米糠蛋白肽的制備及其生物活性研究進展

肖勇生，包珍，張良，黃安全，王訓斌

1. 江西省食品發(fā)酵研究所（宜春 336000）；2. 宜春市米粉制品工程技術研究中心（宜春 336000）；

近年來，隨著我國經(jīng)濟實力的不斷提升和國內物質生活的極大豐富，人口老齡化、亞健康和慢性疾病成為危害健康的主要因素。健康中國概念開始引導居民形成更好的生活習慣和攝入更健康的食品，植物基食品成為新熱點[1]，一些植物基食品形成較好的市場效益。蛋白質是人類第一營養(yǎng)素，植物蛋白是目前最受關注的植物基組分之一，國內外相關研究表明，以米糠蛋白為原料，經(jīng)蛋白酶酶解或微生物發(fā)酵等方法可制得具有生物活性的蛋白肽，其具有抗氧化（清除自由基等）、抗菌、調節(jié)免疫、降血壓、低致敏等作用。我國是稻谷種植大國，稻谷經(jīng)加工后產(chǎn)生約10%的米糠副產(chǎn)物，是一種量大面廣的可再生資源[2]。米糠中含有豐富的營養(yǎng)物質，全脂米糠一般含有12%～18%蛋白質、16%～20%脂肪、12%左右灰分和14%膳食纖維，具有較高利用價值[3]。米糠作為一種廉價易得、營養(yǎng)豐富的稻米加工副產(chǎn)品，從米糠中尋求新的植物蛋白資源具有重要的現(xiàn)實意義。鑒于此，介紹米糠蛋白肽的制備及其生物活性研究進展，以期為大米加工副產(chǎn)物的綜合利用提供一條切實可行的解決方案。

1 米糠蛋白肽提取方法

肽的提取方法大致分可為理化方法、酶法和生物發(fā)酵法。理化方法工藝最為簡單，但其工藝難以完全控制氨基酸缺損、水解程度及產(chǎn)物肽的氨基酸序列等問題，存在制備的米糠蛋白肽提取率低且易變性等缺點[4]。相對而言，酶水解法和微生物發(fā)酵法的工藝條件較為溫和，且能有效避免有害化學物質的帶入，制得蛋白肽營養(yǎng)價值高，但相對于理化方法來說工藝成本較高[5]。此外，利用超聲波輔助等輔助方法也能夠提升蛋白肽的提取效率[6]。

1.1 理化方法

1.1.1 物理法

物理法是指完全通過設備進行物理工藝處理的一種方法，如將全脂或脫脂米糠通過膠體磨均質破碎米糠的細胞結構，使米糠蛋白肽溶出后通過膜過濾等方式提取米糠蛋白肽[7]。據(jù)報道，經(jīng)膠體磨研磨，全脂米糠漿料上清液中蛋白質提取率可從20%增加到30%左右，進一步均質增加到40%左右，但蛋白肽有效提取較低，實際操作時可以考慮將物理法與其他方法聯(lián)合使用。

1.1.2 化學法

化學法又叫酸堿水解法，是提取米糠蛋白最常采用的方法，通過調節(jié)酸堿度使米糠緊密結構變得疏松，并對蛋白質分子次級鍵特別是氫鍵進行破壞，使蛋白質分子表面具有相同電荷，促進結合物與蛋白質分離，提高蛋白質分子溶解率。酸堿水解法提取米糠蛋白雖然簡單易行，但在堿液濃度過高的情況下，不僅使蛋白提取物的顏色深暗，影響產(chǎn)品風味和色澤，而且還可能產(chǎn)生不利反應，改變蛋白質的營養(yǎng)特性[8]。有報道稱，在堿性條件下蛋白質的半胱氨酸和絲氨酸殘基會轉變成脫水的丙氨酸，與賴氨酸的ε-氨基結合形成賴氨酰胺丙氨酸。另外，高堿條件下還會產(chǎn)生諸如蛋白質變性和水解，加速美拉德反應，產(chǎn)生黑褐色物質，提取物中非蛋白質含量增加，分離效果降低等不利現(xiàn)象。

1.2 酶水解法

酶法提取米糠蛋白的反應條件溫和，蛋白質提取率較高，且能更多地保留蛋白質營養(yǎng)價值，同時也避免傳統(tǒng)理化方法提取米糠蛋白所帶來的負面效應。因此，近年來國內外關于酶法提取米糠蛋白的報道較多[9]。用于提取米糠蛋白的酶主要有蛋白酶、糖酶和植酸酶等，作用機制主要是將米糠蛋白分子降解為可溶性物質，或將其從與半纖維素、植酸等形成的復合物中解聚后抽提出來。Ansharullah等[10]提出采用糖酶，破壞植物細胞壁來改善植物蛋白的提取率；也有研究表明蛋白質經(jīng)不同的蛋白酶水解后，會產(chǎn)生不同氨基酸序列和不同分子量的多肽，表現(xiàn)出不同的生物活性[11]；此外，蛋白酶水解制備多肽時，還會因為某些植物蛋白中可能含有酶抑制劑而發(fā)生競爭性抑制，酶促反應速度不僅不會提高，反而會迅速下降[12]。因此酶法制備多肽時，酶的種類、用量、底物濃度、溫度、pH、時間等參數(shù)都是酶法制備活性肽工藝的研究重點。Wang等[13]采用半纖維素酶和植酸酶聯(lián)合使用，提取米糠蛋白，蛋白提取率可達92%，采用木聚糖酶和植酸酶降解米糠中的木聚糖和植酸，解除它們與蛋白質的相互作用，增加和改善米糠蛋白的可溶性，通過酶法處理，使米糠蛋白的提取率從34%提高到76%；王立等[14]分別采用蛋白酶、糖酶提取米糠蛋白，其蛋白提取率在60%左右。

酶具有反應的專一性，如果采用單酶作用范圍局限，水解效率較低，實際操作中一般采用多酶進行水解，利用不同酶對蛋白質的酶解特異性起到協(xié)同增效作用。有研究表明[15-17]，蛋白質經(jīng)多酶復合水解的產(chǎn)物活性明顯高于相對應的單酶水解產(chǎn)物，而國內外多以單酶水解小米蛋白進行研究，關于復合酶水解小米蛋白制備活性肽還有待進一步研究。

1.3 生物發(fā)酵法

微生物發(fā)酵法制備生物活性肽，是指某些能夠代謝產(chǎn)生特定目標酶的微生物來生產(chǎn)活性肽，微生物在發(fā)酵階段將這些肽持續(xù)排放到體系中，具有此功效的微生物主要有枯草芽孢桿菌、保加利亞乳桿菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌等，微生物高效的蛋白質水解體系有助于生物活性肽的釋放，所生產(chǎn)的活性肽能夠直接進入人體內消化系統(tǒng)，更容易被人體吸收，因此更加安全，應用潛力巨大[18]。郭麗娜等[19]利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵小米糠，成功制備抗氧化活性肽；李慧娟等[20]以枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌組成混合菌株固態(tài)發(fā)酵豆粕制備具有ABTS自由基較強清除活性的大豆肽。但是微生物發(fā)酵法也存在某些不足之處，如微生物發(fā)酵及代謝過程復雜，產(chǎn)物難以控制。另外，發(fā)酵體系中為微生物提供氮源、碳源等的原輔料成分較多，造成產(chǎn)物的分離純化較為困難等，通過研發(fā)精確發(fā)酵控制技術、精簡發(fā)酵過程是未來發(fā)展的重要方向，從而實現(xiàn)目標肽的高效、精確制備。

此外也有報道采用物理方法結合酶水解技術提取蛋白質，效果明顯[21]，單獨采用反復凍融、超聲波、高速剪切和高壓等工藝時米糠蛋白提取率分別為12%，15%，16%和11%，而經(jīng)超聲波處理和淀粉酶水解，蛋白提取率提取為33.9%，若采用蛋白酶處理則提取率可達57.8%，經(jīng)高壓處理同時使用淀粉酶和蛋白酶處理后提取率可達66.6%，應用效果高于纖維素酶，所以采用物理方法解除米糠蛋白的束縛對蛋白的提取也是一種很好的輔助手段。

2 米糠蛋白肽的生物活性

2.1 抗氧化

眾多研究發(fā)現(xiàn)[22-23]，活性氧自由基造成的氧化損傷是造成機體衰老、細胞及組織損傷和細胞發(fā)生癌變的一個重要起因，因此清除超氧陰離子和羥自由基等的能力是評估肽的抗氧化值的重要指標。米糠的酶水解提取物中具有豐富的供氫體，通過對高度氧化性的自由基的還原反應可以使其連鎖反應得到有效抑制，進而對自由基發(fā)揮清除或抑制作用。有研究報道表明米糠蛋白肽具有較強的自由基清除能力。周梅等[24]研究表明，隨著米糠蛋白和米糠蛋白肽濃度增加，清除率增高，米糠蛋白肽在最高濃度9.6 mg/mL下DPPH清除率最大，結果為71.77%。米糠蛋白的DPPH清除率隨濃度變化不大，高濃度下DPPH清除率最大為29.91%，進一步證實DPPH清除率可能與特定時間水解產(chǎn)生的活性片段的多少、長度和序列等有關。于國萍等[25]利用木瓜蛋白酶和風味蛋白酶雙酶水解制備米糠蛋白肽，以DPPH，·OH清除率為主要指標，采用不同截留分子量（1.0×104Da和3×103Da）的超濾膜對米糠蛋白肽進行初步分離，超濾法處理得到不同分子質量的多肽，其抗氧化能力隨分子質量的增大而呈現(xiàn)出逐漸減弱的趨勢，分子質量小于3 000 Da的多肽組分RBP-Ⅲ對DPPH清除率最強。由此可知不同制備方法及分離純化條件所得到米糠蛋白肽的抗氧化活性差別較大。

2.2 ACE抑制活性

ACE又叫高活性酪蛋白血管緊張素轉化酶抑制肽，主要用于保健食品的生產(chǎn)，對于高血壓有很好的治療作用。眾所周知，人體內的血管緊張素Ⅰ在血管緊張素轉化酶的作用下生成血管緊張素Ⅱ，血管緊張素Ⅱ是己知的最高內源升壓肽，ACE抑制劑能阻止血管緊張素Ⅱ的生成，因此，ACE抑制劑可作為降血壓輔助劑。鄒智鵬等[26]采用堿性蛋白酶水解小米米糠蛋白，并經(jīng)膜分離法制備4種不同分子質量的多肽組分，研究小米米糠蛋白水解物及其膜分離組分的降血壓及抗氧化等相關活性發(fā)現(xiàn)，小米米糠蛋白水解物的降血壓活性與其分子質量大小呈負相關，研究認為＜1 kU肽組分可能作為功能性成分用于降血壓相關的功能食品和保健品的開發(fā)，小米米糠蛋白水解物是降血壓功能食品開發(fā)的優(yōu)良原料。Chen等[27]研究也發(fā)現(xiàn)，利用根霉菌oryzae發(fā)酵制備的小米肽具有降低大鼠血壓等功效。

2.3 免疫調節(jié)作用

研究表明，某些生物活性肽或蛋白酶解物能夠起到免疫調節(jié)作用（細胞免疫為主），包括淋巴細胞增殖、抗體合成及細胞因子調節(jié)作用。這些免疫調節(jié)肽具有調節(jié)人類淋巴細胞的增殖、刺激巨噬細胞的吞噬活性、抑制某些細胞因子的產(chǎn)生的作用[28-29]。在人體中，細胞免疫、體液免疫及非特異性免疫是機體的3個主要免疫功能，其免疫能力主要是通過血清溶血值、免疫器官增重、脾淋巴細胞增殖、單向免疫擴散以及單核吞噬細胞吞噬能力等來反映的。何曙劍[30]研究顯示，如果T淋巴細胞受到ConA的刺激，會出現(xiàn)母細胞增殖現(xiàn)象，通過對光密度值的測定可以看出，在經(jīng)過為期20 d的腹腔注射和灌胃之后，米糠肽對脾淋巴細胞增殖能力會得到顯著提升。張亞輝[31]通過在胰蛋白酶加酶量90 U/g、底物濃度5%、水解時間2.5 h條件下酶解米糠蛋白，其水解度達21.51%，米糠蛋白肽主要組分為分子量介于390～14 300 Da之間的5種短肽，灌胃給予高劑量米糠短肽能顯著提高正常小鼠脾臟、胸腺指數(shù)及脾淋巴細胞增殖能力等免疫活性指標，呈現(xiàn)較強的免疫調節(jié)活性。

2.4 低致敏

由于米糠蛋白非常容易被消化吸收，極少引發(fā)過敏，因此可將其作為特殊群體食品的添加蛋白。如市面上出售的母乳化奶粉中大多都是通過添加乳鐵蛋白和免疫球蛋白來增強嬰幼兒的免疫力，而此類蛋白中含有抗營養(yǎng)因子，容易引發(fā)過敏現(xiàn)象，嬰幼兒自身機體發(fā)育還不夠成熟，因此更容易發(fā)生過敏。米糠蛋白則不含類似致敏因子，以往的報道中也沒有發(fā)現(xiàn)嬰幼兒對稻米出現(xiàn)過敏反應，因此可將其作為增強免疫力的蛋白資源。王文高等[32]發(fā)現(xiàn)采用酶聯(lián)免疫吸附法對大豆分離蛋白和米糠蛋白進行抗原性試驗，結果發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白具有更強的抗原性，而米糠蛋白表現(xiàn)出很低的抗原性；利用大米蛋白過敏患者血清中特異性IgE與過敏原相結合的特點，檢測大米蛋白中各組分的抗原性，從鹽溶性的蛋白中分離出分子質量為16 000，15 500和14 000 U的過敏性蛋白，其等電點分別為pH 6.3，6.5和7.9，并指出過敏成分主要為清蛋白。Izumi等[33]推斷出16 000 U過敏蛋白的二硫鍵連接方式為5個分子內二硫鍵的存在使該蛋白質的多肽結構保持相對的穩(wěn)定，具有很高的耐熱性，不易被蛋白酶分解[31]。

3 結語與展望

動物蛋白因含有易導致心血管疾病的飽和脂肪酸和膽固醇，而使其攝入量受到限制。相對于動物蛋白來說，植物蛋白不僅資源豐富、廉價，尤其是某些植物蛋白肽還具有獨特的生理功能，可以被用作某些藥物替代品或者食品添加劑[34]，因此得到營養(yǎng)學界的極大關注。米糠蛋白作為一種兼顧環(huán)境和經(jīng)濟效益的植物性副產(chǎn)資源，具有其他植物蛋白無法比擬的低過敏性和高蛋白質生物價特性。米糠蛋白肽已知的營養(yǎng)標簽[35]有低過敏源、素食、高BCAA、非轉基因、無激素、無溶劑殘留、低嘌呤。我國關于提取米糠蛋白肽的研究和報道很多，但是距離成熟的工業(yè)化生產(chǎn)還有一段距離，因此，對于像我國這樣米糠資源豐富的國家來說，米糠蛋白的開發(fā)利用具有重要的現(xiàn)實意義與廣闊的應用前景，充分利用該蛋白資源，開發(fā)制備具有特定生理活性的米糠蛋白肽，對于提升大米精深加工利用水平和功能食品開發(fā)等具有重要意義。