蒼術(shù)高效液相色譜指紋圖譜的建立

白悅?cè)?，趙世津，傅業(yè)全，王建舫

(北京農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/動(dòng)物類國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，北京 102206)

蒼術(shù)為菊科植物茅蒼術(shù)(Atractylodeslancea(Thunb.) DC.)或北蒼術(shù)(Atractylodeschinensis(DC.) Koidz.)的干燥根莖，春季、秋季采挖，除去泥沙，曬干，撞去須根[1]。茅蒼術(shù)主要分布于江蘇、湖北、河南、安徽、浙江、江西等省；北蒼術(shù)主要分布于內(nèi)蒙古、河北、山西、遼寧、吉林、黑龍江等省區(qū)[2]。2020版《中國(guó)藥典》蒼術(shù)藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)僅以蒼術(shù)素含量作為標(biāo)準(zhǔn)，中藥指紋圖譜具有特征性、整體性、模糊性等特點(diǎn)，可充分反映中藥復(fù)雜體系中各成分的整體狀況，是目前中藥質(zhì)量控制較有效的手段之一[3]。蒼術(shù)色譜指紋圖譜的方法分為薄層色譜指紋圖譜[4-5]、氣相色譜指紋圖譜[6]和高效液相色譜指紋圖譜(high performance liquid chroma-tography，HPLC)[7-13]等。高效液相色譜指紋圖譜能更全面準(zhǔn)確反映蒼術(shù)藥材各成分的狀況，其方法中使用的流動(dòng)相分為酸性[7-9]和中性[10-13]，其中酸性流動(dòng)相更有利于蒼術(shù)中酸性成分的分離，中性流動(dòng)相更有利于蒼術(shù)中性成分的分離，而蒼術(shù)中的酸性成分總量較少，中性成分含量較多，故該試驗(yàn)采用中性流動(dòng)相。該試驗(yàn)旨在建立18批蒼術(shù)藥材的高效液相色譜指紋圖譜，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行聚類分析和主成分分析，以期為蒼術(shù)藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和儀器

白術(shù)內(nèi)酯I對(duì)照品(批號(hào)為P08J9F50979)和(4E,6E,12E)-十四碳三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯對(duì)照品(批號(hào)為M28J12S138942)均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。蒼術(shù)素對(duì)照品(批號(hào)為19072205)，購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司。蒼術(shù)樣品經(jīng)北京農(nóng)學(xué)院園林學(xué)院田曄林鑒定，詳情見(jiàn)表1。

試驗(yàn)儀器按照文獻(xiàn)[14]配備。

表1 18批蒼術(shù)樣品信息來(lái)源Tab.1 Information sources of 18 batches of Atractylodis Rhizoma

1.2 色譜條件

艾杰爾-飛諾美Venusil MP C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)。流動(dòng)相為水、甲醇和乙腈，梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表2。檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

表2 洗脫程序Tab.2 Elution procedure

1.3 溶液的配制

1.3.1 混合對(duì)照品溶液的制備 取白術(shù)內(nèi)酯I對(duì)照品、(4E,6E,12E) -十四碳三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯對(duì)照品、蒼術(shù)素對(duì)照品適量，置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，用0.22 μm的有機(jī)濾膜過(guò)濾，即可。

1.3.2 蒼術(shù)樣品溶液的制備 取蒼術(shù)藥材粉末，用孔徑270 μm濾網(wǎng)過(guò)濾，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，密塞，稱定，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)，40 ℃，1 h，放冷，再稱定，用甲醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量，搖勻，用孔徑74 μm濾網(wǎng)過(guò)濾，用孔徑0.22 μm的有機(jī)濾膜過(guò)濾，即可[14]。

1.4 方法學(xué)考察

方法學(xué)考察參考文獻(xiàn)[9,15]。

1.4.1 日內(nèi)精密度試驗(yàn) 取第8批蒼術(shù)樣品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖，對(duì)所得色譜圖進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4.2 日間精密度試驗(yàn) 取第8批蒼術(shù)樣品溶液，分別在0、24、48、72和96 h進(jìn)樣，記錄色譜圖，對(duì)所得色譜圖進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取第8批蒼術(shù)樣品溶液6份，記錄色譜圖，對(duì)所得色譜圖進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.5 指紋圖譜的建立及相似度分析

指紋圖譜的建立及相似度分析參考文獻(xiàn)[13,16-18]。混合對(duì)照品溶液和18批蒼術(shù)樣品溶液，按照“1.2”進(jìn)樣，用Empower 2軟件導(dǎo)出AIA 格式色譜圖。相似度評(píng)價(jià)采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”軟件( 2012 版)。把第1批蒼術(shù)樣品的色圖譜設(shè)為參照?qǐng)D譜，采用中位數(shù)法，時(shí)間窗寬度0.5 min，進(jìn)行色譜峰匹配。

1.6 聚類分析

聚類分析參考文獻(xiàn)[19-24]。以18批蒼術(shù)樣品的峰面積為變量，利用SPSS20.0 進(jìn)行聚類分析。

1.7 主成分分析

主成分分析參考文獻(xiàn)[19-27]。以18 個(gè)共有峰峰面積為變量，利用SPSS20.0 進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 日內(nèi)精密度試驗(yàn) 取第8批蒼術(shù)樣品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，相似度均大于0.99，白術(shù)內(nèi)酯I和蒼術(shù)素的保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.07%和0.10%，峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.33%和1.25%。日內(nèi)精密度良好。

2.1.2 日間精密度試驗(yàn) 取第8批蒼術(shù)樣品溶液，分別在0、24、48、72和96 h進(jìn)樣，相似度均大于0.99，白術(shù)內(nèi)酯I和蒼術(shù)素的保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.19%和0.36%，峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.42%和1.48%。日間精密度良好。

2.1.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取第8批蒼術(shù)樣品溶液6份進(jìn)行測(cè)定，相似度均大于0.98，白術(shù)內(nèi)酯I和蒼術(shù)素的保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.10%和0.13%，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.41%和1.37%。重復(fù)性良好。

2.2 指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

2.2.1 指紋圖譜的建立 將第1批蒼術(shù)樣品的色譜圖設(shè)為參照?qǐng)D譜，進(jìn)行色譜峰匹配，得到圖1的指紋圖譜，在橫坐標(biāo)保留時(shí)間5 min和70 min范圍內(nèi)共出現(xiàn)了18個(gè)共有峰。

2.2.2 共有峰確認(rèn)和參照峰的選擇 將已確定的18個(gè)共有峰與混合對(duì)照品的色譜峰進(jìn)行比較，指認(rèn)了3個(gè)色譜峰，分別為白術(shù)內(nèi)酯I( 13 號(hào)峰)、(4E,6E,12E)-十四碳三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯( 14 號(hào)峰)、蒼術(shù)素( 15 號(hào)峰)，見(jiàn)圖 2。

圖1 18批蒼術(shù)樣品的HPLC指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of 18 batches of Atractylodis Rhizoma

注：13是白術(shù)內(nèi)酯I；14是(4E,6E,12E) -十四碳三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯；15是蒼術(shù)素。Note:13 is atractylenolide I；14 is 4e, 6e, 12e-tetradecatriene-8,10-diyne-1,3-diacetate; 15 is atractylodin.圖2 蒼術(shù)樣品(A)和混合對(duì)照品(B)HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of Atractylodis Rhizoma sample(A)and mixed reference substances(B)

2.2.3 相似度評(píng)價(jià) 18批蒼術(shù)樣品的相似度在0.479～0.984之間(表3)。其中，S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S14、S17和S18之間的相似度均大于等于0.811。S12除與S16的相似度達(dá)到0.945外，與其他批次的相似度均小于等于0.830。S13除與S15的相似度為0.983外，與其他批次的相似度均小于等于0.826。

表3 18批蒼術(shù)樣品相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab.3 Similarity evaluation results of eighteen batches of Atractylodis Rhizoma samples

2.3 聚類分析

18批蒼術(shù)樣品HPLC指紋圖譜中的峰面積經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后，運(yùn)用SPSS 20.0進(jìn)行聚類分析，選擇以組間連接作為聚類方法，度量標(biāo)準(zhǔn)選擇平方 Euclidean 距離，繪制樹(shù)狀圖，所得聚類分析結(jié)果見(jiàn)圖3。當(dāng)分類距離為20時(shí)，蒼術(shù)樣品分為2類，S12和S16聚為一類，S1～S11、S13～S15、S17和S18聚為一類。當(dāng)分類距離為10時(shí)，蒼術(shù)樣品分為3類，S12和S16聚為一類，S13和S15聚為一類，S1～S11、S14、S17和S18聚為一類。當(dāng)分類距離為5時(shí)，蒼術(shù)樣品分為6類，S12和S16聚為一類，S13和S15聚為一類，S5和S17聚為一類，S7～S10聚為一類，S3、S6、S14、S18聚為一類，S1、S2、S4、S11聚為一類。

圖3 18批蒼術(shù)樣品的聚類分析樹(shù)狀圖Fig.3 Cluster analysis dendrogram of 18 batches of Atractylodis Rhizoma

2.4 主成分分析

將18批蒼術(shù)樣品的18個(gè)共有峰峰面積導(dǎo)入 SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行主成分分析，以特征值1為提取標(biāo)準(zhǔn)，篩選得到5個(gè)主成分(見(jiàn)表4和圖4)。主成分1是5.917，主成分2是4.226，主成分3是2.885，主成分4是1.617，主成分5是1.219；這5個(gè)主成分的方差貢獻(xiàn)率依次為32.875%、23.477%、16.029%、8.986%和6.772%，主成分5的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)88.139%。

圖4 蒼術(shù)成分陡坡圖Fig.4 Scree plot of Atractylodis Rhizoma compoment

主成分1和峰1、峰3、峰4、峰6、峰7、峰11、峰16及峰17 的關(guān)系較為密切；主成分2和峰5、峰12、峰14、峰15及峰18的關(guān)系密切，峰14為(4E,6E,12E)-十四碳三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯、峰15為蒼術(shù)素；主成分3和峰8、峰9、峰10、峰13及峰14的關(guān)系密切，峰13為白術(shù)內(nèi)酯I、峰14為(4E,6E,12E)-十四碳三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯；主成分4和峰2及峰17的關(guān)系密切；主成分5和峰10的關(guān)系密切(表5)。

表4 蒼術(shù)主成分特征值和方差貢獻(xiàn)率Tab.4 Eigenvalue and variance contribution rate of Atractylodis Rhizoma compoment

3 討 論

試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，蒼術(shù)樣品經(jīng)粉碎，常溫保存7 d后，蒼術(shù)樣品中的蒼術(shù)素含量減少，可能是蒼術(shù)樣品粉末中的揮發(fā)油成分容易揮發(fā)出來(lái)，而經(jīng)甲醇萃取后，4 ℃避光保存，90 d后，蒼術(shù)樣品中的蒼術(shù)素含量基本沒(méi)有變化。

該試驗(yàn)采用二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行了190～400 nm全波長(zhǎng)掃描。在270 nm波長(zhǎng)處所得的色譜峰信息較為全面，可識(shí)別的化合物種類較豐富，故選擇270 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。試驗(yàn)先后對(duì)0.1%磷酸-乙腈、水-乙腈和水-甲醇-乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行考察，水-甲醇-乙腈作為流動(dòng)相時(shí)，出峰較多，峰型較好，且白術(shù)內(nèi)酯I和蒼術(shù)素峰均得到了較好的分離。

表5 蒼術(shù)主成分的載荷矩陣Tab.5 Component matrixa of Atractylodis Rhizoma compoment

蒼術(shù)樣品S12和S16相似度為0.945，聚為一類；S13和S15相似度為0.983，聚為一類；S5和S17相似度為0.978，聚為一類；S7～S10之間的相似度均大于等于0.948，聚為一類；S3、S6、S14、S18之間的相似度均大于等于0.911，聚為一類；S1、S2、S4、S11之間的相似度均大于等于0.947，聚為一類?？梢?jiàn)，當(dāng)分類距離為5時(shí)，相似度需大于或等于0.911才能聚為一類。當(dāng)分類距離為10時(shí)，S7～S10；S3、S6、S14、S18；S1、S2、S4、S11聚為一類，最小相似度為0.811。當(dāng)分類距離為20時(shí)，S7～S10；S3、S6、S14、S18；S1、S2、S4、S11；S5、S17；S13、S15聚為一類，最小相似度為0.628。總之，不同批次的蒼術(shù)樣品的相似度越高，聚為一類的可能性越大，聚類的分類距離越小。

關(guān)于蒼術(shù)指紋圖譜色譜峰的指認(rèn)，詹丹丹[7]指認(rèn)了原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸、阿魏酸、熊果酸、綠原酸等酸性成分，而沒(méi)有指認(rèn)出白術(shù)內(nèi)酯I、(4E,6E,12E)-十四碳三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯、蒼術(shù)素，可能因?yàn)檎驳さび玫乃嵝粤鲃?dòng)相，而酸性流動(dòng)相更有利于酸性成分的分離。該試驗(yàn)用的中性流動(dòng)相，蒼術(shù)中的酸性成分在2 min 內(nèi)很快被洗脫下來(lái)，所以沒(méi)有檢測(cè)到酸性成分。研究人員[8-9,13]分別建立了蒼術(shù)麩炒前后的指紋圖譜，并在270 nm處指認(rèn)了蒼術(shù)素醇、(4E,6E,12E)-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯和蒼術(shù)素[8-9]；在254 nm處指認(rèn)了共有峰白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ，鄰苯二甲酸二異丁酯、蒼術(shù)素[13]。該試驗(yàn)在蒼術(shù)指紋圖譜標(biāo)定的18個(gè)共有峰中，確認(rèn)了3個(gè)，分別為白術(shù)內(nèi)酯I、(4E,6E,12E)-十四碳三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯、蒼術(shù)素。結(jié)合主成分分析可知，白術(shù)內(nèi)酯I歸屬于主成分3，(4E,6E,12E)-十四碳三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯歸屬于主成分2和主成分3，蒼術(shù)素歸屬于主成分2。

該試驗(yàn)建立了蒼術(shù) HPLC 指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)18個(gè)共有峰，指認(rèn)了其中3個(gè)，初步反映了蒼術(shù)整體化學(xué)特征，檢測(cè)方法簡(jiǎn)單可行，重復(fù)性、穩(wěn)定性良好，同時(shí)結(jié)合聚類分析和主成分分析多方面評(píng)價(jià)蒼術(shù)質(zhì)量，為蒼術(shù)整體質(zhì)量控制提供了比較全面的評(píng)價(jià)模式。