豬圓環(huán)病毒3型衣殼蛋白抗體間接酶聯(lián)免疫吸附測定方法的建立與應(yīng)用

謝曉妍，石玉佩，李瀟南，段燕方，張永紅，周雙海

(北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206)

豬圓環(huán)病毒屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，具有多種基因型。豬圓環(huán)病毒1型(porcine circovirus type 1，PCV1)是20世紀(jì)70年代被發(fā)現(xiàn)的，對豬沒有致病性[1]。豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)是20世紀(jì)90年代被發(fā)現(xiàn)的，能引起多種豬圓環(huán)病毒疾病，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成較大經(jīng)濟損失[2]。豬圓環(huán)病毒3型(porcine circovirus type 3，PCV3)是在2016年被報道發(fā)現(xiàn)的，能引起豬皮炎與腎病綜合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)，并與母豬繁殖障礙和心肌炎等疾病相關(guān)[3-5]。由于PCV2的廣泛性分布和對養(yǎng)豬業(yè)的顯著危害性，PCV3被發(fā)現(xiàn)后就迅速引起養(yǎng)豬行業(yè)人員的關(guān)注。目前PCV3已在中國的多個地區(qū)被檢出，并顯示出較高的感染率[6-8]。目前沒有PCV3商品疫苗，加強PCV3感染的診斷和流行病學(xué)調(diào)查具有重要臨床意義。

目前，對PCV3感染的檢測主要依賴于PCR技術(shù)，尚缺乏商品化的PCV3抗體檢測試劑盒。與PCV2相同，PCV3也只有一個結(jié)構(gòu)蛋白，也就是衣殼蛋白[3,9]。對于PCV2，衣殼蛋白是診斷抗原的最重要靶蛋白[2]。對于PCV3，已在其衣殼蛋白上發(fā)現(xiàn)3個保守的B細胞抗原表位[10]，故其可作為診斷抗原。該研究旨在利用前期原核表達的截短型重組PCV3衣殼蛋白[11]建立一種檢測PCV3衣殼蛋白抗體的間接酶聯(lián)免疫吸附測定方法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，以期建立一種檢測PCV3抗體和PCV3感染的血清學(xué)方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和血清

純化的截短型重組PCV3衣殼蛋白抗原由北京農(nóng)學(xué)院動物疫病研究室制備[11]；兔抗豬IgG-HRP、四甲基聯(lián)苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)顯色液、終止液、洗滌液等均為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品。PCV1、PCV2、PCV3、偽狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)、豬細小病毒(porcine parvovirus，PPV)、豬瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)及豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)的陽性血清和PCV3陰性血清由北京農(nóng)學(xué)院動物疫病研究室保存。

1.2 間接ELISA的基礎(chǔ)操作步驟

取重組PCV3衣殼蛋白抗原包被的酶標(biāo)板條，在室溫下加入血清，37 ℃孵育60 min；棄去液體，用洗滌液洗滌3次，每次1 min，在濾紙上拍干；加入兔抗豬IgG-HRP，37 ℃孵育60 min；用洗滌液洗滌3次，每次1 min，在濾紙上拍干；加入TMB顯色液，37 ℃避光反應(yīng)15 min；加入終止液，15 min內(nèi)用酶標(biāo)儀測定OD450 nm值。

1.3 間接ELISA反應(yīng)條件的篩選

將包被抗原的不同梯度稀釋質(zhì)量濃度(4.880、2.440、1.220、0.610、0.305 μg/mL)和血清的不同梯度稀釋度(1∶25、1∶50和1∶100)組成方陣，按照“1.2”間接ELISA的基礎(chǔ)操作步驟進行方陣滴定試驗篩選和確定最佳的包被抗原質(zhì)量濃度與血清稀釋度。依次對血清孵育時間(0.5、1.0、1.5和2.0 h)、酶標(biāo)二抗的稀釋度(1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000和1∶16 000)和孵育時間(0.5、1.0、1.5和2.0 h)、TMB底物反應(yīng)時間(5、10、15、20和25 min)按照“1.2”間接ELISA的基礎(chǔ)操作步驟進行篩選和優(yōu)化。

1.4 陰陽性臨界值的確定

取30份PCV3陰性血清，按已確定的間接ELISA最佳反應(yīng)條件進行檢測，計算其OD450 nm值的平均數(shù)(x)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。當(dāng)OD450 nm值≥x+3SD時，判為陽性；當(dāng)OD450 nm值

1.5 特異性試驗

用“1.3”已確定的最佳反應(yīng)條件檢測PCV1、PCV2、PRV、PPV、CSFV、PRRSV和PEDV陽性血清，同時用PCV3的陽性血清和陰性血清作為對照，檢測所建立方法的特異性。

1.6 重復(fù)性試驗

用同一時間制備的酶標(biāo)板檢測6份血清，每份血清重復(fù)檢測3次，計算變異系數(shù)，評估批內(nèi)試驗的可重復(fù)性。用3個不同時間制備的酶標(biāo)板檢測這6份血清，每份血清重復(fù)檢測3次，計算變異系數(shù)，評估批間試驗的可重復(fù)性。

1.7 臨床樣品檢測及統(tǒng)計分析

用建立的間接ELISA檢測方法對2019年來自河北地區(qū)的70份、北京地區(qū)的248份豬血清樣本進行檢測，并用卡方檢驗對兩個地區(qū)的抗體陽性率進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 間接ELISA反應(yīng)條件的確定

包被抗原質(zhì)量濃度和血清稀釋倍數(shù)的方陣滴定結(jié)果見表1。當(dāng)包被抗原質(zhì)量濃度為0.610 μg/mL、血清稀釋度為1∶25時，P/N值最大、為12.495，故確定間接ELISA的最佳包被抗原質(zhì)量濃度為0.610 μg/mL、最佳血清稀釋度為1∶25。依次確定最佳血清孵育時間為1.0 h，酶標(biāo)二抗的最佳稀釋度為1∶4 000、最佳孵育時間為1.0 h，TMB底物最佳反應(yīng)時間為15 min。

表1 包被抗原質(zhì)量濃度和血清稀釋度的篩選Tab.1 Screening of the coating antigen concentration and serum dilution ratio

2.2 陰陽臨界值的確定

按照確定的最佳反應(yīng)條件，檢測30份PCV3陰性血清，計算得出平均數(shù)ˉx= 0.122，標(biāo)準(zhǔn)差SD=0.029。故確定，當(dāng)待測血清樣品OD450 nm值≥0.209時，判為陽性；當(dāng)OD450 nm值<0.180時，判為陰性；而當(dāng)0.180≤OD450 nm值<0.209時，判為可疑。

2.3 特異性試驗結(jié)果

用建立的檢測方法檢測PCV1、PCV2、PRV、PPV、CSFV、PRRSV和PEDV陽性血清，并設(shè)立PCV3陽性血清和陰性血清對照，結(jié)果(表2)顯示只有PCV3陽性血清的檢測結(jié)果為陽性，說明建立的檢測方法具有良好的特異性。

表2 特異性試驗數(shù)據(jù)Tab.2 Data of specificity test

2.4 重復(fù)性試驗結(jié)果

批內(nèi)重復(fù)性試驗結(jié)果見表3，變異系數(shù)介于0.78%～3.57%之間，都小于5%，表明批內(nèi)重復(fù)性良好。批間重復(fù)性試驗結(jié)果見表3，變異系數(shù)介于0.60%～4.32%之間，都小于5%，表明批間重復(fù)性良好。

表3 重復(fù)性試驗數(shù)據(jù)Tab.3 Data of repeatability test

2.5 臨床樣品檢測結(jié)果

用建立的間接ELISA檢測方法檢測2019年從河北地區(qū)、北京地區(qū)采集的血清樣品，檢測出總的PCV3抗體陽性率為32.70%。其中，河北地區(qū)的檢測陽性率為42.86%(30/70)，北京地區(qū)的檢測陽性率為29.84%(74/248)，二者之間無顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

PCV3是2016年首次發(fā)現(xiàn)的一種新的致病性豬圓環(huán)病毒[3]，已經(jīng)在中國一些地區(qū)和豬場流行，并呈逐漸上升趨勢[12]。目前，中國對于PCV3感染的檢測，大多數(shù)采用PCR方法檢測病毒核酸；但是在大規(guī)模檢測時，用ELISA等血清學(xué)方法檢測病毒抗體無疑要更加實用，不過目前中國還沒有檢測PCV3抗體的商品化試劑盒。

由于衣殼蛋白是豬圓環(huán)病毒的唯一結(jié)構(gòu)蛋白，并具有良好的免疫原性，因此，檢測豬圓環(huán)病毒感染的抗體檢測試劑絕大多數(shù)都是基于其衣殼蛋白作為診斷抗原而研制的。有研究者比較分別以全病毒和衣殼蛋白為診斷抗原而建立的檢測PCV2抗體的兩種ELISA，發(fā)現(xiàn)用衣殼蛋白作為診斷抗原時更加有效[13]。前期試驗已經(jīng)高效表達出包含有PCV3衣殼蛋白大多數(shù)抗原表位的截短的重組衣殼蛋白[10-11]，以之作為抗體檢測用的包被抗原，按照間接ELISA操作規(guī)程對其各項反應(yīng)條件進行篩選與優(yōu)化，建立一種可用于檢測PCV3抗體的間接ELISA。這一方法能夠有效檢測臨床血清樣品中的PCV3抗體，并且不會與當(dāng)前普遍存在的其他豬傳染病病原的陽性血清發(fā)生交叉免疫反應(yīng)，顯示出良好的特異性。這一方法的批內(nèi)重復(fù)性試驗和批間重復(fù)性試驗的變異系數(shù)都小于5%，顯示出良好的可重復(fù)性。用該方法檢測來自2019年北京地區(qū)與河北地區(qū)的318份血清樣本，發(fā)現(xiàn)這兩個地區(qū)PCV3抗體的總體陽性率為32.70%，與之前的PCR檢測結(jié)果相近[7-8]，表明北京地區(qū)與河北地區(qū)的豬場存在較多的PCV3感染。PCV3作為一種新近出現(xiàn)的致病性豬圓環(huán)病毒，不僅能夠試驗感染引起PDNS[5]，還被認為與母豬繁殖障礙有關(guān)[3]，故存在PDNS和母豬繁殖障礙的地區(qū)與豬場，需要注意防范PCV3的傳入和感染。

試驗建立的PCV3衣殼蛋白抗體間接ELISA具有良好的特異性和可重復(fù)性，能夠?qū)εR床樣品進行有效檢測，為PCV3感染的診斷及其流行病學(xué)調(diào)查提供一種技術(shù)支撐，也為PCV3 抗體檢測間接ELISA試劑盒的商品化建立基礎(chǔ)。