檢測牛5種腹瀉病毒的多重RT-PCR方法的建立及應(yīng)用

孫 吉，岳 華,2，湯 承,2*

(1. 西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041； 2.青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室，成都 610041)

犢牛腹瀉在養(yǎng)殖過程中十分常見，具有高發(fā)病率和高致死率的特點，給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。引起牛腹瀉的病原體有細菌、病毒、寄生蟲等[1]，其中造成牛腹瀉的最常見病毒有牛輪狀病毒 (bovine rotavirus，BRV)[2]、牛冠狀病毒 (bovine coronavirus，BCoV)[3]、牛病毒性腹瀉黏膜病病毒 (bovine viral diarrhea virus，BVDV)[4]。近幾年的國內(nèi)相關(guān)報道，牛紐布病毒(bovine nebovirus，BNeV)和牛諾瓦病毒(bovine norovirus，BNoV)被報道與牛腹瀉疾病有關(guān)[5]，二者均屬于牛腸道嵌杯病毒(bovine enteric caliciviruses, BECs)[6-7]。上述5種病毒均可以造成犢牛的腹瀉，并且常發(fā)生混合感染。

牛輪狀病毒(BRV)是呼腸孤病毒科輪狀病毒屬一種雙鏈無囊膜RNA病毒[8]。A群輪狀病毒也是引起家畜感染的最主要的原因[9]。通常導(dǎo)致年齡小于3周齡的小牛腹瀉。臨床癥狀表現(xiàn)為排出水樣淺黃色稀便，嚴重時也表現(xiàn)為血便并通常含有大量的黏液，成年牛一般呈隱性感染，并通過糞便將病毒排放到環(huán)境中引起群體大規(guī)模感染[10]。近年來，有研究表明，BRV能跨種間傳播造成人或其他動物的感染[11-12]。牛冠狀病毒(BCoV)是單鏈無節(jié)段的正向基因組RNA組成，屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬[13]。BCoV主要引起1～2周齡小牛的腹瀉，成年動物出血性腹瀉、并伴有呼吸系統(tǒng)疾病，研究表明，BCoV在我國普遍存在；也是引起犢牛及成年牛腹瀉的重要病原之一[14]。牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)為單股正鏈RNA病毒，是瘟病毒屬的成員[15]，主要導(dǎo)致牛的發(fā)燒，腹瀉，白細胞減少，產(chǎn)奶量減少[16]；引起機體的免疫抑制和持續(xù)性帶毒，亦會導(dǎo)致懷孕母牛的流產(chǎn)、犢牛的腸道和呼吸道的臨床癥狀[17]，病毒的傳播也會造成其他動物的感染[18]。牛諾瓦病毒(BNoV)屬于嵌杯病毒科，是無囊膜病毒，為線性單鏈正鏈RNA[19]。BNoV主要經(jīng)糞-口傳播，引起的小牛感染的臨床癥狀主要表現(xiàn)為被毛凌亂、精神沉郁、嚴重嗜睡、急性且持續(xù)的腹瀉，以及伴有吸收障礙[20-21]。牛紐布病毒(BNeV)屬于嵌杯病毒科，為無囊膜的單股正鏈RNA病毒[22]，主要引起3日齡到6月齡的小牛腹瀉。其臨床癥狀主要出現(xiàn)糞便顏色變化，嚴重時呈血便、嚴重腹瀉和腸道損傷[23]，該病毒在我國奶牛和牦牛中廣泛流行；具有獨特的進化趨勢[24]。以上5種病原微生物所引起犢牛腹瀉在病理變化和臨床癥狀等方面極為相似，在臨床診斷中很難進行快速準(zhǔn)確的判斷。

有研究對2017—2018年山東13個地區(qū)624份牛腹瀉樣本進行檢測，檢出率分別為BRV17.70%、BCoV8.84%和BVDV34.58%[25]。2010—2011年，對北京3個地區(qū)1 650份血液樣品進行了BVDV、BCoV、BRV感染抗體檢測，結(jié)果顯示BVDV抗體平均陽性率為48.20%；BCV抗體平均陽性率為57.20%；BRV抗體平均陽性率為52.20%[26]。對2017年11月—2018年5月采自四川、遼寧、河南、山東、陜西5個省的共計93份奶犢牛腹瀉糞便樣本進行檢測，BNoV的檢出率達到25.81%[27]。2018年8—11月采自新疆和遼寧的135份奶犢牛腹瀉樣本中BNeV的檢出率為67.41%[28]。由上可見這5種病毒在我國廣泛流行。PCR技術(shù)廣泛運用在動物疫病的診療過程中，是一種重要的分子檢測的手段[29]。國內(nèi)外已報道多個關(guān)于檢測這5種 病毒引起牛腹瀉[6,28,30-32]的單一PCR方法等。由于檢測單一病毒的PCR方法耗時耗力且只能檢測特定的病毒，存在著部分缺陷。國內(nèi)外學(xué)者在此基礎(chǔ)上建立了可以同時檢測BRV和BCoV[12]，BCoV和BNoV[33]，BRV、BCoV和BVDV[34]等兩種及以上引起牛腹瀉病毒的多重PCR方法。尚無就檢測本試驗的5種致牛腹瀉病毒的多重PCR方法的報道，本試驗的目的在于建立能同時檢測這5種病毒的多重PCR方法, 對疾病作出快速準(zhǔn)確的鑒別診斷，節(jié)約實驗室成本和時間。

1 材料與方法

1.1 病毒(菌)株和樣本

牛輪狀病毒、牛冠狀病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛諾瓦病毒和牛紐布病毒的陽性樣本，由本實驗室保存。用于特異性驗證的病毒(菌)菌株及核酸樣本；牛星狀病毒(bovine astrovirus, BAstV)Swun0201、牛細小病毒(bovine parvovirus， BPV)、牛嵴病毒(bovine kobuvirus，BKV)、牛源K99大腸桿菌Swun4025、牛源都柏林沙門菌Swun3736和牛源空腸彎曲桿菌Swun1639的核酸樣本由本實驗室保存。

檢測方法比較的樣本：16份肉牛腹瀉糞便樣本(采自2020年9月四川省閬中1個牧場)，10份奶牛腹瀉樣本(采自2020年12月四川省西昌市1個牧場)。由本實驗室保存。

臨床樣本：220份采自于阿壩州的牦牛腹瀉糞便樣本(2019年6月四川省阿壩縣和若爾蓋縣2個牧場共38份和采自于2020年7—8月四川省紅原縣、若爾蓋縣和阿壩縣的8個牧場共182份)。所有樣本-80 ℃保存。

1.2 主要試劑和儀器

Trizols Reagent、Prime ScriptTMRT-PCR Kit、Premix TaqTM、DNA Marker DL2000、pMD19-T克隆載體、DH5α感受態(tài)細胞、DNA Marker均購自大連寶生物工程有限公司；Gel Extraction Kit膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自O(shè)MEGA BIO-TEK 公司。凝膠成像系統(tǒng)Doc2000(BioRad公司，美國), 超微量核酸蛋白測定儀(NanoDrop One)。

1.3 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)NCBI上登錄的BVDV、BNoV、BRVA、BNeV 4種病毒基因的保守序列,用Primer5.0軟件對4種病毒的基因保守區(qū)域各設(shè)計1對引物，參考文獻[35]合成BCoV的檢測引物，引物序列及相關(guān)信息見表1。

表1 多重PCR引物序列

1.4 核酸提取

牛糞便樣本與PBS以 1∶5混勻后制成懸液，-80 ℃ 反復(fù)凍融3次，12 000 r·min-1離心15 min， 取上清250 μL并根據(jù)TrizolTMReagent試劑盒說明書的步驟提取樣本總RNA，并按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系為(20 μL)，采用酚-氯仿法提取細菌的DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 單一RT-PCR的檢測方法的優(yōu)化

為了確定單一病毒RT-PCR的反應(yīng)條件，退火溫度可以參考引物設(shè)計時的軟件和引物合成訂單，從而分別初步建立檢測BCoV、BNoV、BRVA、BVDV和BNeV的單一RT-PCR，再對其反應(yīng)程序中設(shè)置不同的退火溫度，在51～60 ℃之間設(shè)置6個梯度和引物濃度，確定最佳退火溫度和引物濃度。采用的是25 μL的反應(yīng)體系：Premix TaqTM12.5 μL，cDNA 2 μL， 上下游引物各1 μL，ddH2O補足至25 μL。經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果，送生物公司進行測序。

1.6 陽性質(zhì)粒的制備

擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，將擴增出來的特異性條帶進行膠回收，連接至pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，克隆加入到含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)10 h， 將陽性克隆送至生工生物有限公司進行測序，并將測序的結(jié)果用生物軟件(BioXm)進行比對和分析，將測序正確的重組質(zhì)粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品。

1.7 多重RT-PCR擴增及反應(yīng)條件的優(yōu)化

以5種病毒的陽性重組質(zhì)粒DNA混合物為模板,將5個病毒陽性質(zhì)粒等量混后作為多重RT-PCR反應(yīng)模板，建立25 μL的PCR反應(yīng)體系；Premix TaqTM12.5 μL，cDNA 2 μL，上下游引物各0.1～0.8 μL，ddH2O補足至25 μL。保持緩沖體系不變，對退火溫度(退火溫度在50～60 ℃之間設(shè)8個 梯度)和引物濃度進行優(yōu)化。

1.8 特異性試驗

用本試驗建立的五重RT-PCR方法對“1.1”中待檢病原的核酸樣本進行檢測, 并設(shè)立BRVA、BCoV、BVDV、BNoV和BNeV以及5種病毒混合的陽性標(biāo)準(zhǔn)對照, 以評價該方法的特異性。

1.9 重復(fù)性試驗

將5種陽性質(zhì)?；旌献鳛榉磻?yīng)模板并置于-20 ℃保存，用此方法對其進行擴增試驗重復(fù)3次，每次間隔1周，評價其重復(fù)性。

1.10 敏感性試驗

用核酸蛋白儀測定5種病毒陽性質(zhì)粒的濃度分別為BNoV 2.2 ng·μL-1、BRVA1.8 ng·μL-1、BNeV 2.2 ng·μL-1、BCoV 2.2 ng·μL-1和BVDV 2.1 ng·μL-1，進行10倍倍比稀釋，分別為10-1到10-8。取混合稀釋液2 μL作為模板。用本試驗建立的RT-PCR方法進行檢測, 確定檢測下限。

1.11 與單一RT-PCR的檢測符合率的比較

利用本試驗建立的五重RT-PCR方法對2020年 采自四川閬中的16份肉牛腹瀉糞便樣本和西昌的10份奶牛腹瀉糞便樣本進行檢測，檢測結(jié)果與單一RT-PCR方法進行比較。最終評價多重RT-PCR方法的符合率情況。

2 結(jié) 果

2.1 單一RT-PCR的優(yōu)化

以BRVA、BCoV、BVDV、BNoV和BNeV的cDNA作為模板，分別用相對應(yīng)的PCR擴增引物進行單重PCR擴增，獲得的目的片段大小均與預(yù)期結(jié)果一致(圖1)。經(jīng)送生工生物公司測序，再進行blast序列比對，結(jié)果表明，各個病毒所擴增的目的片段均為所對應(yīng)病毒的靶基因，基因序列的相似度為100%。

M. DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. BNoV；3. BRVA；5. BNeV；7. BCoV；9. BVDV; 2、4、6、8、10. 陰性對照M. DL2000 DNA marker; 1. BNoV; 3. BRVA; 5. BNeV; 7. BCoV; 9. BVDV; 2, 4, 6, 8, 10. Negative control圖1 單一RT-PCR的擴增Fig.1 Single RT-PCR amplification

2.2 多重RT-PCR反應(yīng)體系及條件的優(yōu)化

對退火溫度進行優(yōu)化，確定最優(yōu)的反應(yīng)條件: 94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55.7 ℃退火35 s， 72 ℃延伸45 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸6 min； 16 ℃反應(yīng)結(jié)束。

通過對引物濃度以及反應(yīng)體系的優(yōu)化，最終反應(yīng)體系為Premix TaqTM12.5 μL， BCoV F/R各0.5 μL、BNoV F/R各0.4 μL、BRVA F/R各0.4 μL、BVDV F/R各0.5 μL、BNeV F/R各0.4 μL，樣本DNA 2 μL， ddH2O補足至25 μL。

2.3 多重RT-PCR特異性試驗

所建立的五重RT-PCR方法能夠擴增出五種陽性質(zhì)粒的混合樣本和5種病毒的陽性樣本，同時對“1.1”材料中本實驗室所保存其他的細菌和病毒株的陽性樣本均不能擴增出目的片段(圖2)。

M. DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 5種陽性質(zhì)?；旌?；2. BVDV；3. BCoV；4. BNeV；5.BRVA；6. BNoV；7. BPV；8. BAstV；9. BKV；10. E. coli；11.Salmonella；12. Campylobacter jejuniM. DL2000 DNA marker; 1. Mixture of five positive plasmids; 2. BVDV; 3.BCoV； 4. BNeV; 5. BRVA; 6. BNoV; 7. BPV; 8. BAstV; 9. BKV; 10. E. coli; 11.Salmonella; 12. Campylobacter jejuni圖2 多重PCR特異性試驗Fig.2 Specificity test of the multiplex PCR

2.4 多重RT-PCR重復(fù)性試驗

用所建立的方法重復(fù)檢測陽性質(zhì)?；旌夏０?次，每次間隔一星期，結(jié)果均可見5條清晰的條帶，表明方法穩(wěn)定性良好(圖略)。

2.5 多重RT-PCR敏感性測定

在本試驗的五重RT-PCR中，BNeV能擴增的最低檢測下限為2.0×105copies·μL-1、BNoV最低檢測下限1.96×105copies·μL-1，BRVA最低檢測下限1.63×105copies·μL-1，BCoV最低檢測下限2.0×106copies·μL-1，BVDV最低檢測下限1.9×105copies·μL-1(圖3)。

M. DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 10-1；2. 10-2；3. 10-3；4. 10-4；5. 10-5；6. 10-6；7. 10-7M. DL2000 DNA marker; 1. 10-1; 2. 10-2; 3. 10-3; 4. 10-4; 5. 10-5; 6. 10-6; 7. 10-7圖3 多重PCR敏感性試驗Fig.3 Sensitivity tests of the multiplex PCR

2.6 與單一PCR檢測結(jié)果符合率的比較

用本試驗建立的五重RT-PCR方法對四川閬中16份肉牛和西昌10份奶牛的腹瀉糞便樣本的檢測結(jié)果顯示，BNeV陽性為1份，陽性率為3.8%； BVDV陽性為2份，陽性率為7.7%；BCoV陽性為8份，陽性率為30.8%。沒有檢測出BRVA和BNoV的陽性樣本，與單一RT-PCR方法檢出的陽性樣本數(shù)一致且陽性符合率100%。表明本試驗建立的五重RT-PCR可應(yīng)用于臨床檢測。

2.7 臨床樣本的檢測

運用所優(yōu)化并建立好的五重RT-PCR的方法對采集(2019年6月—2020年8月)阿壩州的220份 牦牛腹瀉糞便樣本進行檢測，10個牛場中BRVA牛場陽性占比9/10，BNoV牛場陽性占比3/10，BNeV牛場陽性占比4/10。對阿壩州地區(qū)的牦牛腹瀉情況做出詳細記錄，總結(jié)其流行情況(表3)。

表2 與單一PCR檢測結(jié)果的比較

3 討 論

多重PCR要求引物在同一反應(yīng)條件下對單個或多個病毒的特定DNA基因序列的擴增，靶基因的選擇和引物的設(shè)計成為了多重RT-PCR的兩個重要的制約條件[36]。針對牛腹瀉的多種病原混合感染的情況，國內(nèi)外學(xué)者建立了能夠同時檢測出引起牛腹瀉的兩種或以上病原的RT-PCR方法。這其中大多數(shù)方法靶基因的選擇都與單一RT-PCR相一致。其中冠狀病毒的N基因、輪狀病毒的VP6基因和牛病毒性腹瀉病毒的5′UTR基因已經(jīng)成為國內(nèi)外研究者建立檢測方法的首選靶基因。筆者在試驗中發(fā)現(xiàn)，在設(shè)計冠狀病毒的特異性檢測引物時，國內(nèi)外研究人員很多都選擇N基因作為首選靶基因，復(fù)核宏病毒組技術(shù)證實為陽性的牛腹瀉糞便樣本時，結(jié)果幾種方法均未能檢出[35]，追其方法的檢出率和準(zhǔn)確性有待進一步驗證，遂選擇本實驗室已建立好的冠狀病毒的檢測方法。諾瓦病毒的引物設(shè)計多選擇為ORF1中的RdRp基因，但BNoV在RdRp區(qū)存在著多個核苷酸發(fā)生突變[37]，所以針對諾瓦病毒這種靶基因的特點，如何設(shè)計出特異性檢測引物成為了非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。輪狀病毒在國內(nèi)外牛腹瀉樣本中主要檢測出的多為A型，不同品種的牛感染的輪狀病毒在基因位點上也存在著少許的突變。VP6基因常常作為輪狀病毒分子檢測的首要靶基因，但其存在不同程度的點突變[38]，所以選擇更為保守的基因片段成為了提高檢出率的重中之重。

筆者選擇了與單一PCR檢測方法同樣的病毒靶基因來設(shè)計引物，運用Mega 7生物軟件進行了保守基因的基本的生物信息學(xué)分析，選擇了更為保守的基因片段并同時設(shè)立兼并堿基作為特異性擴增引物。筆者在設(shè)計引物的同時，嚴格控制退火溫度之間的差距，盡量保持引物的Tm值相同或差距不大。通過對退火溫度的優(yōu)化，最終確定為55.7 ℃。本研究充分考慮擴增的目的條帶能夠在電泳圖上被有效分開便于觀察，各條帶之間的差距大于70 bp。在2%的瓊脂糖凝膠濃度時，可以觀察到的圖像最為清晰，引物之間沒有形成二聚體結(jié)構(gòu)，且有著較好的特異性、靈敏度和穩(wěn)定性。證明本試驗建立的五重PCR 方法可用于臨床病料的檢測與診斷，為這5種病毒提供新的分子檢測手段。

根據(jù)近幾年國內(nèi)的流行病學(xué)的調(diào)查資料顯示，牛輪狀病毒、牛冠狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒是引起牦牛腹瀉的3種病毒。有研究對2018年采自西藏林芝市波密縣210份待檢樣品中分別檢出BCoV的抗原陽性率為35.70%；BVDV抗體陽性率為78.60%[39]。對來源于2012年9—12月川西北阿壩州8縣的1 070份牦牛血清行了抗體檢測，結(jié)果顯示，BVDV、BCoV和BRV抗體平均陽性率分別為44.3%、84.1%和94.4%[40]。研究結(jié)果表明這3種 病毒在牦牛中普遍存在，需進一步加強該地區(qū)牦牛病毒性腹瀉疾病的綜合防制。對采自2017年1月—2018年7月的354個牦牛腹瀉樣品進行RT-PCR檢測， BNeV的陽性率為22.0%[41]。此次檢測結(jié)果證實牛諾瓦病毒也可造成牦牛的感染。由于以上5種病毒均可引起牦牛的腸道的炎癥、腹瀉、脫水等臨床病理表現(xiàn)且常常發(fā)生混合感染，大大增加了臨床診斷和病情監(jiān)測的難度。

在與單一PCR進行比較的樣本中，并沒有檢測出BRV和BNoV，其原因可能是宿主種類、地域或是管理差異帶來的結(jié)果，且可能病毒在不同種類牛上的遺傳演變存在著一定差異。對2019年6月—2020年8月采自于阿壩州的220份牦牛樣品的檢測結(jié)果顯示，BRV依然是引起牦牛腹瀉的主要病毒，在紅原縣和若爾蓋縣的腹瀉樣本中都有較高的檢出率，檢出率達到40.5%，說明還需要進一步加強監(jiān)控輪狀病毒的流行趨勢，此外BNoV的陽性檢出率為5.9%、BNeV的陽性檢出率為4.5%。關(guān)于這兩種新發(fā)病毒的檢出情況還是要加強監(jiān)測，由于嵌杯病毒科的靶基因RdRp基因不是很穩(wěn)定，時有發(fā)生點突變，導(dǎo)致其檢出率下降。所以應(yīng)加強對BNoV和BNeV兩種病毒的實時監(jiān)控，即時的建立新的檢測方法來做好進一步的防治措施。此次檢測結(jié)果中并沒有BCoV和BVDV兩種病毒的檢出，筆者分析其原因可能由于疫苗的接種、飼養(yǎng)環(huán)境的改善和更良好的科學(xué)飼養(yǎng)方法導(dǎo)致，也可能存在著5對引物間的相互干擾，導(dǎo)致多重RT-PCR的靈敏性上還欠缺。在五重RT-PCR的檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，牛的腹瀉往往也因為兩種及以上的病毒共同感染所致，兩種病毒引起的混合感染的陽性檢出率為5%，3種病毒混合感染的陽性檢出率為0.5%?；旌细腥镜牟《径紴榕］啝畈《竞捅瓲畈《?，究其原因還有待進一步研究。病毒的混合感染可導(dǎo)致更嚴重的臨床癥狀及病變，更有嚴重的情況被治療后導(dǎo)致預(yù)后不良。運用此方法可以快速準(zhǔn)確地進行鑒別診斷，臨床治療時可以對癥下藥，爭取了寶貴的治療時間，且可降低多方面的損失。

4 結(jié) 論

首次成功建立了可以同時檢測牛A群輪狀病毒(BRVA)、牛冠狀病毒(BCoV)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、牛諾瓦病毒(BNoV)和牛紐布病毒(BNeV)的多重RT-PCR方法，可以滿足對臨床樣本的快速診斷。本方法可充分節(jié)省時間、人力和節(jié)約診斷成本。目前阿壩州部分地區(qū)牛場引進牛群中，BRV、BCoV和BVDV仍然是引起牦牛腹瀉的主要病毒， BNoV和BNeV引起的腹瀉更加值得關(guān)注，并且存在著混合感染的情況，檢測結(jié)果可為當(dāng)?shù)氐囊咔榉揽睾蜕a(chǎn)養(yǎng)殖提供重要參考。