基于SSR 標記和表型性狀構(gòu)建苦瓜核心種質(zhì)的研究

崔竣杰 程蛟文 曹 毅 胡開林*

（1 佛山科學技術學院食品科學與工程學院，廣東佛山 528225；2 華南農(nóng)業(yè)大學園藝學院，廣東廣州510642）

種質(zhì)資源的收集與保存一直以來受到世界各國的高度重視。據(jù)估計，全球大約有1 300 個基因庫，已保存大約600 萬份種質(zhì)材料（Ortiz Ríos，2015）。然而，對種質(zhì)資源的有效評價與利用仍然相對落后，目前僅有小部分用于了遺傳改良（Glaszmann et al.，2010）。對此，建立核心種質(zhì)庫并優(yōu)先對其進行評價和利用將會提高種質(zhì)資源的利用效率和管理水平（徐海明 等，2000）。

隨著分子生物學研究的進步，利用分子標記結(jié)合表型性狀構(gòu)建核心種質(zhì)已經(jīng)取得較好成效。核心種質(zhì)的抽樣通常采用M 策略（maximization strategy）、隨機抽樣法或R策略（random strategy）、遺傳距離法等。采用M 策略能夠最大限度地保留等位基因數(shù)量（Cipriani et al.，2010；郭大龍 等，2012），利用這一方法已經(jīng)構(gòu)建了黃瓜（Lv et al.，2012）、葡萄（郭大龍 等，2012）、橄欖（Muzzalupo et al.，2014）、杜仲（李洪果 等，2018）、平菇（Li et al.，2019）等的核心種質(zhì)；采用隨機抽樣法或R 策略有利于保持原始種質(zhì)的遺傳多樣性結(jié)構(gòu)（Hu et al.，2000），并在番茄核心種質(zhì)構(gòu)建中顯示對原始種質(zhì)的表型代表性最好（鄧學斌等，2015）；采用遺傳距離法能抽取出具有最大遺傳距離的種質(zhì)材料（Wang et al.，2007），利用這一方法已經(jīng)構(gòu)建了棉花（徐海明 等，2004）、苧麻（欒明寶 等，2010）、蘋果（劉遵春 等，2010）等的核心種質(zhì)。

苦瓜（L.）是我國普遍種植和消費的重要瓜類蔬菜。然而由于苦瓜起源于非洲（Schaefer &Renner，2010），種質(zhì)資源主要分布在非洲及亞洲的熱帶地區(qū)，因此我國的苦瓜種質(zhì)資源相對貧乏且遺傳背景狹窄（趙秀娟 等，2013；Cui et al.，2020）。為了拓寬苦瓜遺傳背景，最近數(shù)年筆者及研究團隊先后從非洲、美洲及亞洲等16個國家廣泛收集了逾200 份苦瓜種質(zhì)資源，經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)收集于中國的苦瓜種質(zhì)資源和南亞諸國如印度、巴基斯坦、孟加拉國等存在明顯的地理多樣性，來自于東南亞的苦瓜種質(zhì)資源的遺傳多樣性介于上述兩者之間（Cui et al.，2017，2020）。

有關苦瓜核心種質(zhì)的構(gòu)建，僅見劉子記等（2017）基于5 個表型性狀從中國、日本、泰國、斯里蘭卡和印度5 個國家收集的154 份苦瓜種質(zhì)資源中抽取出46 份核心種質(zhì)；而且利用分子標記結(jié)合表型性狀構(gòu)建苦瓜核心種質(zhì)還鮮見報道。因此本試驗以地理來源多樣的184 份苦瓜種質(zhì)資源為材料，利用苦瓜21 對SSR 標記和9 個表型性狀數(shù)據(jù)構(gòu)建苦瓜核心種質(zhì)，并對核心種質(zhì)與原始種質(zhì)進行差異比較評價，以期為苦瓜種質(zhì)資源保存和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以收集于13 個國家、世界蔬菜研究中心（WorldVeg）和種子公司的184 份苦瓜種質(zhì)為供試材料（表1），其中來自中國的種質(zhì)64 份、印度的21 份、越南的16 份、孟加拉國的11 份、菲律賓的10 份、尼泊爾的9 份、泰國的8 份、柬埔寨的6 份、坦桑尼亞的5 份、馬來西亞的4 份、印度尼西亞的3 份、斯里蘭卡的3 份、巴基斯坦的2 份、WorldVeg 的12 份和種子公司的10 份。

表1 184 份苦瓜種質(zhì)材料的地理來源（Cui et al.，2017）

2014 年秋季和2015 年春季在華南農(nóng)業(yè)大學增城教學基地分別對苦瓜9 個表型性狀進行調(diào)查，其中包括第1 雄花節(jié)位（first male flower node，F(xiàn)MFN）、第1雄花開花天數(shù)（days to first male flower opening，DFMO）、第1雌花節(jié)位（first female flower node，F(xiàn)FFN）、第1雌花開花天數(shù)（days to first female flower opening，DFFO）、子房長度（ovary length，OL）、子房直徑（ovary diameter，OD）、果長（fruit length，F(xiàn)L）、果徑（fruit diameter，F(xiàn)D）和棱寬（width of ridge，WR）。

1.2 分子標記及基本數(shù)據(jù)分析

基于Cui 等（2017）的苦瓜SSR 標記（表2）及基因型數(shù)據(jù)，2021 年對184 份苦瓜種質(zhì)資源的遺傳多樣性參數(shù)進行計算，利用PopGen 32 軟件計算觀測等位基因數(shù)（observed number of alleles，N）、有效等位基因數(shù)（effective number of alleles，N）和Shannon 指數(shù)（shannon’s information index，I）；利用PowerMarker V3.25軟件計算雜合性（heterozygosity，H）、基因多樣性（gene diversity，GD）和多態(tài)性信息含量（polymorphic information content，PIC）；利用NTsys 2.10 軟件進行主坐標分析。

表2 21 對苦瓜SSR 標記引物序列（Cui et al.，2017）

1.3 核心種質(zhì)構(gòu)建

以等位基因數(shù)目最大化（M 策略）為原則，利用Core Finder 軟件對SSR 數(shù)據(jù)進行分析，抽取核心種質(zhì)，參數(shù)interations 和random seed 分別設置為100 和1 000 000。按照多次聚類隨機取樣法，利用QGAStation 軟件對表型數(shù)據(jù)進行分析，按Core Finder 的抽取結(jié)果抽取相當比例的樣本。然后，合并Core Finder 和QGAStation 抽取的樣本作為核心種質(zhì)，剩余的種質(zhì)作為保留種質(zhì)。

1.4 核心種質(zhì)評價及分子身份信息構(gòu)建

對核心種質(zhì)和原始種質(zhì)的遺傳多樣性參數(shù)（N、N、I、H、GD、PIC）進行檢驗來評價核心種質(zhì)的基因型代表性。再根據(jù)Hu 等（2000）的評價方法，對核心種質(zhì)和原始種質(zhì)表型數(shù)據(jù)的均值進行檢測，對二者的方差進行檢測，通過計算均值差異百分率（mean difference percentage，MD%）、方差差異百分率（variance difference percentage，VD%）、極差符合率（coincidence rate，CR%）和變異系數(shù)變化率（variable rate，VR%）來評價核心種質(zhì)的表型代表性。4 個參數(shù)的計算公式如下：

S為核心種質(zhì)和原始種質(zhì)中均值存在顯著差異（α=0.05）的性狀數(shù)量，為性狀總數(shù)。

S為核心種質(zhì)和原始種質(zhì)中方差存在顯著差異（α=0.05）的性狀數(shù)量，為性狀總數(shù)。

R表示核心種質(zhì)的極差，R表示原始種質(zhì)的極差，為性狀總數(shù)。

CV表示核心種質(zhì)的變異系數(shù)，CV 表示原始種質(zhì)的變異系數(shù)，為性狀總數(shù)。

按多態(tài)性產(chǎn)物由小到大的順序進行編號，將SSR 電泳譜帶轉(zhuǎn)化為數(shù)字指紋圖譜并以此構(gòu)建苦瓜核心種質(zhì)的分子身份信息。根據(jù)公式=1/2計算指紋圖譜出現(xiàn)的概率，為等位基因的數(shù)目（吳渝生等，2003）。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦瓜原始種質(zhì)的表型變異及遺傳多樣性

對184 份苦瓜原始種質(zhì)的9 個表型性狀數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，結(jié)果表明（表3），棱寬的變異系數(shù)最高，為50.90%，第1 雌花開花天數(shù)的變異系數(shù)最低，為12.61%，其余7 個表型性狀的變異系數(shù)介于兩者之間。

表3 184 份苦瓜原始種質(zhì)材料的表型變異

利用21 對苦瓜SSR 標記對184 份苦瓜原始種質(zhì)進行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明（表4），SSR標記在原始種質(zhì)中平均觀測的等位基因數(shù)為5.10，平均有效等位基因數(shù)為2.49，平均Shannon 指數(shù)為1.02，平均雜合性為0.03，平均基因多樣性為0.55，平均多態(tài)性信息含量為0.48。

表4 184 份苦瓜原始種質(zhì)材料的遺傳多樣性

2.2 苦瓜核心種質(zhì)的抽取

利用Core Finder 軟件，采用M 策略進行抽樣，圖1 顯示當抽取樣品數(shù)量為19 份時，等位基因保留比例已接近100%。因此，通過SSR 基因型數(shù)據(jù)從184 份苦瓜原始種質(zhì)中抽取出19 份核心種質(zhì)（表5），抽樣比例為10.33%。然后，再利用QGAStation 軟件，采用隨機抽樣法通過9 個表型數(shù)據(jù)抽取相似比例的樣本，共抽取出18 份核心種質(zhì)（表5）。在兩種抽樣方式中有3 份種質(zhì)資源（編號20、58、60）重疊。綜合兩種抽樣的結(jié)果，最終獲得34 份核心種質(zhì)（抽樣比例為18.48%），其中來自10 個國家的有31 份，來自WorldVeg 的有2 份，來自種子公司的有1 份（表5）。圖2 的主坐標分析結(jié)果顯示，苦瓜34 份核心種質(zhì)較為均勻地分布在184 份原始種質(zhì)中。

圖1 Core Finder 抽取苦瓜核心種質(zhì)數(shù)與等位基因保留比例的變化關系

圖2 苦瓜核心種質(zhì)和保留種質(zhì)的主坐標分布

表5 34 份苦瓜核心種質(zhì)材料的基本信息

2.3 苦瓜核心種質(zhì)的評價與分析

對構(gòu)建的苦瓜34 份核心種質(zhì)的基因型代表性進行評價，結(jié)果表明（表6），該核心種質(zhì)保留了原始種質(zhì)93.46%的等位基因。測驗結(jié)果顯示，利用21 個SSR 位點對34 份核心種質(zhì)進行分析所獲得的6 個遺傳多樣性參數(shù)與184 份原始種質(zhì)均沒有顯著性差異。初步認為，34 份核心種質(zhì)能夠代表184 份原始種質(zhì)的遺傳多樣性。

表6 苦瓜核心種質(zhì)、原始種質(zhì)與保留種質(zhì)的遺傳多樣性對比

然后，基于苦瓜9 個表型性狀的調(diào)查結(jié)果，對構(gòu)建的34 份核心種質(zhì)、184 份原始種質(zhì)以及150份保留種質(zhì)進行差異比較分析，結(jié)果如圖3 所示，9 個表型值在核心種質(zhì)、原始種質(zhì)和保留種質(zhì)中均沒有顯著性差異。說明構(gòu)建的苦瓜34 份核心種質(zhì)在表型上不僅能夠代表184 份原始種質(zhì)，也對150份保留種質(zhì)具有代表性。

圖3 苦瓜核心種質(zhì)、原始種質(zhì)和保留種質(zhì)的9 個表型性狀分布

進一步分析苦瓜34 份核心種質(zhì)和184 份原始種質(zhì)間的性狀差異百分率，34 份核心種質(zhì)的MD%為0、CR% 為88.30%、VD% 為11.11%、VR% 為115.71%。按照Hu 等（2000）的方法，當MD% ≤20%，CR% ≥ 80%時，可認為核心種質(zhì)能夠代表原始種質(zhì)的遺傳多樣性；并且，MD%越小，VD%、CR%和VR%越大，則核心種質(zhì)越能代表原始種質(zhì)的遺傳多樣性。因此，認為本試驗所構(gòu)建的34 份苦瓜核心種質(zhì)能夠代表184 份原始種質(zhì)的遺傳多樣性和表型多樣性。

基于苦瓜21 對SSR 標記的PCR 電泳譜帶獲得了34 份核心種質(zhì)的分子身份信息（圖4），不同種質(zhì)間帶型完全相同的概率為7.8910，說明每一份核心種質(zhì)幾乎都有唯一的分子身份信息。

圖4 34 份苦瓜核心種質(zhì)的SSR 分子身份信息

3 討論與結(jié)論

植物種質(zhì)資源是進行植物遺傳改良和新品種培育的物質(zhì)基礎，通過構(gòu)建核心種質(zhì)，育種家可以提高種質(zhì)資源的利用效率。例如，Lv 等（2012）從3 342 份黃瓜材料中抽取出115 份核心種質(zhì)資源，隨后，Qi 等（2013）利用這115 份黃瓜核心種質(zhì)進行全基因組遺傳變異分析，揭示了黃瓜的馴化和多樣性。Wang 等（2018）從1 234 份黃瓜材料中抽取出395 份核心種質(zhì)資源用于黃瓜分子標記開發(fā)和許多重要性狀的全基因組關聯(lián)分析（GWAS）。

雖然構(gòu)建核心種質(zhì)的方法較多，但對核心種質(zhì)確立的評價標準基本相似，即多樣性是否能代表原始種質(zhì)。Brown（1989）認為核心種質(zhì)保留原始種質(zhì)的等位基因比例需大于70%。張春雨等（2009）通過對各遺傳多樣性參數(shù)進行檢驗來評價核心種質(zhì)的代表性，如果各遺傳參數(shù)在核心種質(zhì)和原始種質(zhì)之間都沒有顯著性差異，則說明核心種質(zhì)保留了原始種質(zhì)的全部遺傳多樣性。Hu 等（2000）提出在均值差異百分率小于20%，極差符合率大于80%的情況下，并且均值差異百分率越小，方差差異百分率、極差符合率和變異系數(shù)變化率越大，則核心種質(zhì)越能代表原始種質(zhì)的遺傳多樣性。劉子記等（2017）采用遺傳距離法，按照固定30%比例進行抽樣，通過5 個表型性狀從154 份苦瓜材料中抽取出46 份核心種質(zhì)；經(jīng)過表型參數(shù)評價，該46 份苦瓜核心種質(zhì)保持了原始種質(zhì)的表型多樣性。

本試驗中的184 份苦瓜原始種質(zhì)分別收集于13 個國家、WorldVeg 和種子公司，是迄今為止公開報道的最具多樣性的一組苦瓜種質(zhì)資源（Cui et al.，2017，2020）。從基因型和表型數(shù)據(jù)構(gòu)建核心種質(zhì)，一方面是因為采用M 策略抽取出19 份核心種質(zhì)樣本，雖然能夠最大程度地代表原始種質(zhì)的等位基因數(shù)量，但是樣本以來自國外的種質(zhì)資源為主，不能完全代表來自國內(nèi)種質(zhì)資源的表型多樣性。另一方面，通過QGAStation 以表型數(shù)據(jù)進行抽樣彌補了對原始種質(zhì)表型的代表性，同時也增加了國內(nèi)種質(zhì)的核心種質(zhì)數(shù)量，可以更好地利用國內(nèi)種質(zhì)資源。從抽樣比例來看，據(jù)統(tǒng)計大多數(shù)園藝作物構(gòu)建核心種質(zhì)的取樣比例為10%～30%（繆黎明等，2016），本試驗對苦瓜核心種質(zhì)的抽樣比例為18.48%，符合此范圍的抽樣比例。從所構(gòu)建的34份苦瓜核心種質(zhì)資源的地理來源代表性來看，核心種質(zhì)保留了原始種質(zhì)（來自13 個國家）中大多數(shù)國家（10 個國家）的來源，僅有柬埔寨、巴基斯坦和印度尼西亞3 個國家的種質(zhì)資源沒有入選核心種質(zhì)，可能的原因是這3 個國家的原始種質(zhì)樣本數(shù)量較少或缺乏多樣性。

當然，在評價并確立核心種質(zhì)后，對核心種質(zhì)的實用性尚需進一步檢驗。一方面，本試驗構(gòu)建了苦瓜34 份核心種質(zhì)的SSR 分子身份信息，每一份種質(zhì)都具有唯一的分子身份信息；另一方面，還需進一步對核心種質(zhì)的性狀如抗性、品質(zhì)、產(chǎn)量以及配合力等進行鑒定和利用評價。