毒害艾美耳球蟲(chóng)早熟株對(duì)雞免疫效果的評(píng)價(jià)

馬維彩，何學(xué)柏#，孫英健，李本勝，張彩榮，芮國(guó)紅，李煥榮*，李秋明*

(1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2. 北京市華都峪口禽業(yè)有限責(zé)任公司，北京 101206)

雞球蟲(chóng)病是由一種或多種艾美耳球蟲(chóng)感染引起的腸道疾病[1]，其中毒害艾美耳球蟲(chóng)(Eimerianecatrix)易感染 56～126日齡的雞，發(fā)病率和死亡率最高可達(dá)80%[2]，患病雞主要表現(xiàn)食欲下降、血便、飼料轉(zhuǎn)化率降低、生長(zhǎng)發(fā)育受阻，蛋雞產(chǎn)蛋量下降[3]。 據(jù)估計(jì)2016年全球雞球蟲(chóng)病的名義經(jīng)濟(jì)成本超過(guò)了10.4億英鎊，主要包括治療、死亡和控制成本[4]。從20世紀(jì)40年代開(kāi)始，幾種磺胺類藥物被用作抗球蟲(chóng)藥物，隨后又推出一系列合成和離子載體藥物產(chǎn)品[5]。雖然抗球蟲(chóng)藥物在控制球蟲(chóng)病方面發(fā)揮了巨大作用, 但由于抗球蟲(chóng)藥物的長(zhǎng)期使用,導(dǎo)致針對(duì)不同抗球蟲(chóng)藥物的耐藥性球蟲(chóng)的出現(xiàn),從而引起了越來(lái)越嚴(yán)重的抗球蟲(chóng)藥物耐藥性問(wèn)題[6]。而近年來(lái)由于耐藥蟲(chóng)株的產(chǎn)生及抗球蟲(chóng)藥限制使用等規(guī)定[7]，使得球蟲(chóng)病的防治再次陷入困境。相對(duì)抗球蟲(chóng)藥而言，雞球蟲(chóng)疫苗是預(yù)防雞球蟲(chóng)病最理想的一種方法，具有操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)。隨著球蟲(chóng)強(qiáng)毒苗廣泛的使用，逐漸出現(xiàn)如安全性差、免疫反應(yīng)大和影響生產(chǎn)性能等難以克服的缺點(diǎn)，進(jìn)而研究人員通過(guò)壓力選擇研制卵囊排出最小潛在期縮短或裂殖生殖缺失一代最終導(dǎo)致毒力相對(duì)減弱的早熟蟲(chóng)株疫苗。研究發(fā)現(xiàn)，早熟株疫苗具有穩(wěn)定、高效、對(duì)動(dòng)物生產(chǎn)性能影響較小，可誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫力和保護(hù)力等優(yōu)點(diǎn)。該研究通過(guò)毒害艾美耳球蟲(chóng)(Eimerianecatrix)早熟株對(duì)雞進(jìn)行2次免疫，然后在雞不同日齡接種毒害艾美耳球蟲(chóng)親本株，檢測(cè)免疫相關(guān)指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)抗球蟲(chóng)效果，為獲得安全和有效的雞球蟲(chóng)疫苗株提供試驗(yàn)參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1日齡雞購(gòu)自北京市華都峪口禽業(yè)有限責(zé)任公司，鹽酸氨丙啉購(gòu)自惠康動(dòng)物藥業(yè)有限公司，毒害艾美耳球蟲(chóng)(Eimerianecatrix)親本株和毒害艾美耳球蟲(chóng)(Eimerianecatrix)早熟株由北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院球蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室保存。試驗(yàn)已通過(guò)北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物福利與倫理審查，編號(hào)BUA2021040。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)雞分組和免疫處理 無(wú)球蟲(chóng)條件下育1日齡雞備用，取4日齡健康、體質(zhì)量50～70 g雞隨機(jī)分為對(duì)照組、鹽酸氨丙啉添加組、一免組和二免組，每組50只雞地面飼養(yǎng)，試驗(yàn)期81 d。對(duì)照組、免疫組(免疫組包括一免組和二免組)雞飼喂基礎(chǔ)日糧，鹽酸氨丙啉添加組雞按照藥物說(shuō)明全程基礎(chǔ)日糧加鹽酸氨丙啉拌服。采用的日糧為無(wú)抗生素添加的基礎(chǔ)日糧(表1)。一免組雞4日齡一免，劑量1 000個(gè)/只毒害艾美耳球蟲(chóng)早熟株孢子化卵囊；二免組雞53日齡二免，劑量200個(gè)/只毒害艾美耳球蟲(chóng)早熟株孢子化卵囊。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平Tab.1 Composition and nutritional level of the basic diet

在雞25日齡、53日齡、74日齡時(shí)從地面飼養(yǎng)的各組隨機(jī)抽取6只雞移到籠上飼養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置紅對(duì)照組(雞不免疫不喂藥僅攻毒)?；\養(yǎng)雞除對(duì)照組外，其他試驗(yàn)組雞均攻毒，攻毒方法為逐只雞經(jīng)口接種毒害艾美耳球蟲(chóng)親本株(10×104個(gè)孢子化卵囊/只)。免疫組雞自免疫后第7天每天檢測(cè)每克糞便中的卵囊數(shù)(oocyst per gram，OPG)，直到試驗(yàn)結(jié)束。

1.2.2 飼養(yǎng)管理 雞飼養(yǎng)在北京農(nóng)學(xué)院雞球蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室，試驗(yàn)前對(duì)雞舍進(jìn)行全面沖刷、消毒。飼養(yǎng)期間，自然光照加人工補(bǔ)光，光照強(qiáng)度30 Lx，1～7日齡每天光照24 h，8日齡后每天光照23 h、黑暗1 h。雞舍溫度第1天到第7天33～35 ℃，之后每7 d下降2 ℃，至25 ℃不再下降。每天定時(shí)飼喂1次，自由采食、自由飲水，注意雞舍衛(wèi)生及合理通風(fēng)。

1.2.3 相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)的測(cè)定 試驗(yàn)期間肉眼觀察和記錄各組雞的精神狀態(tài)、采食、飲水、活動(dòng)狀況及糞便情況，并在雞25日齡、53日齡、74日齡攻毒當(dāng)天和攻毒后第7天稱取體質(zhì)量，計(jì)算雞相對(duì)體增質(zhì)量、存活率、小腸病變記分、小腸病變記分減少率(reduction in lesion scores，RLS)、卵囊數(shù)、卵囊減少率和抗球蟲(chóng)指數(shù)(anticoccidiosis index，ACI)。

平均體增質(zhì)量=平均終期體質(zhì)量―平均初期體質(zhì)量

相對(duì)平均體增質(zhì)量率=試驗(yàn)組雞平均體增質(zhì)量/對(duì)照組雞平均體增質(zhì)量×100%

(1)

存活率=組內(nèi)存活雞只數(shù)/試驗(yàn)前組內(nèi)總雞只數(shù)×100%

采用麥克馬斯特氏計(jì)數(shù)法計(jì)算每克盲腸糞便卵囊數(shù)，根據(jù)陳春林等[8]提供的方法對(duì)卵囊值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

卵囊減少率=(紅對(duì)照組卵囊平均產(chǎn)量-試驗(yàn)組卵囊平均產(chǎn)量)/紅對(duì)照組卵囊平均產(chǎn)量×100%

(2)

小腸病變記分按文獻(xiàn)[9]標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算。

病變值=各組雞小腸平均病變記分×10

小腸病變記分減少率=(紅對(duì)照組小腸平均病變記分-試驗(yàn)組小腸平均病變記分)/紅對(duì)照組小腸平均病變記分×100%

(3)

公式(1)和(2)及(3)中試驗(yàn)組分別指鹽酸氨丙啉添加組、一免組和二免組。

抗球蟲(chóng)指數(shù)(ACI)=(存活率+相對(duì)平均體增質(zhì)量率)×100%―(病變值+卵囊值)。

其判定標(biāo)準(zhǔn)[10]ACI<120為療效差，120≤ACI<160為療效中等，160≤ACI<180為療效良好，ACI≥180為療效優(yōu)秀。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 Graph pad Prism 8.0軟件One-Way ANOVA分析組間差異，其中P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 雞免疫毒害艾美耳球蟲(chóng)早熟株后的臨床表現(xiàn)

肉眼觀察試驗(yàn)期間雞狀態(tài)和25日齡、53日齡、74日齡雞攻毒后5～7 d血便情況。整個(gè)試驗(yàn)期間對(duì)照組雞精神狀態(tài)良好，采食、飲水正常，被毛整齊，未出現(xiàn)任何臨床癥狀。25日齡、53日齡、74日齡雞攻毒后第4天，紅對(duì)照組雞開(kāi)始出現(xiàn)精神萎靡、食欲不佳、飲水下降、扎堆，第5天到第7天出現(xiàn)血便連片；攻毒后第7天其中53日齡雞出現(xiàn)死亡；25日齡、53日齡、74日齡雞攻毒后第5天，鹽酸氨丙啉添加組雞表現(xiàn)精神萎靡、扎堆、飲水和食欲均下降，并出現(xiàn)大量血便；25日齡、53日齡、74日齡雞攻毒后一免組和二免組雞食欲與飲水稍微下降、雞只出現(xiàn)少量血便，至第6天逐漸恢復(fù)正常。

2.2 雞免疫毒害艾美耳球蟲(chóng)早熟株后對(duì)體質(zhì)量的影響

25日齡、53日齡、74日齡雞攻毒后第7天，鹽酸氨丙啉添加組和免疫組雞平均體增質(zhì)量均明顯低于對(duì)照組但顯著或極顯著高于紅對(duì)照組，二免組高于一免組(圖1)；免疫組和鹽酸氨丙啉添加組相比，25日齡雞攻毒后免疫組平均體增質(zhì)量明顯高于鹽酸氨丙啉添加組，在53日齡和74日齡雞攻毒后免疫組平均體增質(zhì)量顯著低于鹽酸氨丙啉添加組。

2.3 雞免疫毒害艾美耳球蟲(chóng)早熟株后的免疫保護(hù)

毒害艾美耳球蟲(chóng)早熟株免疫后雞的存活率、小腸病變記分、小腸病變記分減少率和抗球蟲(chóng)指數(shù)見(jiàn)表2。試驗(yàn)周期內(nèi)除53日齡雞攻毒后紅對(duì)照組有2只雞死亡外，其余各組雞均無(wú)死亡；免疫組雞小腸平均病變記分均低于紅對(duì)照組，小腸病變記分減少率高于紅對(duì)照組，其中二免組不同日齡雞(25日齡、53日齡、74日齡)攻毒后雞小腸平均病變記分均低于一免組，小腸病變記分減少率均高于一免組，且74日齡雞攻毒后小腸病變記分減少率最高；不同日齡雞攻毒后鹽酸氨丙啉添加組和免疫組抗球蟲(chóng)指數(shù)極顯著高于紅對(duì)照組，雞在25日齡攻毒后免疫組抗球蟲(chóng)指數(shù)高于鹽酸氨丙啉添加組，但在53日齡和74日齡攻毒后免疫組的抗球蟲(chóng)指數(shù)低于鹽酸氨丙啉添加組，然而二免組不同日齡雞抗球蟲(chóng)指數(shù)均高于145且高于一免組，即二免組雞抗球蟲(chóng)效果達(dá)到中效水平。

注：與對(duì)照組相比，#表示差異顯著(P<0.05)，##表示差異極顯著(P<0.01)；紅對(duì)照組與其他組相比，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。Note: Compared with the control group,# indicates significant difference (P<0.05), ## indicates extremely significant difference (P<0.01); Compared with the red control group , * indicates significant difference (P<0.05), ** indicates extremely significant difference (P<0.01). 圖1 不同日齡雞免疫毒害艾美耳球蟲(chóng)早熟株體質(zhì)量變化Fig.1 The weight gain of chicks immunized Eimeria necatrix precocious strains with different days

表2 雞免疫毒害艾美耳球蟲(chóng)早熟株后的免疫保護(hù)Tab.2 The immune protection of chickens immunized with precocious strains of Eimeria necatrix

2.4 雞免疫毒害艾美耳球蟲(chóng)早熟株后對(duì)卵囊產(chǎn)出的影響

采用麥克馬斯特氏計(jì)數(shù)法計(jì)算雞每克盲腸糞便中的卵囊數(shù)(表3)。在不同日齡攻毒后紅對(duì)照組雞卵囊數(shù)均顯著高于鹽酸氨丙啉添加組和免疫組，其中25日齡攻毒后免疫組雞卵囊數(shù)均明顯低于鹽酸氨丙啉添加組，53日齡攻毒后免疫組雞卵囊數(shù)均顯著高于鹽酸氨丙啉添加組，74日齡攻毒后免疫組雞卵囊數(shù)極高于鹽酸氨丙啉添加組且一免組高于二免組；免疫組25日齡雞卵囊減少率極顯著高于鹽酸氨丙啉添加組且高達(dá)85%以上，免疫組53日齡和74日齡雞卵囊減少率低于鹽酸氨丙啉添加組，但二免組74日齡雞卵囊減少率高于一免組且高達(dá)90%。

感染毒害艾美耳球蟲(chóng)后第7天到第81天一免組與二免組雞排出糞便中卵囊數(shù)變化情況見(jiàn)圖2。在感染后的第128 小時(shí)各感染組雞糞便中均檢測(cè)到卵囊，一免組和二免組雞在7～56 d間雞卵囊排出量變化不大，在60～77 d間二免組雞卵囊排出量明顯高于一免組，且在65 d雞排出卵囊量出現(xiàn)小高峰。表明2次人工免疫可延長(zhǎng)卵囊排出時(shí)間,即延長(zhǎng)免疫保護(hù)時(shí)間。

表3 雞免疫毒害艾美耳球蟲(chóng)早熟株后對(duì)卵囊產(chǎn)出的影響Tab.3 The production of coccidial oocysts from chickens immunized with Eimeria necatrix precocious strain

圖2 雞免疫毒害艾美耳球蟲(chóng)早熟株后的卵囊數(shù)變化Fig.2 Changes of oocyst numbers in chickens immunized with Eimeria necatrix precocious strain

3 討 論

不同種艾美耳球蟲(chóng)誘導(dǎo)的免疫強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間因其生物學(xué)特性和免疫方法的不同而不同，在7種雞艾美耳球蟲(chóng)中毒害艾美耳球蟲(chóng)的免疫保護(hù)力最弱，至少需要3個(gè)生命周期才能逐步建立對(duì)致病性毒害艾美耳球蟲(chóng)的免疫保護(hù)[11]。該試驗(yàn)采用毒害艾美耳球蟲(chóng)早熟株2次免疫雞(4日齡一免，53日齡二免)，并于免疫后3次接種毒害艾美耳球蟲(chóng)親本株(25日齡、53日齡、74日齡)，通過(guò)檢測(cè)免疫保護(hù)相關(guān)指標(biāo)評(píng)價(jià)毒害艾美耳球蟲(chóng)早熟株對(duì)雞的免疫效果。在25日齡、53日齡、74日齡攻毒后，免疫組雞表現(xiàn)較強(qiáng)的免疫保護(hù)力，即與紅對(duì)照組相比，相對(duì)體增質(zhì)量顯著升高、雞小腸病變記分顯著下降、盲腸糞便中卵囊數(shù)明顯減少。另外，與25日齡攻毒相比，53日齡攻毒后紅對(duì)照組雞出現(xiàn)死亡，相對(duì)體增質(zhì)量最低、腸道病變程度最嚴(yán)重和抗球蟲(chóng)指數(shù)最低，這也表明53日齡左右是毒害艾美耳球蟲(chóng)易感日齡；在74日齡攻毒后一免組雞無(wú)抗球蟲(chóng)效果，二免組雞抗球蟲(chóng)效果達(dá)中效，且二免組雞小腸病變記分和卵囊數(shù)低于前2次攻毒。

在研究雞球蟲(chóng)早熟株的免疫效果時(shí), 羅鵬[12]和李瑞琪等[13]發(fā)現(xiàn)2次免疫的效果優(yōu)于只進(jìn)行1次免疫，與該試驗(yàn)結(jié)果相同。研究表明，雞體一免后其體內(nèi)產(chǎn)生的抗體可在一段時(shí)間內(nèi)提供足夠的免疫保護(hù)力[13]，但是體內(nèi)抗體會(huì)隨著時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低以至于消失，為了使機(jī)體內(nèi)的抗體水平恢復(fù)，則需要在合適時(shí)間進(jìn)行第2次免疫，從而延長(zhǎng)免疫保護(hù)力。該試驗(yàn)選擇一免后第49天(53日齡)進(jìn)行二免，二免組雞獲得良好的免疫力。球蟲(chóng)病康復(fù)雞對(duì)再感染球蟲(chóng)有抵抗力，但若缺乏再次感染，隨飼養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)雞對(duì)球蟲(chóng)的免疫力會(huì)減弱，這是因?yàn)槊庖叽螖?shù)少產(chǎn)生免疫抗體滴度低，不能很好的預(yù)防球蟲(chóng)病，而2次免疫可使抗體水平迅速提高，且免疫產(chǎn)生的抑制期較短[14]。有研究報(bào)道，雛雞在嚴(yán)格無(wú)球蟲(chóng)的環(huán)境中飼養(yǎng)，免疫接種球蟲(chóng)活卵囊后雞的免疫力隨著時(shí)間延長(zhǎng)而下降，但若再次免疫接種后免疫期將會(huì)延長(zhǎng)，免疫力亦有所增強(qiáng)[15]。事實(shí)上，雞球蟲(chóng)免疫是一種典型的局部帶蟲(chóng)免疫，卵囊的反復(fù)感染是形成免疫保護(hù)力的必要條件，且隨時(shí)間變化而呈現(xiàn)一定程度的波動(dòng)[11]。