基于生物信息學(xué)方法探究ENO1基因在宮頸癌中的表達(dá)及其作用機(jī)制

王曉旋，張石云，楊益琴，陳 艷，王 淮，馬雪艷，劉云春

（1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 大理 671000；2.云南省大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，云南 大理 671000；3.云南省大理白族自治州人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，云南 大理 671000）

宮頸癌（cervical cancer）是常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，是僅次于乳腺癌威脅婦女生命健康的第二大殺手[1]。據(jù)報(bào)道，人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）的持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素[2]。盡管隨著HPV 篩查項(xiàng)目和疫苗的普及，宮頸癌的發(fā)生率已顯著降低，但對(duì)于已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的患者來(lái)說(shuō)，其預(yù)后仍較差[3]。因此，尋找更為準(zhǔn)確且穩(wěn)定的生物學(xué)靶點(diǎn)及其預(yù)后的評(píng)價(jià)指標(biāo)具有重要的意義。α-烯醇化酶（ENO1）屬三種烯醇酶之一，廣泛存在于各種組織細(xì)胞中[4，5]，是糖酵解過(guò)程的關(guān)鍵酶之一。ENO1 不僅在糖代謝過(guò)程中發(fā)揮作用，其功能還可因其定位不同而改變，其表達(dá)水平可因病理生理、代謝途徑、生長(zhǎng)狀態(tài)的不同而有所差異[6，7]。此外，研究表明[8，9]，ENO1 除可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)葡萄糖和乳酸的攝取外，還可直接參與腫瘤細(xì)胞的分裂、增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡等過(guò)程。目前，ENO1 基因與宮頸癌之間的關(guān)系尚未明確。本文將利用生物信息學(xué)方法，系統(tǒng)分析ENO1 基因在宮頸癌中的表達(dá)及其功能特性，旨在尋找宮頸癌的預(yù)后指標(biāo)和潛在的治療靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 ENO1 基因在宮頸癌中的表達(dá)分析 GEPIA（http://gepia.cancer－pku.cn/）數(shù)據(jù)庫(kù)[10]可對(duì)基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析，此數(shù)據(jù)庫(kù)是由北京大學(xué)研究人員開(kāi)發(fā)，具備基于TCGA 和GTEx 數(shù)據(jù)集提供快速且可自定義的在線分析功能。本研究借助該數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)分析ENO1 基因在宮頸癌與癌旁組織的表達(dá)情況，共得到兩組隊(duì)列：一組數(shù)據(jù)來(lái)源于TCGA 和GTEx 數(shù)據(jù)庫(kù)，另一組數(shù)據(jù)來(lái)源于TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)。將界值設(shè)定為：|Log2FC|＞1.5，P＜0.05。同時(shí)利用該數(shù)據(jù)庫(kù)中的生存分析評(píng)價(jià)ENO1 基因表達(dá)對(duì)宮頸癌患者生存預(yù)后的影響，ENO1 基因按其表達(dá)中位數(shù)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。

1.2 ENO1 蛋白表達(dá)分析 HPA（http://www.proteinatlas.org/）即人蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，該數(shù)據(jù)庫(kù)涵蓋了蛋白組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)以及生物學(xué)數(shù)據(jù)，可迅速獲取某種蛋白在細(xì)胞或組織（癌和癌旁組織）的表達(dá)情況。本研究借助該數(shù)據(jù)庫(kù)檢索ENO1 基因表達(dá)情況，在搜索欄中輸入ENO1，可得到該基因在組織、細(xì)胞和腫瘤中的表達(dá)情況，分別選取宮頸癌和宮頸組織提取出該基因在宮頸鱗癌組織和癌旁組織的免疫組化（immunohistochemistry，IHC）數(shù)據(jù)。

1.3 預(yù)后分析 TCGA（https://cancerge-nome.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)[11]幾乎包含了人類(lèi)所有癌癥的基因組表達(dá)圖譜，可提供所需基因組序列，并進(jìn)行臨床信息下載。本研究基于該數(shù)據(jù)庫(kù)下載ENO1 基因在宮頸癌和癌旁組織樣本（共309 例）的表達(dá)譜和宮頸癌患者臨床信息（共307 例），設(shè)置過(guò)濾篩選條件：“case”“cervix uteri”“TCGA”“transcriptome profiling”“Gene Expression Quantification”及“HTSeq-FPKM”。借助perl將下載文件中探針名字轉(zhuǎn)換為基因名字，并用R 軟件包分析影響患者的預(yù)后因素。

1.4 基因富集分析 利用基因富集分析（GSEA）ENO1 基因表達(dá)水平對(duì)生物學(xué)通路基因集富集的影響。下載準(zhǔn)備的.cls、.gct 文件并成功讀取后，按默認(rèn)的加權(quán)富集統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行富集分析，并將隨機(jī)組合次數(shù)設(shè)置為1000 次，選取好結(jié)果保存文件途徑，將P＜0.05 且FDR＜0.25 界定為顯著富集基因集。

1.5 基因共表達(dá)分析 Linked Omics（http://www.linkedomics.org/login.php）數(shù)據(jù)庫(kù)功能強(qiáng)大，可在線分析來(lái)自TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)的腫瘤基因譜、甲基化、拷貝數(shù)的改變、基因突變及臨床信息等。本研究采用Spearman 相關(guān)性分析篩選出與ENO1 基因共表達(dá)的基因，并將正負(fù)相關(guān)排名前50 的基因以熱圖形式展示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)下載采用R（v3.5.3）軟件處理。兩組單變量資料若符合正態(tài)分布，則采用t檢驗(yàn)，否則采用秩和檢驗(yàn)；采用Log-rank 檢驗(yàn)計(jì)算ENO1 基因表達(dá)與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系；采用Spearman 相關(guān)性分析篩選ENO1 基因的共表達(dá)基因，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ENO1 基因在宮頸癌組織和癌旁組織的表達(dá)比較 ENO1 基因在宮頸癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 ENO1 基因在宮頸癌與癌旁組織的表達(dá)比較

2.2 ENO1 蛋白在宮頸鱗癌組織和癌旁組織的表達(dá)比較 ENO1 蛋白在宮頸鱗癌組織中的染色陽(yáng)性率＞75%，染色強(qiáng)度高，而在癌旁組織染色陽(yáng)性率為25%～50%，染色強(qiáng)度較弱。免疫組化染色結(jié)果顯示，相較于正常組織，ENO1 蛋白在宮頸鱗癌組織中表達(dá)量高于癌旁組織，且主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，見(jiàn)圖2。

圖2 ENO1 蛋白在宮頸鱗癌組織和癌旁組織的表達(dá)比較

2.3 ENO1 基因與宮頸癌患者的預(yù)后分析 ENO1 基因高表達(dá)的患者生存預(yù)后差，其與患者的總生存期（OS）呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），見(jiàn)圖3。將TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)下載的不完整的臨床信息剔除后剩余307 例，納入Cox 風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析，單因素Cox 回歸分析顯示，ENO1 基因表達(dá)水平與宮頸癌患者OS 有關(guān)（P＜0.05）；多因素Cox 回歸分析顯示，ENO1 基因的表達(dá)可作為評(píng)估宮頸癌患者生存預(yù)后的獨(dú)立影響因素（P＜0.05），見(jiàn)表1。

圖3 ENO1 基因與宮頸癌患者OS 的關(guān)系

表1 ENO1 基因與宮頸癌患者的預(yù)后分析

2.4 ENO1 基因富集分析 ENO1 基因高表達(dá)主要富集于煙酸和煙酰胺代謝、脂肪酸代謝、過(guò)氧化物酶體等一系列與代謝相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程，ENO1 基因可通過(guò)作用于物質(zhì)代謝途徑影響細(xì)胞代謝水平進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，見(jiàn)表2，圖4。

圖4 ENO1 高表達(dá)的宮頸癌組織樣本的基因集富集分析

表2 ENO1 基因富集的通路集

2.5 宮頸癌組織中的ENO1 共表達(dá)基因分析 借助Linked Omics 數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選出與該基因具有正負(fù)相關(guān)性的50 個(gè)共表達(dá)基因，并以可視化熱圖形式展示：ALDQA、NOC2L、TUBA1C 等基因與ENO1 基因表達(dá)呈正相關(guān)，且自上而下依次排列，而RNF103、MCF2L、CAPN5 等基因與該基因呈負(fù)相關(guān)，并自上而下依次排列，見(jiàn)圖5。

圖5 宮頸癌組織中與ENO1 基因正負(fù)相關(guān)的共表達(dá)基因

3 討論

生物信息技術(shù)在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，尤其是利用高通量、低成本的測(cè)序技術(shù)為醫(yī)學(xué)研究帶來(lái)了便利，不斷有基于大數(shù)據(jù)的新計(jì)算方法和軟件工具的出現(xiàn)，其可以準(zhǔn)確快速的處理大型復(fù)雜數(shù)據(jù)集，使醫(yī)學(xué)研究得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展[12，13]。目前，越來(lái)越多的研究人員參與癌癥機(jī)制和治療靶點(diǎn)的研究，借助各種在線式、交互式數(shù)據(jù)庫(kù)，分析癌癥的潛在基因靶點(diǎn)，并以此為契機(jī)，在細(xì)胞水平和臨床中進(jìn)行驗(yàn)證[14，15]。

隨著醫(yī)療水平的發(fā)展，宮頸癌的治療方法逐漸多樣化，且早期宮頸癌患者的預(yù)后已得到明顯改善，但晚期或復(fù)發(fā)的宮頸癌患者的預(yù)后仍較差。研究顯示[16，17]，宮頸癌的發(fā)病率呈逐年增長(zhǎng)且年輕化的趨勢(shì)。一直以來(lái)，我國(guó)將細(xì)胞學(xué)篩查作為宮頸癌的主要篩查項(xiàng)目，雖可起到一定的早篩作用，但其敏感性仍較低，因此有必要進(jìn)一步探索宮頸癌的發(fā)病機(jī)制，探索更具特異性的診斷標(biāo)志物。

ENO1 基因作為代謝途徑，特別是糖代謝途徑的一種催化酶，其功能可因在細(xì)胞定位的不同、細(xì)胞內(nèi)外的含量不同而發(fā)揮不同的作用。當(dāng)位于細(xì)胞內(nèi)時(shí)，ENO1 基因可作為糖酵解過(guò)程的關(guān)鍵酶參與糖代謝過(guò)程，也可參與腫瘤的糖代謝過(guò)程影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展；當(dāng)位于細(xì)胞膜時(shí)，ENO1 基因可作為纖溶酶原受體，通過(guò)調(diào)節(jié)纖溶酶的活性加速細(xì)胞外機(jī)制的降解過(guò)程，參與癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與侵襲。ENO1 基因可參與多種惡性腫瘤的病理生理過(guò)程。有研究報(bào)道[18]，ENO1 基因可通過(guò)形成ENO1-MAPK-AKT 信號(hào)通路誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞增殖分化；ENO1 基因高表達(dá)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞的增殖與遷移[19-21]，還可作為纖溶酶原受體發(fā)揮作用，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的侵襲[22]。

本研究顯示，ENO1 基因在宮頸癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織；生存分析表明，ENO1 基因高表達(dá)與宮頸癌患者的OS 呈負(fù)相關(guān)，提示ENO1 基因高表達(dá)與宮頸癌患者預(yù)后不良有關(guān)。Cox 分析表明，ENO1 基因可作為評(píng)估患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。這些均提示ENO1 基因在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可作為促癌因子發(fā)揮作用，同時(shí)亦可作為宮頸癌的預(yù)后指標(biāo)。本研究還顯示，ENO1 基因功能主要富集于煙酸和煙酰胺代謝、脂肪酸代謝、過(guò)氧化物酶體等一系列與代謝相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程，推測(cè)該基因可能通過(guò)調(diào)控以上途徑來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，從而促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)與ENO1 具有正負(fù)相關(guān)的共表達(dá)基因，這些數(shù)據(jù)可為后續(xù)研究奠定理論基礎(chǔ)。

綜上所述，ENO1 基因在宮頸癌中呈高表達(dá)，與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后存在一定關(guān)系，有望成為宮頸癌預(yù)后評(píng)估和治療的潛在靶點(diǎn)。