基于響應面法優(yōu)化無糖益生菌牛奶片配方

任敏，李志國，閆清泉，邊燕飛，司闊林，宗學醒

內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團）股份有限公司（呼和浩特 011500）

牛奶片作為一種營養(yǎng)價值高、方便攜帶的休閑乳制品，以便捷的方式幫助補充人體所需的蛋白質(zhì)、鈣等營養(yǎng)素，因此受到廣大消費者特別是兒童的喜愛[1]。目前市場上大多的奶片產(chǎn)品添加糖含量在7%～ 10%，有研究表明，蔗糖可能比其他糖類更容易引起齲齒，這是因為大多數(shù)口腔細菌僅通過蔗糖就能合成可溶性和不可溶性胞外聚合物，從而增加菌斑的體積，促進細菌附著，進而導致齲齒[2]。此外，高糖食品還是引起現(xiàn)代人群罹患2型糖尿病、肥胖癥、心血管疾病等的重要原因之一[3-4]。

低糖或無糖食品常使用赤蘚糖醇、木糖醇替代白砂糖，其中赤蘚糖醇具有高熱穩(wěn)定性、甜味協(xié)調(diào)、零熱值、無致齲齒性、不會引起血糖升高等優(yōu)勢，甜度相當于蔗糖的70%，與其他糖醇相比，赤蘚糖醇耐受性最高[5-7]。李家磊等[8]以赤蘚糖醇和木糖醇的混合甜味劑研制薏苡仁多糖奶片。Shu等[9]基于響應面分析，確定木糖醇、赤蘚糖醇、甘露糖醇等在益生菌羊奶片中的最優(yōu)配比。值得注意的是，赤蘚糖醇溶解熱較高，添加量過高會帶來清涼口感，不同于蔗糖帶來的甜熟感[10]。羅漢果甜苷是一種天然甜味劑，甜度為蔗糖的200～300倍，不引起齲齒和血糖變化[11-12]。相較于甜菊糖苷，羅漢果甜苷的甜味釋放緩慢，保留時間長、苦味弱[13-14]，被視為新一代功能性天然甜味劑。孫常文等[6]研究表明赤蘚糖醇與高倍甜味劑復合使用口感近似蔗糖，且能夠改善甜味劑后甜濃烈甚至苦味。而使用赤蘚糖醇和羅漢果甜苷復配制備無糖奶片的研究還鮮有報道。

隨著生活質(zhì)量的不斷提高，消費者對于休閑乳制品的需要逐漸向具有合理營養(yǎng)和保健功能的方向發(fā)展。近些年對于益生菌奶片產(chǎn)品的研究也日益增多，益生菌奶片既具有牛奶的營養(yǎng)價值，又具有益生菌獨特的生理功能，而與液體益生菌口服液相比，益生菌奶片具有方便攜帶、貯藏和運輸?shù)葍?yōu)勢[15-18]。

試驗通過對全脂乳粉、赤蘚糖醇和羅漢果甜苷3個因素的不同添加量進行研究，確定這些因素的最佳添加量，并進行響應面試驗，得到無糖益生菌牛奶片的最佳配方，驗證該配方下牛奶片的感官評分及貯藏期間活菌數(shù)的變化情況，以期為無糖益生菌牛奶片的工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

全脂乳粉（新西蘭恒天然）；低聚果糖，赤蘚糖醇（保齡寶生物股份有限公司）；羅漢果甜苷V55（食品級，華誠生物）；雙歧桿菌BB12（科漢森）；脫鹽乳清粉，硬脂酸鎂（市售）。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（PG6002-S，梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；篩網(wǎng)（0.150 mm，即100目，浙江上虞市道墟張興紗篩廠）；壓片機（90L-4，臺州市路橋區(qū)恒列電機有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 無糖益生菌牛奶片制備的工藝流程

原料粉碎過篩→稱量、配料→混合均勻→壓片

1.3.2 單因素試驗方法

在預試驗基礎(chǔ)上（全脂乳粉65%，脫鹽乳清粉22.69%，低聚果糖5%，赤蘚糖醇6%，羅漢果甜苷0.01%，雙歧桿菌1%，硬脂酸鎂0.3%），將全脂乳粉、赤蘚糖醇和羅漢果甜苷3個因素中的2個因素固定，設(shè)置另一個因素的變化，進行單因素試驗，按照感官評定方法對樣品進行評價。

1.3.2.1 全脂乳粉添加量的確定

全脂乳粉為制作奶片的主要原料，是奶香味的主要來源，按照物料質(zhì)量的50%，55%，60%，65%和70%進行添加。

1.3.2.2 赤蘚糖醇添加量的確定

赤蘚糖醇作為奶片中的代糖成分，是奶片甜感的主要來源，按照物料的4%，5%，6%，7%和8%進行添加。

1.3.2.3 羅漢果甜苷添加量的確定

羅漢果甜苷作為天然高倍甜味劑，對產(chǎn)品的甜味起到補充作用，影響奶片的甜味協(xié)調(diào)性，按照物料的0.005%，0.01%，0.015%，0.020%和0.025%進行添加。

1.3.3 感官評價的標準

挑選10名具有感官品評課程學習經(jīng)歷的研發(fā)工程師組成感官評定小組（五男五女），對奶片進行品評，按照表1標準進行打分[19-20]。

表1 感官評分表

1.3.4 Box-Behnken試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理[21]，以全脂乳粉、赤蘚糖醇和羅漢果甜苷為因子，所制備的無糖益生菌牛奶片感官評分為指標，設(shè)計三因素三水平響應面分析試驗，數(shù)據(jù)用Design- Expert 13.0軟件分析確定最優(yōu)配方組合，因素與水平見表2。

表2 因素水平編碼表 單位：%

1.4 驗證試驗

根據(jù)優(yōu)化后的試驗結(jié)果，將選中的3個因素的最佳添加量再次進行試驗，重復驗證3次，驗證試驗結(jié)果是否準確。

1.5 貯藏期間益生菌活菌數(shù)測定

對優(yōu)化配方后的無糖益生菌牛奶片產(chǎn)品進行雙歧桿菌的活菌數(shù)監(jiān)測。貯藏條件為常溫、避光、陰涼放置6個月，每隔1月檢測1次，檢測方法參考GB 4789.34—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 雙歧桿菌檢驗》。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Design-Expert V 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果用“平均值±標準差”表示，采用Graph pad prism 6作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

圖1為單因素試驗結(jié)果。如圖1（A）所示，全脂乳粉添加量在50%～60%，奶片的感官評分隨著全脂乳粉添加量增加而上升，這是由于全脂乳粉添加量增加，增強奶片的乳香味，從而使感官評分較高；全脂乳粉添加量60%時，感官評分最高，為89.2±0.91分；全脂乳粉添加量超過60%后，奶片感官評分隨著全脂乳粉添加量增加而降低，這可能是由于全脂乳粉添加量過高，導致奶片粘牙，進而導致感官評分較低。因此，全脂乳粉添加量60%為宜。

圖1（B）為赤蘚糖醇添加量與奶片感官評分之間的關(guān)系。隨著赤蘚糖醇添加量增加，奶片感官評分呈現(xiàn)先上升后降低趨勢，赤蘚糖醇添加量5%時，奶片感官評分最高，為85.2±1.42分，赤蘚糖醇添加量低于5%時奶片甜味不足，添加量超過5%后，隨著赤蘚糖醇添加量的增加，清涼口感較為明顯，導致感官評分較低。因此，初步選定赤蘚糖醇添加量為5%。

圖1（C）表明，羅漢果甜苷添加量0.01%時感官評分最高，羅漢果甜苷添加量低于0.01%時甜味不足，高于0.01%時，隨著添加量增加，奶片甜味增強尤其是后甜綿長且濃烈，導致感官評分較低。因此，選擇羅漢果甜苷添加量0.01%為宜。

圖1 單因素試驗結(jié)果

2.2 響應面試驗結(jié)果

響應面法優(yōu)化無糖益生菌牛奶片的試驗結(jié)果見表3。

表3 響應面設(shè)計及結(jié)果

2.2.1 回歸方程的建立和顯著性分析

響應面法優(yōu)化無糖益生菌牛奶片的工藝結(jié)果見表4。對各因素回歸擬合后，獲得感官評分（Y）的三元二次回歸方程：Y=91.24+2.11A-2.52B-2.96C-0.6AB-2.13AC-2.7BC-5.23A2-7.96B2-7.13C2。

對該回歸模型進行方差分析，結(jié)果見表4。試驗建立的回歸模型p值＜0.000 1，達到極顯著水平，其中，失擬項（p=0.071 4＞0.05）不顯著，說明模型擬合程度良好。模型校正系數(shù)R2=0.981 4，模型修正系數(shù)Radj2=0.957 5，說明回歸模型與預測值之間有良好的擬合程度，全脂乳粉、赤蘚糖醇和羅漢果甜苷的添加量與感官評分之間的線性關(guān)系顯著。因此，該模型可用于理論預測。

由表4中的回歸系數(shù)顯著性的檢驗可以表明，A、B、C與二次項A2、B2、C2及交互項BC對產(chǎn)品感官評分有極顯著影響，交互項AC對產(chǎn)品感官評分有顯著影響。由表4中F值的大小可以判斷各因素對無糖益生菌牛奶片感官評分影響的強弱，F(xiàn)值越大，對感官評分影響作用越強[22]，3個因素對感官評分的影響大小為C＞B＞A，即羅漢果甜苷添加量＞赤蘚糖醇添加量＞全脂乳粉添加量。

表4 回歸模型與方差分析

2.2.2 響應曲面分析

通過響應面分析能夠更直觀地反映出兩兩因素的交互作用，通過經(jīng)Design Expert 13.0軟件進行二次多元回歸設(shè)計便可作出各因素間相互交互作用的三維立體響應曲面和等高線圖，如圖2～圖4所示，響應面圖均為頂部凸起、開口朝下的曲面，表明感官評分存在極值，該值為響應面的最高點，而且各個因素的最佳作用點都在試驗設(shè)計的范圍之內(nèi)。

圖4 赤蘚糖醇與羅漢果甜苷添加量的相互作用對奶片感官評分的響應面圖

由圖2等高線分析可知，赤蘚糖醇添加量不變時，沿著全脂乳粉添加量變化的方向看，赤蘚糖醇添加量的等高線較密，說明赤蘚糖醇添加量對奶片感官評分的影響較顯著。整體來看，因素A與B之間相互作用的等高線橢圓弧度較小，3D曲線較平緩，表明全脂乳粉與赤蘚糖醇添加量之間的交互作用不顯著。

圖2 全脂乳粉與赤蘚糖醇添加量相互作用對奶片感官評分的響應面圖

圖3為全脂乳粉添加量（A）與羅漢果甜苷添加量（C）之間的交互作用響應圖。全脂乳粉添加量較低時，隨著羅漢果甜苷添加量升高，感官評分呈現(xiàn)迅速上升然后降低趨勢，變化幅度明顯；全脂乳粉添加量處于中等或較高時，隨著羅漢果甜苷添加量增加，感官評分呈現(xiàn)緩慢上升然后下降趨勢。這是由于羅漢果甜苷添加量過高，會導致奶片甜味太持久導致感官評分降低。研究表明，單一甜味劑在食品中的應用大多存在后味持久等現(xiàn)象，因此需要與其他甜味劑復配來解決這一問題[23-24]。羅漢果甜苷添加量較低時，隨著全脂乳粉添加量的增加，感官評分呈現(xiàn)迅速上升然后緩慢下降趨勢，上升幅度明顯；羅漢果甜苷添加量處于中等或較高水平時，感官評分隨著全脂乳粉添加量的增加而緩慢上升然后下降。全脂乳粉添加量（A）與羅漢果甜苷添加量（C）之間的交互作用較為顯著。

圖3 全脂乳粉與羅漢果甜苷添加量的相互作用對奶片感官評分的響應面圖

赤蘚糖醇與羅漢果甜苷添加量的相互作用如圖4所示。赤蘚糖醇添加量不變，隨著羅漢果甜苷添加量增加，感官評分呈現(xiàn)快速上升然后降低趨勢，升高幅度明顯；同樣，羅漢果甜苷添加量不變，隨著赤蘚糖醇添加量增加，感官評分呈現(xiàn)先快速上升然后下降趨勢，升高幅度明顯。從整體曲線的狀態(tài)來看，3D曲線較陡，等高線橢圓弧度最大，表明赤蘚糖醇添加量（B）與羅漢果甜苷添加量（C）之間的交互作用極顯著。

2.2.3 驗證試驗

通過對響應面數(shù)據(jù)的分析可以得出無糖益生菌牛奶片的最佳配方：全脂乳粉添加量65%、赤蘚糖醇添加量4.86%、羅漢果甜苷添加量0.008%。在此配方下，無糖益生菌牛奶片的感官評分為89.2分。在各因素最佳添加量的條件下進行3次平行試驗，無糖益生菌牛奶片的感官評分為90.2±0.52分，相對誤差為1.12%，與預測值無顯著差異，表明采用響應面法優(yōu)化得到的無糖益生菌牛奶片最佳配方是可靠的。

2.2.4 貯藏期間益生菌活菌數(shù)的變化情況

按照響應面法優(yōu)化后的配方制備無糖益生菌牛奶片，測定貯藏6個月期間牛奶片的雙歧桿菌活菌數(shù)情況，結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明，無糖益生菌牛奶片在貯藏180 d期間，活菌數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢，在前90 d下降速度較快，之后趨于平緩。貯藏180 d后，活菌數(shù)可達2.1×107±0.17 CFU/g，且在整個貯藏期間活菌數(shù)均在107CFU/g以上。馬強[16]對添加益生菌粉直接壓片得到的益生菌奶片中的活菌數(shù)進行監(jiān)測，結(jié)果表明，奶片初始活菌數(shù)可達到108CFU/g，常溫貯藏6個月后的活菌數(shù)能保持在106CFU/g，與試驗結(jié)果相近。國際乳業(yè)聯(lián)合會（IDF）規(guī)定，具有益生功效的食品中至少要有107CFU/g的活菌數(shù)。研究表明，按消費者日常攝入100 g計算，相應的產(chǎn)品中益生菌含量必須大于106mL-1才能發(fā)揮益生功效[25-26]。因此，優(yōu)化后的配方能夠保證無糖益生菌牛奶片發(fā)揮益生功效。

圖5 貯藏期間無糖益生菌牛奶片雙歧桿菌活菌數(shù)的變化

3 結(jié)論

通過單因素試驗及響應面分析建立無糖益生菌牛奶片感官評分與全脂乳粉添加量、赤蘚糖醇添加量和羅漢果甜苷添加量之間的回歸模型，得到無糖益生菌牛奶片的最優(yōu)配方：全脂乳粉添加量65%、赤蘚糖醇的添加量4.86%、羅漢果甜苷添加量0.008%，該配方下奶片的感官評分最高。在該配方下，無糖益生菌牛奶片的感官評分為90.2±0.52分，相對誤差為1.12%，與預測值無顯著差異。赤蘚糖醇與羅漢果甜苷之間的甜味協(xié)同作用能夠較好地替代白砂糖，為無糖奶片的研究提供一種可行性方案。通過對奶片貯藏期間雙歧桿菌活菌數(shù)的監(jiān)測，在貯藏6個月期間，奶片中的雙歧桿菌活菌數(shù)均在107CFU/g以上。試驗結(jié)果表明，優(yōu)化后的無糖益生菌奶片感官品質(zhì)良好，且具備益生功效，可為無糖益生菌牛奶片的工業(yè)化生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支持。