基于線粒體基因的新疆托氏兔遺傳多樣性和種群遺傳結(jié)構(gòu)評價

米熱姑麗·麥麥提，周世玉，劉 鵬，孟 陽，聶文悅，滕培晨，單文娟

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046)

托氏兔(LepustolaiPallas，1778)又稱蒙古兔，隸屬于兔形目(Lagomorpha)兔科(Leporidae)兔屬(LepusLinnaeus, 1758)，體型較大，遷移能力強，分布范圍廣，可生活在多種環(huán)境中，在我國東北部、中部及西北部地區(qū)均有分布[1]。由于野兔種間形態(tài)、外形、頭骨和牙齒等方面差異較小，而且野兔間存在雜交現(xiàn)象，給分類工作帶來了很多困難，托氏兔曾被包括在草兔(L.capensis)或歐兔(L.europaeus)中[2]。羅澤珣[3]對比了我國“草兔”和歐兔的外形和頭骨等特征，發(fā)現(xiàn)有明顯差別，否定了我國“草兔”歸屬于歐兔的觀點。基于分子生物學(xué)[4-5]和頭骨測量數(shù)據(jù)[6]的研究不支持將我國“草兔”歸為L.capensis， 因此將新疆原“草兔”種群劃分為托氏兔和藏兔(L.tibetanus)，其中天山以北的種群為托氏兔[7]。近年來的研究顯示，托氏兔在新疆分布有兩個亞種，其中分布在新疆北部和西北部地區(qū)的野兔為西域亞種(L.tolailehmanni)，分布在新疆中部和東部地區(qū)的野兔為中亞亞種(L.tolaicentrasiaticus)[7-8]。

早期關(guān)于托氏兔分子生物學(xué)方面的報道將托氏兔誤分成草兔亞種進行研究，如Wu等[4]與Wang和Yang[5]研究了不同野兔類群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，其中包括新疆北部及中部的野兔；Liu等[9]基于4個線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)片段和核基因，首次證明了6個中國兔屬物種之間通過歷史和近期的種間雜交發(fā)生了頻繁的基因漸滲事件，其中包括分布在新疆北部的野兔；Wu等[10]發(fā)現(xiàn)，塔里木兔(L.yarkandensis)和新疆“草兔”的雜交個體中存在廣泛的雙向線粒體DNA和SRY基因漸滲；單文娟等[11]基于D-LOOP探究新疆“草兔”的種群遺傳結(jié)構(gòu)和亞種分化，結(jié)果顯示，新疆“草兔”具有較高的遺傳多樣性和明顯的系統(tǒng)地理結(jié)構(gòu)。近年來，關(guān)于新疆托氏兔的研究集中在測定線粒體基因組全長[12]、篩選DNA條形碼[13]、鑒定野兔性別[14]及年齡[15]等方面。除此之外，還有基于線粒體基因評價新疆3種野兔遺傳多樣性方面的報道[8]，該研究中包含新疆北部阿勒泰與中部達坂城和托克遜的少量托氏兔樣本，缺乏廣泛的取樣。

野兔由于繁殖能力和適應(yīng)能力強，除個別種類外，多數(shù)種類的種群數(shù)量相對較多，相關(guān)研究較少。目前，對新疆托氏兔的研究主要集中在分類現(xiàn)狀與分布，而關(guān)于分子生物學(xué)方面的研究大多是在托氏兔分類有誤時進行的，還未見較全面地評價新疆托氏兔種內(nèi)遺傳多樣性水平，探究亞種間遺傳結(jié)構(gòu)等方面的報道。遺傳多樣性及種群遺傳結(jié)構(gòu)研究是種質(zhì)資源開發(fā)與利用的一項重要內(nèi)容。野兔主要以草本植物和農(nóng)作物為食，對農(nóng)林牧業(yè)有一定的傷害，而且兔肉和皮毛具有一定的經(jīng)濟價值[16]。2009年，常衛(wèi)利和蘭文旭[17]報道，新疆阿勒泰地區(qū)托氏兔數(shù)量激增，威脅到當?shù)剞r(nóng)業(yè)生產(chǎn)工作，因此當?shù)貙嵭辛讼蘖坎东C利用托氏兔。目前，新疆托氏兔的遺傳多樣性現(xiàn)狀是未知的，因此本研究采用CO1和D-LOOP基因，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育和群體遺傳學(xué)的分析方法，評價新疆托氏兔的遺傳多樣性水平，并探究亞種間的遺傳結(jié)構(gòu)，旨在揭示新疆托氏兔的遺傳潛力和環(huán)境適應(yīng)能力，為托氏兔的保護和利用提供分子遺傳學(xué)方面的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本收集及采樣點區(qū)域劃分

本研究共收集了78個新疆托氏兔的樣本，分別采自新疆12個地區(qū)(表1)。為方便分析，根據(jù)樣本地理分布將本研究中的托氏兔樣本分為4個地理組群，分別為北部、西北部、中部以及東部組群，見表1。

表1 新疆托氏兔樣本采集信息

1.2 基因組DNA提取、PCR擴增

采用DNA組織提取試劑盒提取樣本總DNA，對提取質(zhì)量較好的DNA產(chǎn)物進行PCR擴增。本研究采用mtDNA的CO1和D-LOOP基因，CO1的PCR引物序列[13]為F：5′-AGGAACAGCCCTYAGTCT-3′，R：5′-GGTGGGCTCAAACAATAA-3′；D-LOOP區(qū)的PCR引物序列[18]為F：5′-CAGAGATGGAGATYAACTC-3′，R：5′-GCATGG-GCTGATTAGTCAT-3′， PCR引物送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成。CO1和D-LOOP基因的PCR擴增體系均為25 μL：Premix Taq(1.25 U·25 μL-1)13 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL， DNA模板1 μL，無菌去離子水9 μL。擴增條件為：95 ℃變性3～5 min；94 ℃ 變性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，25～35次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。 PCR產(chǎn)物進行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)束后通過凝膠成像系統(tǒng)成像，將擴增結(jié)果良好的PCR產(chǎn)物進行測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用DNAMAN v6.0.40和Clustalx 1.83[19]處理序列格式；將2個基因的序列用MegaX[20]分別進行多重序列比對，比對完成后將序列減齊；用Phylo-Suite 1.2.2[21]將兩個基因按照線粒體DNA上的順序拼接起來。用Mega X和DnaSP 5[22]進行序列特征分析。用Arlequin v3.5[23]計算遺傳多樣性指數(shù)(genetic diversity index)和中性檢驗參數(shù)(neutrality tests)，進行分子變異分析(analysis of molecular variance，AMOVA)，計算各種群間的遺傳分化指數(shù)(F-statistics，F(xiàn)st)，并進行錯配分布分析(Mismatch distribution)。用MegaX構(gòu)建ML樹，用PhyloSuite v1.2.2構(gòu)建貝葉斯樹。用PopART[24]軟件繪制單倍型中介網(wǎng)絡(luò)圖(median-joining network)。根據(jù)公式Nm=(1-Fst)/4Fst計算基因流大小[25]。用Beast v2.3.0[26]進行擴展貝葉斯天際線分析(Extended Bayesian Skyline Plots，EBSPs)，Prior設(shè)置為Coalescent Extended Bayesian Skyline Plot。

2 結(jié) 果

2.1 基因組DNA提取與PCR擴增

從托氏兔肌肉組織中提取基因組DNA，以此為模板擴增mtDNA的CO1和D-LOOP片段。電泳檢測得到與預(yù)期目標片段大小一致的清晰條帶(圖1)， 可用于下一步的測序。

M. DNA相對分子質(zhì)量標準；1～5. CO1和D-LOOP片段的PCR擴增產(chǎn)物M.DL1500 marker; 1-5. PCR products of CO1 and D-LOOP圖1 2個mtDNA片段的部分PCR擴增結(jié)果電泳圖Fig.1 The partial electrophoresis results of PCR amplification for 2 mtDNA fragments

2.2 新疆托氏兔mtDNA片段的序列特征

將mtDNA的CO1和D-LOOP基因序列拼接，得到總長為1 170 bp的合并序列。經(jīng)分析其中T、C、A、G堿基平均含量分別為31.6%、28.2%、26.6%、13.6%。T+A含量為58.2%、C+G含量為41.8%，T+A含量明顯大于C+G含量，存在A/T偏倚性。共計發(fā)現(xiàn)多態(tài)性位點(variable sites)192個，突變位點(mutations sites)217個，簡約信息位點(parsimony informative sites)161個，其中轉(zhuǎn)換(transition)43個、顛換(transversion)13個，插入/缺失(insertion/deletion)35個。

2.3 新疆托氏兔的遺傳多樣性

78個新疆托氏兔樣本的合并序列共定義了68種 單倍型(表2)。托氏兔4個地理組群的單倍型多樣性(haplotype diversity，h)為0.985～1.000；托氏兔4個組群中西北部組群的核苷酸多樣性(nucleotide diversity，π)最高，為0.045±0.023，中部組群的核苷酸多樣性最低，為0.029±0.015，托氏兔總的核苷酸多樣性為0.049±0.023。

2.4 新疆托氏兔的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

為探討新疆托氏兔的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，本研究以家兔(Oryctolaguscuniculus)為外群，基于CO1和D-LOOP基因合并的單倍型序列采用貝葉斯法和最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，得到兩種樹的拓撲結(jié)構(gòu)基本一致。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示(圖2)，本研究所用的托氏兔樣本被分成置信度較高的3個進化枝，其中Clade A包含多數(shù)北部和少數(shù)西北部組群的樣本；Clade B中絕大多數(shù)為中部和東部組群的樣本，來自同一個組群的樣本聚在一起；Clade C包含北部和西北部以及少數(shù)中部組群的樣本。由此可見，雖然有部分樣本混雜，但每個進化枝均包含了大多數(shù)來自相同或相鄰區(qū)域的樣本，樣本的聚類情況與分布范圍和地理距離相吻合，說明新疆托氏兔的分布具有比較明顯的系統(tǒng)地理分布格局。

表2 基于mtDNA的CO1和D-LOOP基因計算的新疆托氏兔的遺傳多樣性和中性檢驗參數(shù)

進化枝上的數(shù)字分別代表貝葉斯樹置信度和ML樹置信度Numbers on the branches represent Bayesian posterior probabilities and ML tree posterior probabilities圖2 基于mtDNA的CO1和D-LOOP基因的單倍型序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on the haplotype sequence of CO1 and D-LOOP genes of mtDNA

2.5 新疆托氏兔的遺傳結(jié)構(gòu)

進一步以68個單倍型構(gòu)建了中介網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)，其結(jié)構(gòu)與系統(tǒng)發(fā)育樹一致。中介網(wǎng)絡(luò)圖也明顯分為3個支系，其顏色標注與系統(tǒng)發(fā)育樹一致。中介網(wǎng)絡(luò)圖中，左下方的一大枝包含多數(shù)北部和部分西北部組群的樣本；右邊的大枝分為兩個小枝，分別為中部和東部組群的樣本；左上枝包含北部、西北部以及少數(shù)中部組群的樣本。中介網(wǎng)絡(luò)圖的結(jié)果也支持新疆托氏兔具有較明顯的系統(tǒng)地理分布格局，除少量樣本比較混雜，來自同域或鄰域的樣本聚在一起。同時，從中介網(wǎng)絡(luò)圖中可以看出，新疆托氏兔所有單倍型為各地理組群的特有單倍型，組群間沒有共享單倍型，地理組群內(nèi)也僅有2個相鄰的地方共享的單倍型(H22和H23，圖3未顯示，可看圖2)，說明新疆托氏兔具有很高的單倍型多樣性。

圓圈代表每個單倍型；圓的面積與單倍型頻率成正比；直線距離代表突變步數(shù)；不同顏色表示不同的地理組群The circle represents each haplotype; The area of circle is proportional to the haplotype frequency; The linear distance represents the number of mutation steps; Different colors represent different geographic groups圖3 新疆托氏兔68個單倍型的中介網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 The median-joining network of 68 haplotypes of L. tolai in Xinjiang

AMOVA分析結(jié)果顯示(表3)，將新疆托氏兔劃分為4個不同地理組群時，組群內(nèi)各種群間的變異占27.300%，且P值極顯著(P=0.000<0.01)，變異貢獻率較?。粚⑼惺贤冒凑瘴饔騺喎N和中亞亞種分組時，種群內(nèi)的變異占67.530%(P=0.000<0.01)，組群間的變異大于組群內(nèi)各種群間的變異，分別為19.400%、13.070%，且P值均極顯著；將托氏兔按照西域亞種、中部和東部組群分組時，種群內(nèi)的變異占67.560%，組群內(nèi)各種群間的變異占8.260%，且P值均極顯著。

種群間的遺傳分化指數(shù)Fst值顯示(表4)，北部組群與西北部組群間的Fst值(為0.101，P<0.05)最小，中部組群與東部組群間的Fst值(為0.279，P<0.01)次之；托氏兔西域亞種與中亞亞種間的Fst值均較大(分別為0.331、0.306、0.376、0.340)，且P值均極顯著?；蛄鹘Y(jié)果顯示(表4)，除了北部與西北部組群間的基因流較大、為2.225，其余組群間的基因流均較小。

2.6 新疆托氏兔的種群歷史動態(tài)

本研究采用中性檢驗Tajima`D、Fu`sFs、核苷酸錯配分布分析和EBSPs等方法分析新疆托氏兔的種群歷史。中性檢驗結(jié)果顯示(表2)，4個地理組群的Tajima`D和Fu`sFs的絕對值均較小(0.067～1.630)，P值均不顯著(P>0.05)，托氏兔總的Fu`sFs為-15.100(P=0.007)。核苷酸錯配分布圖呈現(xiàn)多峰(圖4A)。擴展貝葉斯天際線(EBSPs)結(jié)果顯示，在距今大約0.01 Ma(百萬年)時，新疆托氏兔群體發(fā)生了擴張(圖4B)。

表3 新疆托氏兔mtDNA單倍型分子變異等級分析(AMOVA)

表4 新疆托氏兔4個地理組群間的遺傳分化指數(shù)(對角線以下)及基因流(對角線以上)

A. 核苷酸錯配分布圖；B. 擴展貝葉斯天際線圖A. Mismatch distribution analysis of nucleotides; B. Extended Bayesian skyline plots analysis圖4 新疆托氏兔的種群歷史分析Fig.4 Population history analysis of L. tolai in Xinjiang

3 討 論

3.1 新疆托氏兔的遺傳多樣性

遺傳多樣性的高低反映了物種的進化潛力和應(yīng)對環(huán)境變化的能力，一個物種具有越高的遺傳多樣性，其應(yīng)對環(huán)境變化的能力就越強。相比于其他的野兔，如歐兔(L.europaeus)h=(0.965±0.006)、π= (0.025±0.002)[27],藏兔(L.tibetanus)h=(0.972土0.064)、π=(0.002±0.001)[8]，塔里木兔(L.yarkandensis)h=0.987[28]，本研究檢測到的新疆托氏兔遺傳多樣性水平較高(h=(0.996±0.002)、π=(0.049±0.023))。代慧英和單文娟[15]通過頭骨形態(tài)指標鑒定新疆野兔年齡，其中包括新疆北部和中部的托氏兔樣本，結(jié)果表明新疆野兔年齡結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，種群繁殖能力較強，種群數(shù)量呈穩(wěn)定增長模式；伊拉木江·托合塔洪等[29]對新疆野兔的生境分布研究顯示，對于新疆托氏兔，當前氣候條件下適宜生境分布在阿勒泰、塔城、伊寧以及哈密北部等地區(qū)，這些地區(qū)與目前新疆托氏兔的分布區(qū)域基本重合。綜上，新疆托氏兔較高的遺傳多樣性可能是由于兔屬物種長遠的歷史進化以及較大的種群數(shù)量導(dǎo)致了群體內(nèi)遺傳變異有效的保存和積累，同時較適宜的環(huán)境條件對此也做出了一定的貢獻。

3.2 新疆托氏兔的遺傳結(jié)構(gòu)

本研究基于mtDNA的CO1和D-LOOP基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)將新疆托氏兔群體分為置信度較高的3個支系，除個別樣本聚類情況較為混雜，同域或鄰近分布的野兔聚在一起，中介網(wǎng)絡(luò)圖的結(jié)果(圖3)也與此相符，說明新疆托氏兔具有較明顯的系統(tǒng)地理結(jié)構(gòu)。本研究中，Clade A和C中既包含北部組群的樣本又包含西北部組群的樣本，同時這兩個組群間的遺傳分化相對較小(Fst為0.101)，而且存在較強的基因流(2.225)。AMOVA分析也顯示(表3)，將北部組群和西北部組群分為一組時，兩個組群間的變異貢獻率很小(兩種分析方法分別為13.070%和8.260%，P值均極顯著)，說明北部組群和西北部組群間分化很小。在形態(tài)分類學(xué)中，北部和西北部組群的野兔屬于托氏兔西域亞種。新疆北部的阿勒泰地區(qū)和塔城地區(qū)與西北部的精河、溫泉及伊犁等地區(qū)相接壤，較近的地理距離以及野兔較強的遷移能力可能為北部和西北部組群間的基因流動提供了條件。

系統(tǒng)發(fā)育樹中，Clade B是來自中部和東部組群的野兔，在形態(tài)分類學(xué)上屬于托氏兔中亞亞種。Fst值和基因流分析顯示(表4)，西域亞種和中亞亞種間(北部/西北部與中部或東部)的Fst值(0.306～0.376，P<0.01)比亞種內(nèi)(北部與西北部或中部與東部)的Fst值(0.101～0.279，P<0.05)高，同樣地，亞種間的基因流比亞種內(nèi)的基因流小，說明新疆托氏兔亞種間分化程度更高、基因流更有限。AMOVA分析結(jié)果(表3)也證實了這一點，當按照兩個亞種分組時，亞種間的變異(19.400，P<0.01)大于亞種內(nèi)的變異(13.070，P<0.01)。值得注意的是，中部和東部組群的樣本在系統(tǒng)發(fā)育樹中(圖2)聚在一大枝上，然而中介網(wǎng)絡(luò)圖上(圖3)從一大枝分成兩個小枝，而且中部和東部組群間基因流較小，為0.646，F(xiàn)st值(為0.279，P<0.01)較大，說明存在很大的遺傳分化[30]。但是，當按照托氏兔西域亞種、中部和東部組群分組進行AMOVA分析時(表3)，結(jié)果顯示種群內(nèi)的變異貢獻率最大，為67.560(P<0.01)，組群間的變異不顯著。結(jié)合地理分布來看，雖然中部與哈密地區(qū)相接壤，但是達坂城和托克遜與哈密地區(qū)中間有廣闊的吐魯番盆地和哈密盆地，地理距離相對較遠，可能阻礙了中部與東部組群間的基因交流，促進了分化。

3.3 新疆托氏兔的種群歷史動態(tài)

對于種群歷史動態(tài)的推斷，常常通過中性檢驗并結(jié)合錯配分布進行分析。當中性檢驗(Tajima`D和Fu’sFs)的值為負值(P<0.05)，且錯配分布呈單峰分布時，說明所研究的群體可能在歷史上經(jīng)歷過種群擴張；而群體大小保持穩(wěn)定時，中性檢驗不顯著，錯配分布曲線則呈現(xiàn)多峰曲線分布[31]。本研究的中性檢驗結(jié)果顯示(表2)，新疆托氏兔和各組群的Tajima`D值均不顯著，并且核苷酸錯配分布呈現(xiàn)多峰(圖4A)；而本研究中新疆托氏兔的Fu`sFs為負值(-15.100)且差異極顯著。據(jù)報道，物種具有較大的Fu`sFs值、且為負值時，說明該物種在近期積累了較多變異，并且近期可能經(jīng)歷過群體擴張[32-33]。此外，EBSPs分析結(jié)果顯示新疆托氏兔在距今大約0.01 Ma(百萬年)時發(fā)生過種群擴張(圖4B)，而文獻表明中全新世(8～4 Ka)[34]時期氣候適宜、植被覆蓋增加，這些因素可能為托氏兔的擴張?zhí)峁┝擞欣麠l件[35-36]。綜合來看，本研究初步推測新疆托氏兔在距今大約0.01 Ma時經(jīng)歷過近期的種群擴張，后續(xù)應(yīng)對托氏兔的種群歷史進行全基因組層面更深入的研究。

4 結(jié) 論

綜上所述，本研究基于mtDNA的CO1和D-LOOP基因的綜合分析表明，新疆托氏兔單倍型豐富，單倍型多樣性和核苷酸多樣性均較高，具有較強的應(yīng)對環(huán)境變化的能力。新疆托氏兔的分布具有較明顯的系統(tǒng)地理分布格局，且不同組群間存在一定程度的遺傳分化和基因交流。新疆托氏兔亞種間分化較大，基因流較小，西域亞種的北部和西北部組群間存在較強的基因流和較小的遺傳分化，但中亞亞種的中部和東部組群間出現(xiàn)了較大的分化，可能是由于較遠的地理距離所致。此外，初步推測新疆托氏兔近期經(jīng)歷過種群擴張。