-8F細胞siRNA瞬轉(zhuǎn)干擾YBX3蛋白表達情況；B為Q-PCR 檢測5-8F細胞SiRNA瞬轉(zhuǎn)干擾YBX3 mRNA表達情況；C為Western blot 檢測5-8F細胞慢病毒shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)干擾YBX3蛋白表達情況；D為 Q-PCR 檢測5-8F細胞慢病毒shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)干擾YBX3 mRNA表達情況。

2.5 YBX3促進鼻咽癌腫瘤生長的分子機制

通過Western blot實驗檢測觀察到干擾YBX3后細胞總p38無顯著變化，但p-p-38顯著降低，明顯改變了MAPK p-38通路的活性(圖5)。進一步下游增殖關(guān)鍵蛋白Western blot檢測，發(fā)現(xiàn)干擾YBX3的表達后顯著降低PCNA的表達(圖5)。以上結(jié)果表明，YBX3可通過調(diào)節(jié)MAPK p38/PCNA途徑促進鼻咽癌腫瘤生長。

圖5 YBX3促進鼻咽癌腫瘤生長的分子機制

3 討論

鼻咽癌是一種具有明顯地域性的腫瘤，也是我國重點防治的惡性腫瘤之一[9]。鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移受多種因素參與，其中腫瘤細胞異常增殖是影響腫瘤生長的最重要的因素[10]。近年，研究顯示YBX3在多種腫瘤細胞中異常表達，并參與腫瘤細胞多種生物學(xué)過程[11,12]。而在鼻咽癌中，目前只有馬俊教授團隊利用臨床鼻咽癌轉(zhuǎn)移和非轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者組織通過微陣列分析發(fā)現(xiàn)YBX3 可能是鼻咽癌轉(zhuǎn)移的一個候選蛋白，但有關(guān)YBX3與鼻咽癌細胞增殖和生長的生物學(xué)作用和機制目前尚未見報道[13]。

本研究首先對比正常鼻咽上皮細胞NP460和不同鼻咽癌細胞中YBX3的表達差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與NP460相比，鼻咽癌細胞中YBX3蛋白和RNA的表達顯著升高，且惡性程度較高的5-8F細胞中YBX3表達最高，由此推測YBX3基因異常高表達可能參與了鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展。腫瘤細胞異常增殖是腫瘤生長的核心機制，而腫瘤細胞增殖受多種信號通路共同調(diào)控[14]。本研究通過多種細胞增殖實驗發(fā)現(xiàn)干擾YBX3的表達顯著抑制鼻咽癌細胞的增殖；同時，小鼠在體的荷瘤實驗結(jié)果也發(fā)現(xiàn)YBX3-ShRNA組顯著抑制了腫瘤生長。這些體內(nèi)外實驗結(jié)果均證實YBX3在鼻咽癌細胞增殖和腫瘤生長中發(fā)揮了重要作用。

隨后，本項目對YBX3促進鼻咽癌增殖的分子機制進行了初步研究。研究顯示 MAPK通路的激活參與細胞多種生物學(xué)功能，如細胞增殖、遷移、生長和凋亡[15]。MAPK通路主要包括三類激酶：MAPK/p38、MAPK/ERK和MAPK/JNK，它們分別通過磷酸化形式改變其活性而發(fā)揮生物學(xué)作用[16]。此外，MAPK途徑在腫瘤中異常激活已被證實可作為抗腫瘤治療的靶標(biāo)；近年發(fā)現(xiàn)其在鼻咽癌中異常激活并對鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展起了重要作用[17,18]。本研究發(fā)現(xiàn)與YBX3-Control 組相比，YBX3-ShRNA組顯著抑制MAPK p38通路活性。此外，本研究還檢測了細胞增殖相關(guān)基因的表達，結(jié)果證實與YBX3-Control 組相比，YBX3-ShRNA組PCNA的表達顯著抑制[19,20]。 PCNA是一種高度保守的36～37kD的蛋白，其作為細胞增殖活性的下游指標(biāo)已被廣泛應(yīng)用，尤其在腫瘤細胞增殖中的異常表達水平與腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[21,22]。以上結(jié)果證實YBX3參與鼻咽癌細胞增殖通過MAPK p38/PCNA是其一個新的下游分子機制。

注：A為CFSE檢查siRNA干擾YBX3后對細胞增殖的影響。B為CCK8檢查shRNA干擾YBX3后對細胞增殖活性的影響。C為單克隆形成實驗檢查shRNA干擾YBX3后對細胞增殖的影響。D為單克隆形成實驗結(jié)果統(tǒng)計。

綜上，本研究證實YBX3基因異常高表達參與了鼻咽癌的生長。在鼻咽癌中YBX3通過MAPK p38/PCNA途徑參與調(diào)控鼻咽癌細胞增殖和腫瘤生長。項目下一步將探討YBX3在鼻咽癌患者中的表達及與患者的生存相關(guān)性分析，以期為臨床治療提供有力證據(jù)。

注：A為5-8F荷瘤組織圖(每組6只老鼠6個腫瘤)；B為5-8F腫瘤重量圖(每組6只老鼠6個腫瘤)；C為5-8F腫瘤生長曲線圖(每組6只老鼠6個腫瘤)。