基于高通量測(cè)序和小分子核苷類似物診斷與治療貓傳染性腹膜炎病例轉(zhuǎn)歸

李 笨，郭富強(qiáng)，王偉偉，金寧一，金秋實(shí)，米志強(qiáng)，李 昌*，王茂鵬*

(1.溫州大學(xué) 病毒學(xué)研究所，溫州 325035； 2.瑞鵬寵物醫(yī)院，深圳 518000； 3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院長(zhǎng)春獸醫(yī)研究所，長(zhǎng)春 130122； 4.軍事醫(yī)學(xué)研究院 微生物流行病研究所，北京 100071； 5. 牡丹江心血管病醫(yī)院影像介入診療中心，牡丹江 157001)

貓冠狀病毒(feline coronavirus, FCoV)是Alpha冠狀病毒屬成員之一，可引起家養(yǎng)和野生貓科動(dòng)物感染，根據(jù)刺突(spike)蛋白的氨基酸序列和血清型不同，又可分為貓腸道冠狀病毒(feline enteric coronavirus, FECV)和貓傳染性腹膜炎病毒(feline infectious peritionitis virus, FIPV)[1-2]。現(xiàn)有研究假說(shuō)證實(shí)FIPV是由FECV在宿主體內(nèi)病毒基因組發(fā)生特定突變衍生而來(lái)，可引起體腔內(nèi)富含蛋白質(zhì)漿液積液以及膿性肉芽腫，最終使宿主慢性、漸進(jìn)性全身感染而死亡[3-4]。根據(jù)其臨床癥狀有無(wú)腹水可分為干性和濕性，患病動(dòng)物常見食欲廢絕、腹瀉、被毛混亂、呼吸急促等臨床癥狀，個(gè)別嚴(yán)重的病例還有共濟(jì)失調(diào)等神經(jīng)癥狀[5]。

FIPV病因復(fù)雜，在我國(guó)寵物臨床上多使用影像學(xué)檢查、血常規(guī)等診斷方法[6-7]，配合S蛋白突變位點(diǎn)檢測(cè)來(lái)確診該病[8]，但該法仍存在較高假性結(jié)果。而隨著高通量測(cè)序的發(fā)展，宏基因組學(xué)技術(shù)已經(jīng)在病原發(fā)現(xiàn)、流行病學(xué)調(diào)查領(lǐng)域發(fā)揮作用，在疾病診斷等方面存在巨大潛能，尤其在無(wú)癥狀感染、混合感染檢測(cè)方面具有特殊優(yōu)勢(shì)[9-11]。GS-441524是一類治療冠狀病毒的新型小分子核苷類似物，有研究證明能夠在體內(nèi)和體外具有良好的干擾冠狀病毒遺傳物質(zhì)復(fù)制，阻止新病毒的產(chǎn)生的藥理作用[12-13]。本研究基于高通量測(cè)序診斷和血常規(guī)、生化分析、fSAA等綜合診療指標(biāo)，對(duì)FIPV感染的美國(guó)短毛貓進(jìn)行GS-441524治療，記錄從發(fā)病到痊愈的診治過(guò)程。經(jīng)征得病例的主人同意后，愿意將其治療過(guò)程公開，以為其他相似病例的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 患病動(dòng)物

1只1歲雄性美國(guó)短毛貓，體重3.58 kg，已絕育，已按完整的免疫程序進(jìn)行疫苗接種。因連續(xù)幾日出現(xiàn)精神萎靡不振，食欲降低、毛發(fā)凌亂、呼吸困難等現(xiàn)象，由主人送至寵物醫(yī)院，由獸醫(yī)師收診。

1.2 臨床癥狀及檢查

主訴該貓有腹瀉和嘔吐等消化道病理癥狀，貓表征發(fā)熱，眼鼻分泌物黏稠，胸腹部膨大且觸診有波動(dòng)感，呼吸困難，呈胸腹式病理性呼吸。腹瀉較為嚴(yán)重，其排泄物在肛門處黏連，心率較快，疑似病原感染伴發(fā)多臟器并發(fā)癥所致，病情較重。隨后進(jìn)行血常規(guī)、血液生化分析、電解質(zhì)、血清淀粉樣蛋白測(cè)定，腹水樣本分別送至溫州大學(xué)病毒學(xué)研究所和軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院進(jìn)行核酸檢測(cè)診斷。

1.3 臨床治療過(guò)程

為緩解癥狀，采用抽腹水、胸水、抗炎、抗感染等對(duì)癥治療方案：靜脈注射10%葡萄糖溶液(30 mL·d-1)、重組貓白蛋白注射液(長(zhǎng)春西諾，5 mL·d-1)、注射用氨芐西林鈉(60 mg·d-1)；皮下注射注射用重組貓干擾素ω(北京鐵草，75萬(wàn)IU·d-1)；肌內(nèi)注射科特壯復(fù)方布他磷注射液(拜爾，1 mL·d-1)。

根據(jù)病史調(diào)查和臨床癥狀，初步懷疑為FIPV感染，經(jīng)協(xié)商，同時(shí)進(jìn)行抗病毒治療，主人自行采購(gòu)小分子核苷類似物GS-441524，以每天2.5～4.0 mg·kg-1進(jìn)行皮下注射，持續(xù)給藥10周。

該病例的診斷與治療過(guò)程如圖1所示。

圖1 該病例的診斷及治療過(guò)程Fig.1 Schematic diagram of the diagnosis and treatment process of this case

1.4 實(shí)驗(yàn)室診斷

李凡他試驗(yàn)：玻璃試管中，加入適量體積的蒸餾水，其表面以98%的乙酸覆蓋，將抽取的腹腔液滴入試管1～2滴，若保持水滴狀緩慢沉到試管底部則為陽(yáng)性，若滴入后混和物迅速消失即為陰性。

高通量測(cè)序：取貓腹水400 μL用High Pure Viral RNA Kit(Roche Diagnostics，Germany)試劑盒提取總核酸，利用Ion Total RNA-Seq v2(Life Technologies，USA)試劑盒進(jìn)行建庫(kù)，將構(gòu)建好的文庫(kù)稀釋到終濃度為30 pmol·L-1的工作庫(kù)，加入到Ion 540 芯片，利用Ion S5 Squencing Reagents Kit(Thermo Fisher，Singapore)試劑盒，在Ion S5 plus 測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序。原始數(shù)據(jù)為3.8 Gb。經(jīng)FASTP 0.21.0[14]對(duì)原始數(shù)據(jù)篩選Q20以上的數(shù)據(jù)，該病例-Q20數(shù)據(jù)為667.1 Mb。將以上過(guò)濾后的數(shù)據(jù)用kraken2-2.0.7-beta軟件[15]與minikraken2_v2_8GB_201904_UPDATE數(shù)據(jù)庫(kù)比較進(jìn)行物種分析，本研究在軍事醫(yī)學(xué)研究院完成。

RT-PCR驗(yàn)證：將腹水離心取上清液，Trizol法提取RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)測(cè)序數(shù)據(jù)和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中FIPV的N基因保守序列(345 bp)設(shè)計(jì)引物N-F：TGGTGATAGTGATCTCGTTGCC、N-R：TCAACCTGTGTGTCATCAAACA，在25 μL反應(yīng)體系中依次加入2×TaqDNA Master 12.5 μL，引物N-F/N-R各1 μL，反轉(zhuǎn)錄cDNA 1 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃ 10 s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min，4 ℃保存。最后以1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行結(jié)果判斷。

X光影像學(xué)檢查：將貓側(cè)位置于攝影平床，根據(jù)體厚和攝影距離由儀器自動(dòng)調(diào)整kV和mAs參數(shù)。

血常規(guī)、血液生化分析、電解質(zhì)等其他實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)參考標(biāo)準(zhǔn)操作步驟進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)診斷

此病例腹水樣本首先經(jīng)李凡他試驗(yàn)檢測(cè)，證明腹水為滲出性漿液；血常規(guī)結(jié)果中，紅細(xì)胞、血紅蛋白及紅細(xì)胞壓積升高，而平均紅細(xì)胞體積、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量和淋巴細(xì)胞百分比明顯偏低，結(jié)合血清樣本在血清淀粉樣蛋白(fSAA)試紙檢測(cè)指標(biāo)高達(dá)161.4 μg·mL-1，遠(yuǎn)高于參考值5 μg·mL-1，表明該病例有脫水跡象且可能由于病原微生物感染全身呈較高的炎癥水平(表1)。

生化檢測(cè)結(jié)果顯示，總蛋白、球蛋白和谷丙轉(zhuǎn)氨酶三個(gè)指標(biāo)水平均高于參考值，其中谷丙轉(zhuǎn)氨酶比參考值的上限高出近4倍，鉀離子、二氧化碳分壓和總二氧化碳分壓指標(biāo)異常。綜合以上對(duì)腹水及血液的多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室檢查，該病例疑似是由于病原微生物感染導(dǎo)致的腹水系統(tǒng)性炎性滲出，進(jìn)而引起了多臟器代償性病理變化。

2.2 高通量測(cè)序診斷及RT-PCR驗(yàn)證

在送檢的腹水樣本中，為了減少高通量數(shù)據(jù)量帶來(lái)的成本增加，經(jīng)離心收集上清的基因組提取后，依然可獲得大量Unique Reads 信息，截取病毒門類注釋信息發(fā)現(xiàn)，包含F(xiàn)IPV(236條)、RD114逆轉(zhuǎn)錄病毒(3 490條)和多種噬菌體病毒等Unique Reads，由于內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的存在，作者通過(guò)重組拼接獲得了覆蓋度超過(guò)80%的FIPV序列，證明其存在FIPV感染(圖2)。同時(shí)，利用RT-PCR方法對(duì)FIPV N蛋白編碼基因進(jìn)行擴(kuò)增，獲得特異性目的片段，測(cè)序正確(圖2C)。

表1 首次實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果

A. 腹水中注釋為病毒相關(guān)的Unique Reads數(shù)量所占比例；B. 根據(jù)參考基因組NC_002306產(chǎn)生的FIPV拼接結(jié)果；C. FIPV N基因RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果A. Ascites annotated as the proportion of virus-related Unique Reads; B. The result of FIPV splicing based on the reference genome NC_002306; C. Specific amplification of FIPV N gene based on RT-PCR shown by agarose gel electrophoresis圖2 宏基因組分析結(jié)果Fig.2 Results of metagenomic analysis

2.3 治療過(guò)程中影像學(xué)檢查

收治首日X光影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)胸腔及腹腔內(nèi)腹水較多，胸腔和腹腔內(nèi)各器官邊緣界限模糊，已有壓迫胸腔和腹腔器官的病理跡象(圖3A)，隨即為其進(jìn)行抽胸水、腹水、補(bǔ)液等臨床治療，治療方案如“1.3”中對(duì)癥治療方案所示。在對(duì)癥治療的第7天再一次進(jìn)行X光影像學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)胸水和腹水癥狀已減輕，肋骨恢復(fù)原位，雖還有少量滲出液，但胸腔和腹腔內(nèi)部各器官形態(tài)完整且邊緣清晰(圖3B)。

A.治療第1天X光影像；B. 治療第7天X光影像A. X-ray image on the first day of treatment; B. X-ray image on the seventh day of treatment圖3 診治過(guò)程中的影像學(xué)檢查Fig.3 Imaging examination during diagnosis and treatment

2.4 血常規(guī)及生化指標(biāo)變化趨勢(shì)

為了評(píng)估藥物(GS-441524)對(duì)該病例的治療效果，通過(guò)用藥后血常規(guī)、生化、血清淀粉樣蛋白等指標(biāo)的檢測(cè)，判斷治療效果及預(yù)后狀態(tài)。

2.4.1 血常規(guī)檢測(cè)指標(biāo)變化趨勢(shì) 為了解患貓治療過(guò)程中的炎癥水平和營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，基于血常規(guī)、特定生化和fSAA的綜合檢測(cè)方法被應(yīng)用于整個(gè)病程。該病例在治療第1到7天，其體內(nèi)紅細(xì)胞、紅細(xì)胞壓積、血小板和淋巴細(xì)胞百分比等指標(biāo)一直處于不穩(wěn)定狀態(tài)，所有指標(biāo)在治療第2天均顯著降低，第7天顯著恢復(fù)，第59天的檢測(cè)中，除紅細(xì)胞和紅細(xì)胞壓積外，其余各項(xiàng)指標(biāo)均處于正常水平。

2.4.2 生化檢測(cè)指標(biāo)變化趨勢(shì) 該病例從第1天開展對(duì)癥結(jié)合抗病毒治療，到第7天時(shí)，其血清球蛋白含量明顯增高，導(dǎo)致白/球蛋白比降低，但隨著治療的深入，球蛋白含量逐漸恢復(fù)正常，白/球蛋白比恢復(fù)至0.6以上(圖4A)。谷丙轉(zhuǎn)氨酶和葡萄糖在初次檢查時(shí)均處于較高水平，經(jīng)治療這兩項(xiàng)指標(biāo)恢復(fù)正常(圖4B)。提示本研究中使用的治療方法不會(huì)對(duì)肝、腎等器官造成藥理毒性。

2.4.3 血清淀粉樣蛋白檢測(cè)指標(biāo)變化趨勢(shì) 第1天fSAA檢測(cè)為161.4 μg·mL-1，經(jīng)過(guò)7 d的對(duì)癥治療以及6 d的抗病毒治療，該病例全身炎性水平呈下降趨勢(shì)，雖然fSAA第7天檢測(cè)為20.2 μg·mL-1，仍大于參考值上限5 μg·mL-1，但表明這一階段的治療已取得成效。在后續(xù)治療過(guò)程中的第59天檢查中，此項(xiàng)指標(biāo)處于正常水平，表明此時(shí)機(jī)體炎癥水平已經(jīng)恢復(fù)正常。而在第112天復(fù)檢中，該指標(biāo)依然處于正常水平，證明此時(shí)體內(nèi)并無(wú)復(fù)發(fā)跡象。

3 討 論

貓作為重要的伴侶動(dòng)物[16]，存在多種疾病傳播風(fēng)險(xiǎn)[17-18]，可作為冠狀病毒的重要宿主之一[19]，研究表明FECV可由糞口途徑傳播，多呈無(wú)癥狀或較輕的腹瀉癥狀，但5%～12%的病例可發(fā)生突變而感染FIPV，患貓死亡率可達(dá)100%[20]，且因存在ADE現(xiàn)象尚無(wú)有效疫苗[21]。在我國(guó)獸醫(yī)臨床上，F(xiàn)IP的診斷多依賴膠體金、李凡他等臨床診斷方法綜合判斷，而病原學(xué)檢測(cè)方法僅依賴基于熒光定量PCR技術(shù)對(duì)S蛋白突變位點(diǎn)(M1030L、S1032A、M1058L和S1060A)的檢測(cè)來(lái)驗(yàn)證，但突變頻率、序列特異性差異等仍然限制了診斷的準(zhǔn)確性[8,22-23]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，基于宏基因組/轉(zhuǎn)錄組的檢測(cè)方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于病原、潛在的變異位點(diǎn)及共感染的發(fā)現(xiàn)，測(cè)序深度的加深可對(duì)病原的大部分或全序列實(shí)現(xiàn)監(jiān)控，在獸醫(yī)臨床傳染病診斷等方面存在巨大潛能，尤其對(duì)于控制貓群感染，進(jìn)而預(yù)警和抵抗人群中的冠狀病毒變異、發(fā)病具有科學(xué)指導(dǎo)意義[9-11]。本試驗(yàn)通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，以3.8G的測(cè)序數(shù)據(jù)獲得了該株病毒80%以上的序列，而且通過(guò)RT-PCR驗(yàn)證，證明了測(cè)序的真實(shí)性和有效性。

表2 治療后第1、2、7、59天血常規(guī)標(biāo)志性指標(biāo)的變化趨勢(shì)

A.總蛋白、白蛋白、球蛋白和白蛋白與球蛋白之比的變化趨勢(shì)；B. 血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性及葡萄糖含量的變化趨勢(shì)A. The trends of total protein, albumin, globulin and ratio of albumin to globulin; B. The trend of alanine aminotransferase activity and glucose content in serum圖4 治療后第1、7、59、74、112天標(biāo)志性血液生化檢測(cè)指標(biāo)變化趨勢(shì)Fig.4 The trend in blood biochemical markers on day 1, 7, 59, 74 and 112 after treatment

抗病毒小分子化合物是降低病毒滴度，控制病毒重組的有效手段，如3CL蛋白酶抑制劑(GC376)被研發(fā)并應(yīng)用于貓冠狀病毒感染治療，其可與貓冠狀病毒3CL蛋白酶催化基因結(jié)合，抑制蛋白前體裂解，阻止病毒復(fù)制[24-25]。小分子核苷類似物(GS-441524 和GS-5734)，則能夠進(jìn)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)化為天然核苷三磷酸的競(jìng)爭(zhēng)物，抑制RNA依賴RNA聚合酶活性，干擾貓傳染性腹膜炎病毒的RNA復(fù)制[26]。相較于GC376，GS-441524具有更強(qiáng)的抗病毒活性，不易產(chǎn)生耐藥性[27-28]。小分子化合物治療失敗可能存在以下三種原因：①FIPV在長(zhǎng)期的藥物治療中易產(chǎn)生耐藥性；②較低劑量(2.0 mg·kg-1)治療可伴發(fā)神經(jīng)癥狀；③高齡患病動(dòng)物對(duì)藥物作用的耐受能力有差異[28-30]。因此，本研究根據(jù)貓齡等影響因素，決定采用高劑量GS-441524連續(xù)給藥，并持續(xù)監(jiān)控白/球蛋白比、fSAA等臨床指標(biāo)，評(píng)估疾病救治效果。由于患貓病情危重，用藥后24 h血常規(guī)指標(biāo)并未見明顯好轉(zhuǎn)，但可通過(guò)進(jìn)食、飲水等狀態(tài)判斷臨床狀態(tài)。1周后，血常規(guī)、血清蛋白、fSAA檢測(cè)結(jié)果均有顯著恢復(fù)，證明藥物選擇和劑量有助于改善患貓的身體狀態(tài)；8周后，均已恢復(fù)至正常水平；繼續(xù)用藥2周，各項(xiàng)特征指標(biāo)白/球蛋白比(0.6)和fSAA(<5 μg·mL-1)仍在正常水平。停藥后6周， 各項(xiàng)特征指標(biāo)依然正常，表明經(jīng)GS-441524治療未復(fù)發(fā)。

4 結(jié) 論

利用高通量測(cè)序方法，可拼接獲得FIPV的大部分基因組序列，相較于其他檢測(cè)方法，不僅能準(zhǔn)確地診斷FIPV是導(dǎo)致貓疾病的主要病原，還能獲得大量的、較為完整的基因組信息。10周高劑量GS-441524注射可有效治療危重FIP幼貓，未見藥物副作用和疾病復(fù)發(fā)，血清白/球蛋白比(≥0.6)和fSAA(<5 μg·mL-1)兩項(xiàng)指標(biāo)具有時(shí)間一致性，可用于指示疾病變化，評(píng)估臨床治療效果。