潰瘍性結(jié)腸炎患者對英夫利昔單抗原發(fā)性失應(yīng)答的腸道黏膜基因篩選

楊 想, 吳 鶯

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科, 江蘇 鎮(zhèn)江, 212000)

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種發(fā)病原因尚不明確的慢性腸道非特異性炎癥，屬于炎癥性腸病(IBD)之一[1], 主流治療方式為藥物治療。英夫利西單抗(IFX)是一種抗腫瘤壞死因子(TNF)-α單克隆抗體(簡稱抗TNF-α單抗)，可通過阻斷組織和血液循環(huán)中的TNF-α與TNF-α受體結(jié)合，從而使T細胞和巨噬細胞的凋亡被誘導(dǎo)激活以降低炎癥水平，已被廣泛應(yīng)用于UC的臨床治療中[2]。但并非所有患者都對這種治療有反應(yīng)，治療后第8～12周即3個療程IFX治療后仍未達到黏膜愈合為原發(fā)性失應(yīng)答[3], 目前約有30%患者存在原發(fā)性無應(yīng)答[4]; 此外，第1年約有13%的初始應(yīng)答者在維持治療期間疾病復(fù)發(fā)，即繼發(fā)性失應(yīng)答，而且隨著時間的推移，失去應(yīng)答的患者不斷增多(40%～60%)[4]。對藥物的失應(yīng)答不僅會延誤患者的治療，還會增加患者的治療成本和副反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險。治療成本分析研究[5]提示，抗TNF-α藥物失應(yīng)答是IBD患者治療成本增加的主要驅(qū)動因素。因此，使用預(yù)測性生物標(biāo)記物來協(xié)助選擇治療藥物可能是必要的[6]。本研究挖掘GEO數(shù)據(jù)庫中IFX治療UC相關(guān)基因芯片進行生物信息學(xué)分析，尋找差異表達基因(DEGs)進行富集分析，并篩選出與UC患者對IFX原發(fā)性失應(yīng)答相關(guān)的關(guān)鍵基因，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

于GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載GSE12251、GSE14580、GSE23597數(shù)據(jù)集的基因芯片。基因芯片中，治療后第8周對IFX原發(fā)性失應(yīng)答的UC患者腸黏膜組織樣本為實驗組，治療后第8周對IFX應(yīng)答的UC患者的腸黏膜組織樣本為對照組。GSE12251包括治療后第8周對IFX應(yīng)答的UC患者12例，原發(fā)性失應(yīng)答患者11例; GSE14580包括治療后第8周對IFX應(yīng)答的UC患者8例，原發(fā)性失應(yīng)答患者16例; GSE23597包括治療后第8周對IFX應(yīng)答的UC患者27例，原發(fā)性失應(yīng)答患者7例。

1.2 差異基因篩選與可視化

應(yīng)用GEO2R在線工具軟件對GSE12251、GSE14580、GSE23597數(shù)據(jù)集樣本進行分組并分析DEGs, 以P<0.05、|log2FC|≥1(FC指差異倍數(shù)，即fold change)為條件篩選得到上調(diào)、下調(diào)基因，并進行數(shù)據(jù)集基因可視化展示。

1.3 功能富集分析

注釋、可視化和綜合發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(David, Version 6.8, http://david.ncifcrf.gov)是一個集成了生物數(shù)據(jù)和分析工具的在線生物信息數(shù)據(jù)庫，為使用者提供的生物信息包括全面的基因和蛋白質(zhì)功能注釋信息。為了分析相關(guān)DEGs的功能，本研究利用David在線數(shù)據(jù)庫進行生物學(xué)分析，設(shè)定P<0.05及錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)分析及核心基因(Hub基因)的篩選

將篩選得到的DEGs導(dǎo)入String在線數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/), 設(shè)定最小互作評分為0.4分，構(gòu)建蛋白質(zhì)互相作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖。采用Cytoscape3.8.0軟件對結(jié)果進一步進行可視化展示。利用Cytoscape插件MCODE獲得有顯著相互作用的功能模塊，設(shè)置參數(shù)為MCODE scores>7、Degree cutoff=2、Node score cutoff=0.2、K-score=2、Max. depth=100。利用cytoHubba插件的MCC算法篩選出得分最高的前20個基因作為關(guān)鍵基因。

1.5 對IFX治療原發(fā)性失應(yīng)答的UC患者的潛在治療藥物篩選

藥物-基因相互作用數(shù)據(jù)庫(DGIdb, http://dgidb.org/)是一個整合了來自組織和展示論文、數(shù)據(jù)庫和網(wǎng)絡(luò)資源的藥物-基因相互作用和基因可藥性信息的數(shù)據(jù)庫。DGIdb將30個不同來源的內(nèi)容標(biāo)準(zhǔn)化，包含藥物查詢、藥物-基因相互作用等更詳細的信息。將Hub基因列表上傳至DGIdb數(shù)據(jù)庫基因清單窗口框，尋找基因-藥物作用關(guān)系，得到PubMed id列表、相互作用類型和得分等結(jié)果數(shù)據(jù)，根據(jù)所得到的結(jié)果數(shù)據(jù)篩選潛在治療藥物[7]。

2 結(jié) 果

2.1 對IFX原發(fā)性失應(yīng)答的UC患者的DEGs標(biāo)識

應(yīng)用GEO2R軟件對GSE12251、GSE14580、GSE23597數(shù)據(jù)集進行篩選，根據(jù)篩選條件，在火山圖中將篩選得到的差異有統(tǒng)計學(xué)意義的表達基因用不同顏色展示，并鑒定出DEGs(GSE12251中為454個, GSE14580中為1 173個, GSE23597中為726個)，見圖1A、圖1B、圖1C[藍點、紅點分別代表下調(diào)、上調(diào)且符合篩選條件(P<0.05和|log2FC|>1)的DEGs, 黑點代表不符合篩選條件的DEGs]。3個數(shù)據(jù)集之間的重疊部分包含143個基因(上調(diào)基因10個，下調(diào)基因133個)，見圖1D。

A: GSE12251的DEGs火山圖譜(應(yīng)答與失應(yīng)答); B: GSE14580的DEGs火山圖譜(應(yīng)答與失應(yīng)答); C: GSE23597的DEGs火山圖譜(應(yīng)答與失應(yīng)答); D: 各數(shù)據(jù)集共表達的VENN圖(紫色、紅色、綠色的圓分別代表GSE12251、GSE14580、GSE23597數(shù)據(jù)集,重疊部分代表共表達的DEGs)。圖1 各數(shù)據(jù)集DEGs表達火山圖及其共表達的VENN圖

2.2 DEGs的基因本體論(GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)分析

為了分析DEGs的生物學(xué)分類，應(yīng)用David軟件進行功能和途徑富集分析，并利用Metascape在線分析網(wǎng)站對DEGs進行GO分析和KEGG分析。GO分析結(jié)果顯示: ① 生物過程(BP), DEGs主要富集于炎癥反應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫反應(yīng)等; ② 細胞組成(CC), DEGs 主要富集于質(zhì)膜、細胞外區(qū)域和細胞外空間等; ③ 分子功能(MF), DEGs富集于細胞因子活性和受體活性。KEGG分析結(jié)果提示, DEGs富集于細胞因子-細胞因子受體相互作用、破骨細胞分化、Toll樣受體(TLR)信號通路、Jak-STAT信號通路、TNF信號通路、IBD等。見表1、表2。

表1 GO分析結(jié)果

表2 KEGG分析結(jié)果

2.3 PPI分析

構(gòu)建DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)(見圖2A), 并使用Cytoscape軟件獲得重要的模塊(見圖2B、圖2C)。應(yīng)用cytoHubba插件的MCC算法篩選出20個關(guān)鍵基因:CXCL8、CXCL10、IL6、IL1β、TLR2、TLR8、CCL4、CXCR2、TLR1、PTPRC、CSF3、SELL、SELE、PTGS2、FCGR2A、C5AR1、IL1α、TREM1、FPR2、IL6R。關(guān)鍵基因的相互作用模塊見圖3。

A: 對IFX原發(fā)性失應(yīng)答UC患者的DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò); B: 積分排名第1的相互作用功能模塊; C: 積分排名第2的相互作用功能模塊。圖2 對IFX原發(fā)性失應(yīng)答的UC患者的DEGs及相互作用功能模塊

圖3 關(guān)鍵基因的相互作用模塊

2.4 對IFX治療原發(fā)性失應(yīng)答的UC患者的潛在治療藥物篩選結(jié)果

將PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選出的20個關(guān)鍵基因?qū)隓GIdb數(shù)據(jù)庫尋找相關(guān)潛在藥物，得分排名前3的藥物分別為薩利魯單抗(sarilumab)、阿伐可泮(avacopan)、托拉利單抗(tomaralimab), 其或許在未來可作為對IFX治療原發(fā)性失應(yīng)答UC患者的備選藥物。

3 討 論

本研究整合了GSE14580、GSE12251、GSE23597這3個微陣列數(shù)據(jù)集，利用GEO2R在線分析工具篩選出143個共同的DEGs, 并進行GO和KEGG富集分析來尋找DEGs之間的相互作用。GO功能注釋表明，對IFX原發(fā)性失應(yīng)答的DEGs是主要存在于質(zhì)膜的細胞學(xué)組分，介導(dǎo)細胞因子活性和受體活性的生物學(xué)功能，參與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞對脂多糖的反應(yīng)等生物學(xué)過程，說明基因表達失調(diào)在UC患者對IFX是否應(yīng)答中有著重要作用。

KEGG分析發(fā)現(xiàn)，對IFX原發(fā)性失應(yīng)答的UC患者的DEGs與TLR通路、TNF信號通路以及Jak-STAT信號通路等密切相關(guān)，相關(guān)研究[8]表明這3個通路的基因多態(tài)性與抗TNF治療的應(yīng)答相關(guān)。TLR通路是啟動IBD炎癥反應(yīng)的重要通路，也是炎癥通路中的一個重要調(diào)節(jié)器[9-10], 對IFX原發(fā)性失應(yīng)答的UC患者所有TLR對固有細胞因子反應(yīng)持續(xù)降低，且與應(yīng)答者相比，其在TLR刺激下細胞因子產(chǎn)生的倍數(shù)變化更小; 此外，與TLR激活后的應(yīng)答者相比，原發(fā)性失應(yīng)答者的IL-10水平較低，這可以解釋為何這些患者使用IFX治療無法控制炎癥[11]。研究[12]表明，參與TLR通路從而激活核因子κB(NFκB)的基因、調(diào)節(jié)TNF-α信號傳導(dǎo)的基因是預(yù)測患者對抗TNF治療反應(yīng)的重要因素，這也提示了調(diào)節(jié)TNF信號和TNF合成的基因是抗TNF治療效果的重要預(yù)測因素。JAK-STAT通路的基因變異與IBD風(fēng)險增加相關(guān), JAK-STAT通路蛋白負(fù)責(zé)介導(dǎo)許多IBD相關(guān)細胞因子的受體信號，這些細胞因子參與調(diào)節(jié)腸道通透性，從而進一步引起腸道上皮的損傷[13], 而嚴(yán)重的腸道損傷會導(dǎo)致患者體內(nèi)的抗TNF-α藥物通過潰爛的腸黏膜丟失[14], 這可能解釋了JAK-STAT通路為何與IFX治療原發(fā)性失應(yīng)答密切相關(guān)。此外, JAK-STAT抑制劑如托法替尼目前已被用于常規(guī)治療失敗和(或)對其他生物制劑失去反應(yīng)性的UC患者[15]。

本研究應(yīng)用Cytoscape軟件篩選出20個關(guān)鍵基因，其中CXCL8即白細胞介素-8(IL-8), 具有預(yù)測UC對IFX的反應(yīng)性的潛力。IFX原發(fā)性失應(yīng)答的UC患者血清IL-8水平下降相較于IFX應(yīng)答的UC患者更不明顯[16], 且原發(fā)性失應(yīng)答患者的基線IL-8水平較高[17]。另一項針對IFX失應(yīng)答的CD患者的研究[18]顯示，失應(yīng)答患者單核細胞的CXCL8 mRNA是上調(diào)的。白細胞介素-6(IL-6)是一種多效性細胞因子，參與多種生物學(xué)過程，包括腫瘤發(fā)生、造血、炎癥和免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)[19-20]。研究[21]報道，患有嚴(yán)重IBD的患者或小鼠模型更可能有更高的血清IL-6水平。白細胞介素-1β(IL-1β)作為強效促炎細胞因子，可誘導(dǎo)前列腺素合成、中性粒細胞流入和激活、T細胞激活和細胞因子產(chǎn)生、B細胞激活和抗體產(chǎn)生以及成纖維細胞增殖和膠原蛋白產(chǎn)生[22]。IL-6及IL-1β基因高表達被證明與UC患者對IFX治療原發(fā)性失應(yīng)答有關(guān)，這可能是此類患者潛在的治療目標(biāo)[12]; 此外，治療過程中血清IL-6水平降低可作為UC患者對IFX治療應(yīng)答的預(yù)測指標(biāo)[16]。TLR2為TLR家族成員，其通過識別病原相關(guān)的分子模式及某些內(nèi)源性配體，引發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的釋放，在天然免疫防御中起重要作用并最終激活獲得性免疫系統(tǒng)。與對IFX應(yīng)答的UC患者相比，對IFX失應(yīng)答的UC患者血液中TLR2表達升高[23]。TLR2中的2個單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(rs4696480和rs11938228)與IFX治療UC患者的反應(yīng)性相關(guān)[12]。目前雖無明確的研究結(jié)果證明PTPRC與IFX治療UC反應(yīng)的關(guān)系，但其表達被認(rèn)為與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)的抗TNF-α治療反應(yīng)相關(guān)[24]。髓系細胞觸發(fā)受體-1(TREM-1)會加重結(jié)腸炎癥，而抑制體內(nèi)TREM-1可通過調(diào)節(jié)自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕結(jié)腸炎[25]。國外已有多項研究[26-28]證明，對IFX原發(fā)性或繼發(fā)性失應(yīng)答的UC患者，早期TREM1表達會升高。IBD患者的CD14+單核細胞的TREM1高表達時，抗TNF反應(yīng)必需的Fcγ受體和自噬通路的活性降低[29], 從而影響抗TNF反應(yīng)。CXCL10、TLR8、CCL4、CXCR2、TLR1、PTPRC、CSF3、SELL、SELE、PTGS2、FCGR2A、C5AR1、IL1α、FPR2、IL6R基因在UC患者IFX原發(fā)性失應(yīng)答中的作用尚不清楚，有待進一步研究。

薩利魯單抗是一種靶向結(jié)合白細胞介素-6受體(IL-6R)的人源化單克隆抗體，抑制該受體介導(dǎo)的炎性信號，在既往接受1種或多種疾病修飾抗風(fēng)濕藥物治療效果欠佳的中度至重度活動性RA成人患者的治療中取得了較好的療效[30]。早期IL-6高水平在UC患者對IFX繼發(fā)性失應(yīng)答中起到了提示作用[16], 薩利魯單抗可阻斷IL-6與其受體的結(jié)合，中斷細胞因子介導(dǎo)的炎癥信號，從而抑制炎癥進展，而托拉利單抗是一種人源化TLR2 IgG4單克隆抗體，對IL-6也存在持續(xù)抑制作用[31], 這2種藥物均可通過抑制IL-6的生物作用抑制炎癥反應(yīng)，未來或可成為UC的治療藥物。阿伐可泮是選擇性補體C5a受體抑制劑，C5a能夠調(diào)節(jié)IL-6、IL-8等促炎介質(zhì)的表達[32]。阿伐可泮在抗中性粒細胞胞漿抗體(ANCA)相關(guān)血管炎的治療中取得了進展[33-34], 且補體C5a受體抑制劑可以預(yù)防IBD老鼠模型腸道炎癥的產(chǎn)生[35]。阿伐可泮可以抑制IL-6、IL-1β、TNF-α的產(chǎn)生，并促進抗炎因子IL-10、TGF-β的生成[36], 而IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-10及TGF-β均在IBD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，故阿伐可泮未來或可成為UC的潛在治療藥物。

本研究從GEO數(shù)據(jù)庫獲取對IFX治療失應(yīng)答UC患者的相關(guān)數(shù)據(jù)集，篩選出143個DEGs, 對DEGs進行GO和KEGG功能分析并進行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，篩選出排名前20位的關(guān)鍵基因。應(yīng)用DGIdb數(shù)據(jù)庫對關(guān)鍵基因進行分析發(fā)現(xiàn)，薩利魯單抗、阿伐可泮、托拉利單抗是對IFX失應(yīng)答的UC患者可能的有效治療藥物，為UC的進一步臨床研究提供了新的視角。