自噬對(duì)激素性股骨頭壞死大鼠模型血脂及血液流變學(xué)的影響

劉樹義，蘭 凱，張旭東，李 瑜

（1.西安醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院外科學(xué)教研室，陜西 西安 710021；2.西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，陜西 西安 710038）

激素性股骨頭壞死（steroid-induced avascular necrosis of the femoral head，SANFH）是非創(chuàng)傷性股骨頭壞死中最常見的類型，約占51%，其發(fā)病與激素過量或長期使用密切相關(guān)[1]。近年來，隨著激素的廣泛應(yīng)用，其發(fā)病率呈逐年增加趨勢(shì)，且以男性青壯年居多。研究顯示[2]，口服潑尼松的劑量每日提高10 mg，股骨頭壞死的發(fā)病率就會(huì)提高4.6 倍。由于SANFH 通常累及雙側(cè)髖關(guān)節(jié)，致殘率較高，給患者家庭和國家造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失和社會(huì)負(fù)擔(dān)，已成為威脅社會(huì)及人類健康的難治性疾病。目前對(duì)SANFH 的治療僅局限于手術(shù)治療，近70%的患者通過實(shí)施人工髖關(guān)節(jié)置換術(shù)能有效改善患者的生活質(zhì)量，總體療效顯著[3]；但由于人工關(guān)節(jié)材料有一定的使用壽命，且關(guān)節(jié)置換術(shù)后存在假體周圍骨折、感染、假體松動(dòng)等并發(fā)癥，使手術(shù)治療存在著局限性[4]。因此，研究SANFH 的發(fā)病機(jī)制及尋找更加有效的非手術(shù)治療方法，是目前亟待解決的臨床問題。研究表明[5]，激素是誘導(dǎo)自噬的重要因素，自噬活性增強(qiáng)的結(jié)果是細(xì)胞發(fā)生過度死亡。SANFH 作為大劑量激素使用的并發(fā)癥之一，很可能與自噬存在密切關(guān)系。此外，部分研究結(jié)果顯示，正常情況下，機(jī)體可通過“噬脂”現(xiàn)象來調(diào)節(jié)肝臟和脂肪組織中甘油三酯的代謝，即自噬性調(diào)節(jié)途徑[6]，但在病理狀態(tài)下，這種自噬性調(diào)節(jié)的方向是不明確的，甚至?xí)斐芍|(zhì)代謝紊亂[7，8]。韓曉蕊等[9]利用多模態(tài)MRI 技術(shù)分析SANFH 患者股骨頭時(shí)發(fā)現(xiàn)，在壞死區(qū)脂肪含量明顯高于非壞死區(qū)?；诖?，推測(cè)SANFH 的發(fā)病與自噬、脂質(zhì)代謝紊亂有密切聯(lián)系，而導(dǎo)致股骨頭出現(xiàn)壞死的途徑很可能是：①自噬活性增強(qiáng)后，骨細(xì)胞出現(xiàn)過度自噬性死亡；②激素誘導(dǎo)自噬活性增強(qiáng)后，機(jī)體脂質(zhì)代謝紊亂，造成股骨頭內(nèi)脂肪堆積、高壓，繼而骨細(xì)胞發(fā)生缺血壞死。為證實(shí)上述假設(shè)，本研究通過構(gòu)建SANFH 大鼠模型，并誘發(fā)體內(nèi)細(xì)胞自噬活性，進(jìn)一步分析自噬對(duì)SANFH 大鼠脂質(zhì)代謝的作用，為尋找更加有效的治療途徑提供思路與理論依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料 本研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD 大鼠24只（清潔級(jí)）購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物合格證：SCXK（陜）2018-001]，雌、雄各半，平均體重為（286.12±12.96）g。脂多糖（貨號(hào)：L8880）、3-甲基腺嘌呤（3-MA，貨號(hào)：IM0190）、雷帕霉素（Rapamycin，貨號(hào)：R8140）購自北京索萊寶科技有限公司；注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉（40 mg/瓶）購自輝瑞制藥有限公司；RIPA 裂解緩沖液（碧云天，P0013C）。

1.2 方法

1.2.1 分組及動(dòng)物模型制備 大鼠進(jìn)入動(dòng)物中心后，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4 組：對(duì)照組、模型組、自噬阻斷組及自噬激動(dòng)組，每組6 只，并采用大鼠耳標(biāo)進(jìn)行標(biāo)記。將脂多糖溶于二甲基亞砜（DMSO）溶液中，濃度為0.01 μg/μl；甲強(qiáng)龍溶于生理鹽水，濃度為40 mg/ml，分別將3-MA、雷帕霉素溶于DMSO 溶液，濃度均為1 mg/kg。模型組、自噬阻斷組及自噬激動(dòng)組大鼠稱重后，按20 μg/kg 劑量先經(jīng)腹腔注射脂多糖2 次，每次間隔24 h，對(duì)照組經(jīng)腹腔給予20 μg/kg 生理鹽水。脂多糖注射結(jié)束后，間隔24 h，按40 mg/kg 劑量，經(jīng)兩側(cè)臀肌交替給予模型組、自噬阻斷組及自噬激動(dòng)組大鼠甲強(qiáng)龍注射，共3 次，每次間隔24 h；自噬阻斷組、自噬激動(dòng)組每次肌肉注射甲強(qiáng)龍前30 min，分別經(jīng)腹腔注射3-MA（2.5 mg/kg）、雷帕霉素（1 mg/kg），對(duì)照組大鼠經(jīng)臀肌、腹腔注射1 ml/kg 生理鹽水。藥物注射完成后繼續(xù)飼養(yǎng)，并將大鼠將置于跑步機(jī)中，以1 km/h速度勻速跑動(dòng)，30 min/次，2 次/周，跑動(dòng)后正?；\中飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。8 周后，經(jīng)核磁共振（MRI）檢查確認(rèn)大鼠模型復(fù)制成功。模型制作結(jié)束后，采用10%水合氯醛進(jìn)行腹腔麻醉，將大鼠固定于手術(shù)臺(tái)上，常規(guī)消毒后用剪刀沿腹部中線打開腹腔，腹主動(dòng)脈暴露清晰后保持入針角度約30°刺入采血針，連接真空采血管采集8～10 ml 血液，于4 ℃靜置2 h后以3000 r/min 離心10 min，分離血清，-20 ℃保存。采血結(jié)束后，剪開雙側(cè)髖關(guān)節(jié)囊，剔除關(guān)節(jié)周圍肌肉組織，充分暴露股骨頭后，用刀片從冠狀面劈開兩半，其中一半置于10%中性甲醛溶液進(jìn)行固定，另一半置于-80 ℃保存。

1.2.2 自噬活性評(píng)價(jià)方法 將上述股骨頭組織稱重后，加入液氮進(jìn)行研磨，將骨質(zhì)碎屑轉(zhuǎn)移至1.5 ml 離心管中，按每20 mg 組織加入250 ml RIPA 裂解緩沖液，提取組織蛋白。BCA 法蛋白定量后采用Western blot 檢測(cè)股骨頭內(nèi)LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)水平。

1.2.3 血液流變學(xué)及血脂測(cè)定 經(jīng)腹主動(dòng)脈采血4 ml于抗凝管中，并在4 h 內(nèi)采用全自動(dòng)血液流變儀測(cè)定全血黏度、血漿黏度、紅細(xì)胞壓積及紅細(xì)胞聚集指數(shù)等。采2 ml 血于促凝管中，離心制備血清，采用自動(dòng)生化儀三聯(lián)酶法檢測(cè)血清總膽固醇（TCH）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher 確切概率法，計(jì)量資料采用（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析。當(dāng)P＜0.05時(shí)，認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 股骨頭壞死情況分析 4 組SD 大鼠中，除對(duì)照組無股骨頭無壞死外，模型組、自噬阻斷組及自噬激動(dòng)組股骨頭壞死率分別為率分別為83.33%（5/6）、16.67%（1/6）、100.00%（6/6），組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=17.110，P＜0.05）。

2.2 LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)情況 4 組大鼠股骨頭組織中，LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白均有不同程度表達(dá)，其中自噬阻斷組低于對(duì)照組及模型組，自噬激動(dòng)組LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)高于對(duì)照組及模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1、表1。

表1 四組SD 大鼠股骨頭組織中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（）

表1 四組SD 大鼠股骨頭組織中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（）

注：*與對(duì)照組比較，P＜0.05；#與模型組比較，P＜0.05；▲與自噬阻斷組比較，P＜0.05；▼與模型組比較，P＜0.05

圖1 4 組SD 大鼠股骨頭組織Western blot 檢測(cè)

2.3 各組血脂比較 應(yīng)用激素后，模型組、自噬阻斷組及自噬激動(dòng)組TG、TCH、HDL 較對(duì)照組均有不同程度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而各組LDL比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 各組大鼠血脂情況比較（，mmol/L）

表2 各組大鼠血脂情況比較（，mmol/L）

注：*與對(duì)照組比較，P＜0.05；#與模型組比較，P＜0.05；▲與自噬阻斷組比較，P＜0.05；▼與模型組比較，P＜0.05

2.4 各組血液流變學(xué)指標(biāo)比較 模型組、自噬阻斷組及噬激動(dòng)組全血粘度、血漿粘度、紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞聚集指數(shù)均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=23.462，P＜0.05），見表3。

表3 四組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)比較（）

表3 四組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)比較（）

注：*與對(duì)照對(duì)照組比較，P＜0.05；#與模型組比較，P＜0.05；▲與自噬阻斷組比較，P＜0.05；▼與模型組比較，P＜0.05

3 討論

激素類藥物已廣泛應(yīng)用于自身免疫性疾病、重癥感染、SARS 等疾病的治療，但隨著激素使用劑量的增加和時(shí)間的延長，易造成多種并發(fā)癥的出現(xiàn)，SANFH 是其中致殘率較高的一種。目前對(duì)于SANFH 的發(fā)病機(jī)制尚不明確。但隨著研究的深入，關(guān)于該病的發(fā)病機(jī)制形成了多種理論，包括血管內(nèi)凝血[10]、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化[11]、脂質(zhì)代謝紊亂[12]、骨細(xì)胞凋亡[13]、骨質(zhì)疏松[14]等理論。近年來越來越多的學(xué)者認(rèn)為，細(xì)胞的死亡在一定程度上受到了基因的調(diào)控，即程序性細(xì)胞死亡，包括凋亡和自噬兩種形式。在生理?xiàng)l件下，自噬可通過加快細(xì)胞代謝循環(huán)、協(xié)助細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境達(dá)成促進(jìn)細(xì)胞存活的效果，但當(dāng)機(jī)體細(xì)胞受到多種體內(nèi)、外因素（如激素、缺氧、饑餓等）的作用時(shí)，其活性增強(qiáng)后可過度吞噬細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[15]。此外，自噬也是機(jī)體自身脂肪代謝和干細(xì)胞成脂分化的重要調(diào)節(jié)途徑，尤其是在肝細(xì)胞和脂肪細(xì)胞[16]。石少輝等[17]通過對(duì)63 例SANFH 患者的股骨頭進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，與創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者相比，SANFH 股骨頭內(nèi)脂肪面積、脂肪細(xì)胞密度、脂肪細(xì)胞直徑均增加，而骨髓內(nèi)造血面積明顯減少，電鏡結(jié)果提示骨髓內(nèi)充滿大小不等的脂滴。韓曉蕊等[18]應(yīng)用MRIIDEALIQ 和IVIM-DWI 序列檢查30 例SANFH 患者時(shí)發(fā)現(xiàn)，股骨頭內(nèi)脂肪分?jǐn)?shù)和灌注分?jǐn)?shù)均明顯高于正常人。Motomura G 等[19]對(duì)4 例有早期股骨頭壞死的尸體研究發(fā)現(xiàn)，早期激素性骨壞死患者脂肪細(xì)胞體積增大，而梁大偉等[20]對(duì)478 例股骨頭壞死患者進(jìn)行病因調(diào)查分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，SANFH 患者血脂水平明顯高于正常。由此可見，SANFH 的發(fā)病可能與脂質(zhì)代謝紊亂有密切關(guān)系。然而，在SANFH 發(fā)病過程中，激素誘導(dǎo)自噬活性的增強(qiáng)是否對(duì)患者體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂發(fā)揮了作用，仍有待進(jìn)一步研究。

本研究通過構(gòu)建SANFH 大鼠模型，并使用自噬調(diào)節(jié)劑進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示，大劑量使用甲強(qiáng)龍后，大鼠出現(xiàn)明顯脂質(zhì)代謝紊亂的現(xiàn)象，血液中TG、THC 及HDL 水平明顯升高；當(dāng)同時(shí)給予大鼠甲強(qiáng)龍和自噬阻斷劑3-MA 時(shí)，LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)明顯下降，脂質(zhì)代謝紊亂有所緩解，血液中TG、THC 及HDL 水平較模型組大鼠呈大幅度下降趨勢(shì)，但仍高于對(duì)照組；當(dāng)同時(shí)給予甲強(qiáng)龍和自噬激動(dòng)劑雷帕霉素時(shí)，LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)明顯升高，脂質(zhì)代謝紊亂也更加嚴(yán)重，血液中TG、THC 及HDL 水平大幅升高，且明顯高于模型組和自噬阻斷劑組（P＜0.05），這些結(jié)果均提示在激素的誘導(dǎo)下，自噬對(duì)SANFH 大鼠血脂有顯著的調(diào)節(jié)作用，且自噬活性越高，血脂水平越高。此外，當(dāng)對(duì)4 組大鼠血液進(jìn)行流變學(xué)檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用甲強(qiáng)龍后，大鼠血液全血粘度、血漿粘度、紅細(xì)胞壓積及紅細(xì)胞聚集指數(shù)均出現(xiàn)明顯改變，且高于正常水平。當(dāng)同時(shí)應(yīng)用自噬阻斷劑3-MA 時(shí)，上述血液流變學(xué)指標(biāo)均明顯降低，但仍高于正常；當(dāng)同時(shí)應(yīng)用自噬激動(dòng)劑雷帕霉素時(shí)，上述血液流變學(xué)指標(biāo)顯著升高（P＜0.05），這提示激素誘導(dǎo)下，自噬對(duì)血液流變學(xué)也具有調(diào)節(jié)作用，且自噬活性越強(qiáng)，血液粘度越大，高粘滯血癥也嚴(yán)重。在藥物干預(yù)結(jié)束后，所有大鼠經(jīng)MRI 檢查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組、模型組、自噬阻斷劑組及自噬激動(dòng)劑組大鼠股骨頭壞死率分別為0、83.33%、16.67%及100.00%，這與各組大鼠脂代謝紊亂嚴(yán)重程度及血液流變學(xué)改變情況具有高度一致性。導(dǎo)致這種現(xiàn)象的主要原因在于①激素誘導(dǎo)的自噬活性增強(qiáng)，能夠使體內(nèi)血脂水平升高，進(jìn)而使骨細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性、骨細(xì)胞核膜溶解；②激素誘導(dǎo)的自噬，同時(shí)也能使血液流變學(xué)發(fā)生顯著改變，血液粘滯度增加，股骨頭血液灌注量不足。微循環(huán)中血液通常是按照泊肅葉定律在流動(dòng)，即毛細(xì)管中的流量與黏度成反比，當(dāng)血液黏度升高時(shí)微循環(huán)灌注量將下降。此外，激素類藥物能改變紅細(xì)胞膜兩側(cè)的電化學(xué)梯度，使紅細(xì)胞變形能力下降，紅細(xì)胞之間的黏附力增加，最終會(huì)引起紅細(xì)胞聚集效應(yīng)[21]，而這種效應(yīng)很可能也是自噬活性增強(qiáng)后調(diào)節(jié)血液流變學(xué)的結(jié)果。目前，許多研究表明[22，23]，SANFH 的發(fā)病與脂質(zhì)代謝紊亂、高粘滯血癥密切相關(guān)，通過調(diào)節(jié)血脂和改善血液動(dòng)力學(xué)情況，能夠在一定程度上預(yù)防和降低本病的發(fā)生率[24]，而且本研究也發(fā)現(xiàn)抑制自噬后能夠大大降低股骨頭壞死的發(fā)生率。

綜上所述，在SANFH 大鼠中存在脂質(zhì)代謝紊亂和高粘滯血癥的現(xiàn)象，而這些現(xiàn)象的發(fā)生與體內(nèi)自噬活性增強(qiáng)有密切關(guān)系。激素誘導(dǎo)的自噬能夠使血液中血脂水平顯著高于正常，血液流變學(xué)指標(biāo)同樣有明顯改變，而自噬被抑制后，能大幅改善血脂和血液流變學(xué)情況，股骨頭壞死率呈明顯下降。這充分說明自噬對(duì)SANFH 血脂、血液流變學(xué)的調(diào)節(jié)有重要意義，在未來有望成為治療SANFH 的重要途徑之一。此外，本研究的不足之處在于未開展機(jī)制方面的研究，尚未找到干預(yù)的精準(zhǔn)靶點(diǎn)，在今后的研究中將著力于此。