胎兒期與成年期蒙古馬骨骼肌肌纖維類型轉化研究

丁文淇，圖格琴，任秀娟，陶克濤，拉希瑪，賈紫潔，安塔娜，鐵木齊爾·阿爾滕齊米克，韓海格,陶娜拉，芒 來*，白東義*

(1.內蒙古農業(yè)大學動物科學學院,內蒙古自治區(qū)馬遺傳育種與繁殖重點實驗室, 農業(yè)農村部馬屬動物遺傳育種繁殖科學觀測實驗站, 內蒙古農業(yè)大學馬屬動物研究中心，呼和浩特 010018； 2.錫林郭勒盟鑲黃旗農牧和科技局，鑲黃旗 013250)

蒙古馬是世界上古老的馬品種之一，具有抗嚴寒、耐粗食、耐力強等優(yōu)良特性。在長距離比賽中，蒙古馬可以連續(xù)完成30～100 km的耐力比賽[1]。

骨骼肌作為哺乳動物最大的產能器官系統(tǒng)，為動物運動產生動力。肌纖維作為骨骼肌的基本組成單位，其性狀主要包括纖維密度、大小、類型等[2]。在動物出生以后，肌纖維的數目已經確定，其生長發(fā)育和類型組成是影響動物機體運動性能的重要因素。根據肌纖維形態(tài)特征、生理功能可以進行區(qū)分為Ⅰ型(慢收縮氧化型)、Ⅱa型(快收縮氧化型)、Ⅱb型(快收縮酵解型)和Ⅱx型肌纖維(中間型)[3]。不同類型的肌纖維形態(tài)特征、收縮性能等生理生化特性存在差異，不同肌纖維類型酶活性的不同決定了其代謝性能的差異。慢肌纖維含有較高活性的有氧代謝酶，線粒體含量高，而ATP酶活性較低，故收縮慢而持久。快肌纖維中含有較高的糖酵解酶和ATP酶，線粒體含量較少，快肌收縮快但不持久[4]。肌纖維類型并不是一成不變的，當機體受到刺激時，骨骼肌能夠激活細胞內相關的信號通路，使肌纖維特異性基因表達發(fā)生改變[5]。由于骨骼肌具有高度可塑性，從而使肌纖維類型發(fā)生改變以適應當前機體需求，不同的生長情況下也可引起不同程度的肌纖維類型的轉變[6]。肌纖維類型的轉化遵循Ⅰ型 (慢收縮氧化型)?Ⅱa型 (快收縮氧化型)?Ⅱx/d型 (中間型)?Ⅱb型 (快收縮酵解型) 的轉化路徑[7]。Sakuma等[8]發(fā)現，MyOD和Myf5主要在快肌中表達，而MyOG主要在慢肌中表達，進一步研究發(fā)現，MyOD通過與MyHCⅡb基因啟動子區(qū)域的E-box結合，激活了肌肉基因的轉錄，促進Ⅱb型肌纖維的表達[9]。MyOD也可以通過激活自身、家族成員互相結合來激活肌肉特異性基因表達[10]，還受到細胞內信號轉導通路的調節(jié)，如FGF2-2(成肌細胞生長因子-2)、TGF-β1(轉化生長/分化因子-β1)，共同來調節(jié)肌纖維的生長和轉化[11]。在肌肉中超表達MyOD能夠使慢肌轉化為快肌[12]。敲除MyOD基因后，可以使快肌轉化為慢肌[13]。Alapat等[14]研究發(fā)現，低水平的MyOG(肌細胞生成素)能自身調節(jié)，與生肌因子其他成員相互作用[15]，同時還可以調節(jié)肌肉特異蛋白如肌鈣蛋白、肌球蛋白輕鏈等促進成肌分化為快肌纖維[16]，當表達水平提升時又促進慢肌的形成[14]。類似這種肌纖維類型轉化受到多個分子和多種信號通路共同調控，肌纖維類型的這種適應性重塑過程對于機體能量穩(wěn)態(tài)、緩解疲勞、成長發(fā)育至關重要。然而這種肌纖維類型轉化的分子調節(jié)機理在蒙古馬上還不是很清楚。

為進一步研究蒙古馬肌纖維類型轉化的分子機理，本研究對年齡上存在明顯差異的蒙古馬骨骼肌纖維類型進行探索，選取快、慢肌纖維組成差異較大的4塊部位肌肉(長臂三頭肌、夾肌、背最長肌、臀中肌)進行RNA-seq，比較胎兒期和成年時期快肌和慢肌類型的轉錄組差異。

1 材料與方法

1.1 試驗動物樣品采集

本研究選取3匹年齡為5歲、體型基本一致、孕期時間差距較小的成年雌性蒙古馬，以及胎齡為4月 的3匹胎兒進行采樣。試驗馬匹來源于內蒙古農業(yè)大學飼養(yǎng)的試驗動物，其生活環(huán)境相同。從胎兒和成年馬身上采集4個具有代表性部位的肌肉組織樣本，長臂三頭肌(前肢)、夾肌(頸部)、背最長肌(背部)、臀中肌(后肢)4個部位。采集獲得的樣本一部分立即投入液氮存儲后轉移至-80 ℃冰箱保存；另一部分用4%的多聚甲醛固定24 h后經過乙醇梯度脫水至100%無水乙醇溶液，-20 ℃低溫儲存。

1.2 快、慢肌纖維免疫組化染色

本試驗采用的是免疫組化染色法，免疫組化染色法是抗原和抗體的專一性結合，通過酶等化學反應中抗體標記顯色劑顯色，對肌纖維類型的區(qū)分是根據肌纖維類型存在差異找到各類型肌纖維所對應的抗體，從而將肌纖維進行區(qū)分。

將浸泡在100%乙醇中的組織樣品進行石蠟包埋，利用切片機(Leica RM2245)對包埋的石蠟制作成組織完整、無損傷的6 μm厚度的連續(xù)組織切片，70 ℃烘30 min后，經數小時晾干，通過二甲苯脫蠟，梯度酒精回水后，進行免疫組織化學染色，試驗流程依據UltraSensitiveTM S-P超敏試劑盒說明書制定。切片經過氧化物酶阻斷溶液處理，PBS (pH 7.2～7.4) 沖洗后滴加正常非免疫動物血清，室溫孵育10 min; PBS沖洗后滴加第一抗體分別為: 1)抗 快速肌球蛋白骨骼重鏈抗體(兔, 稀釋濃度1∶200, Bioss, 中國北京)，該抗體與MHC-Ⅱ特異性反應；2)抗肌球蛋白-7抗體(兔, 稀釋濃度1∶200, Bioss, 中國北京)，該抗體與MHC-Ⅰ特異性反應。4 ℃孵育過夜，PBS沖洗后滴加第二抗體(小鼠，稀釋濃度1∶200，福州麥興)，室溫孵育10 min，PBS沖洗后滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，室溫孵育10 min；PBS沖洗后，配置新鮮的DAB染色劑，滴加在切片上，顯微鏡下觀察顯色，自來水沖洗終止染色；蘇木素復染，脫水后用中性樹膠封片徹底晾干，放置在切片盒中常溫避光保存。

經過免疫組化染色的蒙古馬4個部位的肌肉切片置于顯微成像系統(tǒng)(Axio Observer D1, ZEISS)進行數字照片檢測和測量信號，在連續(xù)切片中快、慢肌纖維均呈現出棕色陽性信號，由Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件選取出AOI (area of interest)，在通過軟件捕捉得到肌纖維總面積，棕色信號區(qū)域和白色區(qū)域相比得到快肌和慢肌在肌纖維中的占比。

1.3 骨骼肌RNA文庫的構建與測序

3匹胎兒期蒙古馬和3匹成年期蒙古馬的長臂三頭肌、夾肌、背最長肌、臀中肌肌肉樣品使用TRIzol試劑(Invitrogen, CA, USA)和動物組織RNA純化試劑盒TRK1002(LC Science, Houston, TX)提取總RNA，使用Agilent 2100生物分析儀和Agilent RNA 6000納米試劑盒(Agilent, CA, USA) 對RNA的數量和質量進行分析，然后使用mRNA-Seq樣品制備試劑盒(Illumina, San Diego, USA)生成測序文庫。文庫在Illumina Hiseq 4000平臺上測序，生成2×150 bp的配對端reads。

1.4 轉錄組表達譜數據分析

首先用cutadapt軟件對原始數據接頭序列和低質量序列進行處理，這些數據通過FastQC(http:// www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)驗證，然后將高質量reads比對到馬參考基因組(EquCab3.0)，使用Hisat2[17]進行比對，然后使用stringtie[16]得到胎兒期和成年期的基因表達譜。用DEseq2軟件[18]進行基因差異表達分析，差異顯著標準:| log2(fold change)|>1 &P<0.05。為了比較胎兒期和成年期肌纖維類型的差異基因表達譜，以胎兒期和成年期肌纖維群體作為兩組進行后續(xù)研究。使用DAVID (https://david.ncifcrf.gov/)在線軟件對差異表達基因進行GO 和KEGG富集分析。

1.5 實時熒光定量PCR驗證

使用HiScript?II qRT SuperMix for qPCR (Vazyme)從總RNA中生成cDNA。根據轉錄組測序結果篩選9個與蒙古馬肌纖維類型轉化相關的差異表達基因，利用NCBI在線引物設計功能設計特異性引物，選擇甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因為內參基因，后將設計好的引物送上海生工生物工程公司合成。然后用10對引物(表1)和SYBR?Premix Ex TaqTMII (TaKaRa)在CFX96 Real-Time PCR檢測系統(tǒng)(Bio-Rad)上進行qPCR。反應體系如表2所示，選擇GAPDH作為內參基因，采用2-△△Ct定量分析方法。熒光定量PCR反應程序：95 ℃ 預變性5 min；95 ℃變性1 min；60 ℃退火30 s； 72 ℃延伸1 min。試驗進行12個生物學重復，從而減少外界以及人為操作因素對試驗的影響。

表1 骨骼肌相關基因擴增引物序列信息

2 結 果

2.1 胎兒期和成年期蒙古馬肌纖維類型差異比較

根據免疫組化染色圖像，將纖維分為Ⅰ型(慢型)和Ⅱ型(快型)纖維。本研究共采集了6匹蒙古馬長臂三頭肌、夾肌、背最長肌、臀中肌共24個樣本(6匹*4塊肌肉)，成年期蒙古馬Ⅱ型骨骼肌纖維中，長臂三頭肌(72%)、夾肌(56.1%)、背最長肌(70.3%)如圖1A和圖1B所示、臀中肌(81.5%)。胎兒期蒙古馬Ⅱ型骨骼肌纖維中，長臂三頭肌(89.1%)、夾肌(78.8%)、背最長肌(93%)如圖1C和圖1D所示、臀中肌(94.2%)。如圖2所示，與成年馬肌纖維相比，胎兒馬肌纖維形狀不規(guī)則，肌纖維大小差別較大。胎兒期蒙古馬背最長肌、夾肌和長臂三頭肌中Ⅱ型肌纖維占比極顯著高于成年期蒙古馬(P<0.01)。

表2 熒光定量PCR反應體系

2.2 差異表達基因的表達與鑒定

在本研究中，兩個年齡階段4塊不同部位的肌肉作為一個整體被比較，區(qū)別在于兩個時期肌纖維類型存在差異。DESeq2數據分析顯示，一些基因在多重對照組中差異表達，結果表明，胎兒期和成年期肌纖維表型和肌纖維類型基因表達存在差異。通過比較胎兒期和成年期骨骼肌的差異基因表達，共鑒定出250個差異表達基因，其中胎兒時期表達上調的基因17個，成年時期表達上調的基因27個，如圖3A所示。差異表達基因分層聚類分析發(fā)現，ENO3、TNNI2等基因主要表達于胎兒期蒙古馬，ATP2A2、TNNT1等基因主要表達于成年期蒙古馬(圖3B)。

A.成年期蒙古馬背最長肌快肌纖維； B. 成年期蒙古馬背最長肌慢肌纖維； C. 胎兒期蒙古馬背最長肌快肌纖維； D. 胎兒期蒙古馬背最長肌慢肌纖維。a.快肌纖維；b.慢肌纖維A. Fast muscle fibers of longissimus dorsi in adult period; B. Slow muscle fibers of longissimus dorsi in adult period; C. Fast muscle fibers of longissimus dorsi in fetal period; D. Slow muscle fibers of longissimus dorsi in fetal period.a.Fast muscle fiber;b.Slow muscle fiber圖1 不同部位肌肉快、慢肌纖維分布Fig.1 Distribution of fast and slow muscle fibers in different parts

2.3 差異表達基因的GO富集分析

約有60%的差異表達基因被GO富集注釋，主要富集于生物途徑。如圖4所示，在生物途徑中，GO富集顯示了胎兒期和成年期主要富集在成年期蒙古馬骨骼肌收縮(GO:0003009～skeletal muscle contraction)、肌肉收縮調節(jié)(GO:0006937～regulation of muscle contraction)、ATP酶活性調節(jié)(GO:0043462～regulation of ATPase activity)，這能夠調控自身骨骼肌收縮應對外面環(huán)境和機體內部因子穩(wěn)態(tài)，為機體運動提供充足的動力。特別明顯的是有多個差異表達基因富集在快慢肌纖維類型轉化(GO:0014883～transition between fast and slow fiber)，暗示在胎兒期和成年期肌纖維類型發(fā)生過轉化。胎兒期與成年期上調差異表達基因不同，胎兒期上調明顯的差異表達基因富集在糖酵解過程(GO:0006096～glycolytic process)和肌肉收縮過程(GO:0006936～muscle contraction)，為機體提供生命活動所需要的能量。

f.胎兒期。GM. 臀中肌；LD. 背最長肌；SP. 夾??；TB. 長臂三頭肌f. Fetus period. GM. Gluteus medius; LD. Longissimus dorsi; SP. Splenius； TB: Triceps brachii圖2 蒙古馬4個部位快、慢肌占比Fig.2 The ratio of fast and slow muscle fiber in 4 parts of Mongolian horse

2.4 差異表達基因的KEGG途徑分析

為了進一步了解成年馬和胎兒馬之間的分子功能差異，本研究使用KEGG通路的功能注釋了差異表達基因。如圖5所示，在這些通路中，糖酵解和糖質新生(ecb00010:Glycolysis/Gluconeogenesis)途徑是肌纖維快速收縮的關鍵代謝途徑，該通路中基因在胎兒期占有更大比例，且胎兒期占有高比例的快肌纖維。AMPK信號通路(ecb04152:AMPK signaling pathway)是平衡細胞能量的重要調節(jié)酶，除對肌肉能量代謝起到調控作用外，AMPK還與肌纖維類型轉化密切相關。鈣信號通路(ecb04020:Calcium signaling pathway)依賴轉運途徑使肌纖維類型發(fā)生轉化。心肌細胞脾、腎上腺素能信號通路(ecb04261:Adrenergic signaling in cardiomyocytes)富集了一些與肌肉轉化相關的基因(TNNI1、TNNC1、TPM3)。

2.5 實時熒光定量PCR驗證

為了驗證差異基因的表達，胎兒期和成年期骨骼肌中，兩組間的差異基因(ATP2A2、MYOZ2、MYL1、ENO3、MYBPC1、TMOD4、TNNT1、TNNT3、TNNI2)參與了骨骼肌收縮、快速和緩慢肌纖維之間的轉換以及糖酵解代謝。RT-qPCR檢測這些mRNA的表達趨勢與mRNA-seq數據一致，驗證了轉錄組測序數據結果可信，如圖6所示。

3 討 論

本試驗研究了胎兒期和成年期蒙古馬肌纖維類型的差異，免疫組化分析發(fā)現，胎兒期Ⅱ型纖維比例顯著高于成年期蒙古馬，可能與胎兒營養(yǎng)物質豐富有關，日糧中的營養(yǎng)物質消化吸收后可參與機體能量代謝，進而影響肌肉發(fā)育和肌纖維類型轉化[19]。動物早期的生長發(fā)育是一個關鍵階段，受到了遺傳物質基礎和母源營養(yǎng)環(huán)境的共同影響，最終決定了成年期的表型[20]。動物出生后肌纖維發(fā)育肥大，還伴隨肌纖維類型轉化[21-22]。胎兒到成年時期Ⅱ型(快型)纖維向Ⅰ型(慢型)纖維轉化，一般Ⅰ型纖維對于大型哺乳動物維持其體重非常重要。成年時期蒙古馬有較高的Ⅰ型纖維比例，在不斷生長發(fā)育過程中，肌纖維類型的轉化隨著年齡的增加而不斷發(fā)生轉化，以便適應不同時期體重發(fā)生改變的蒙古馬[23]。

A.紅色代表胎兒期蒙古馬上調基因，藍色代表成年期蒙古馬上調基因，黑色代表無顯著變化基因；B.紅色代表上調基因,綠色代表下調基因,TD代表成年期蒙古馬,TX代表胎兒期蒙古馬A. Red represents the up-regulated genes in fetal Mongolian horse, blue represents up-regulated genes in adult Mongolian horses, black represents genes with no significant change； B. Red represents up-regulated genes, green represents down-regulated genes, TD represents adult Mongolian horse, TX represents fetal Mongolian horse圖3 胎兒期與成年期差異表達基因火山圖(A)及胎兒期與成年期差異基因分層聚類(B)Fig.3 Volcano map (A) and stratified clustering(B) of differentially expressed genes at fetal and adult stages

肌纖維轉化不是從一個極端 (快肌纖維) 跨越到另一個極端 (慢肌纖維)，而是在分子水平中逐級過渡轉化的, 即肌原纖維蛋白亞型的轉變[24]。為了確定和比較胎兒時期和成年時期肌纖維類型，本試驗研究了胎兒期和成年期蒙古馬具有代表性的4個 部位肌肉(整體)的轉錄組，功能富集在這兩個時期的肌肉之間出現了高度分化。GO富集結果中，在胎兒時期(含有較高的Ⅱ型纖維)中高表達的差異表達基因主要富集于糖酵解代謝相關途徑。GO富集結果還表明，Ⅰ型和Ⅱ型纖維在胎兒期和成年期肌纖維類型轉化，成年時期Ⅰ型纖維增加，部分基因(TNNT1、TNNC1、ATP2A2)主要在成年時期慢抽搐骨骼肌中表達。早期的生長階段是肌纖維類型轉化的重要階段，為了適應外界環(huán)境的要求和自身條件的需要。調控肌纖維類型的差異基因在不斷發(fā)生變化，肌纖維類型逐級過度轉化，并且這種轉化過程處于動態(tài)平衡階段[25]。

肌纖維類型間的相互轉化受到復雜的生物學通路調節(jié)。轉錄組是特定組織或細胞在某一生理條件下所表達的所有RNA，是連接蛋白質和基因的橋梁[26]。本研究通過KEGG注釋共得到20條信號通路，其中差異表達基因在Ca2+信號通路中富集。Ca2+信號通路依賴鈣調神經磷酸酶(calcineurin，CaN)和鈣調蛋白激酶(calmodulin kinase，CaMK)進行信號傳導，每一條傳導途徑被激活都能夠促進Ⅱ型纖維向Ⅰ型纖維轉化[27]。另外還有一條關于肌纖維轉化的相關通路，5′-腺苷單磷酸激活蛋白激酶(AMPK)是細胞能量的重要調節(jié)酶，不僅對肌肉能量代謝起關鍵調控作用，還能夠參與肌纖維類型轉化[28]。研究發(fā)現,AMPK激活劑阿卡地新可誘導大鼠趾長伸?、騜型肌纖維向Ⅱx型肌纖維轉化。AMPK在細胞能量代謝時由ATP產生，ATP去磷酸化形成ADP與AMP。而AMP可通過上游激酶增加AMPK磷酸化，通過磷酸酶降低AMPK去磷酸化，AMP還可以變構激活磷酸化AMPK。AMPK經磷酸化激活后會調控其下游通路 PGC-1α，增加線粒體的生物合成，增強線粒體功能，提高氧化代謝能力，從而使Ⅱ型肌纖維向Ⅰ型轉化[29]。本研究中,調控AMPK通路的基因主要表達于成年期，可能說明了成年期肌纖維受到了AMPK通路調節(jié)，證明了胎兒期到成年期快肌受到機體內部因子調控逐漸向慢肌轉化。

圖4 差異表達基因的GO功能富集分析結果Fig.4 The GO enrichment analysis results of differentially expressed genes

圖5 胎兒期和成年期差異表達基因KEGG富集分析Fig.5 The KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes in fetal and adult stages

圖6 RNA-seq和qRT-PCR驗證Fig.6 RNA-seq and qRT-PCR validation

肌纖維是動態(tài)學結構，MYDZs家族蛋白對維持Z盤結構穩(wěn)定有重要意義，已有研究結果表明，MYOZ2是肌肉組織特異性表達蛋白[30]，主要在慢肌組織和心肌中表達，可以激活多種肌肉發(fā)生相關基因，在肌纖維分化和發(fā)育上起重要作用[31]。MYOZ2基因在成年期表達水平明顯高于胎兒期，成年期慢收縮肌纖維也顯著高于胎兒期。Frey等[32]發(fā)現，MYOZ2基因敲除的小鼠中, CaN信號通路的活性顯著增強。MYOZ2可以負向調節(jié)鈣調神經磷酸酶的功能[33],將MYOZ2基因敲除后，鈣調磷酸酶活性顯著增強，激發(fā)了CaN-NFAT信號通路，啟動生成慢肌纖維機制。MYOZ2基因對CaN的活性起了抑制作用，進而調節(jié)了慢肌纖維的轉化[34]。MYOZ2基因在成年馬慢肌纖維中表達明顯，可能說明MYOZ2基因在成年期調控鈣調神經磷酸酶對肌纖維類型產生影響，導致成年期慢肌纖維增加，骨骼肌具有不同收縮程度和代謝特性，從而使肌肉能夠進行特定的運動，成年期肌纖維增多可能與長期負重勞作有關，慢肌纖維的增加能夠使馬匹基礎代謝加快，更好地利用氧氣，在長時間的運動或者勞作上使馬匹的效率得到提高。

骨骼肌是哺乳動物最大的產能器官，是機體糖代謝的重要場所[35]。肌纖維類型經過一個成熟的過程達到穩(wěn)定的分布模式[36]。近年來通過遺傳育種和營養(yǎng)調控多種手段，可以使動物肌纖維類型發(fā)生明顯轉化[37]。早期生長階段是肌纖維類型轉化的重要時期，營養(yǎng)水平是肌肉能夠發(fā)育轉化的基本保障，環(huán)境、訓練、飼養(yǎng)條件等后天因素也會使肌纖維轉化，外界因素和機體內部因子協同調控是轉化的必然結果[38]。

4 結 論

本研究分析了胎兒期和成年期蒙古馬肌纖維類型轉化情況，發(fā)現胎兒期蒙古馬快肌纖維比例顯著高于成年期蒙古馬。經過轉錄組篩選出差異表達基因44個，其中ATP2A2、MYOZ2等基因主要表達于成年期蒙古馬肌纖維，ENO3、TNNI2等基因主要表達于胎兒期蒙古馬肌纖維。鈣信號和AMPK信號通路與肌纖維類型轉化有關。